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Article de méthode

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo

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⸱

DOI :

10.3791/59175

⸱

20 octobre 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

Dans cet article

Résumé

Cette méthode fournit un moyen de coupler l'optogénétique et les capteurs de calcium génétiquement codés pour imager les niveaux cytosoliques de base de calcium et les changements dans les transitoires évoquées de calcium dans les muscles de la paroi du corps de l'organisme modèle C. elegans.

Résumé

L'organisme modèle C. elegans fournit un excellent système pour effectuer l'imagerie in vivo du calcium. Son corps transparent et sa manipulabilité génétique permettent l'expression ciblée de capteurs de calcium génétiquement codés. Ce protocole décrit l'utilisation de ces capteurs pour l'imagerie in vivo de la dynamique calcique dans les cellules ciblées, en particulier les muscles de la paroi du corps des vers. En utilisant la co-expression de la nérhodopsine presynaptique, la stimulation de la libération d'acétylcholine des neurones moteurs excitatifs peut être induite à l'aide d'impulsions de lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation musculaire et des changements reproductibles dans le calcium cytoplasmique Niveaux. Deux techniques d'immobilisation de ver sont discutées avec des niveaux variables de difficulté. La comparaison de ces techniques démontre que les deux approches préservent la physiologie de la jonction neuromusculaire et permettent la quantification reproductible des transitoires de calcium. En jumelant l'optogénétique et l'imagerie fonctionnelle du calcium, les changements dans la manipulation du calcium postsynaptique et l'homéostasie peuvent être évalués dans une variété de milieux mutants. Les données présentées valident les deux techniques d'immobilisation et examinent spécifiquement les rôles du Sarco sarco (endo)plasmique de calcium ATPase de C. elegans et du canal de potassium DE BK calcium-activé dans la régulation de calcium de muscle de corps.

Introduction

Cet article présente des méthodes pour l'imagerie in vivo de calcium des muscles de la paroi du corps de C. elegans utilisant la stimulation neuronale optogénétique. Associer un muscle exprimé génétiquement encodé indicateur de calcium (GECI) avec la lumière bleue déclenché dépolarisation neuronale et fournit un système pour observer clairement les transitoires de calcium postsynaptic évoqués. Cela évite l'utilisation de la stimulation électrique, permettant une analyse non invasive des mutants affectant la dynamique du calcium postsynaptique.

Les GECI à fluorophore unique, comme le GCaMP, utilisent une seule molécule de protéine fluorescente fusionnée au domaine M13 de la kinase de la chaîne lumineuse de myosine à son extrémité N-terminale et de la calmoduline (CaM) au terminus C. Lors de la liaison calcique, le domaine CaM, qui a une forte affinité pour le calcium, subit un changement conformationnel induisant un changement conformationnel ultérieur dans la protéine fluorescente conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence1. La fluorescence GCaMP est excitée à 488 nm, ce qui le rend impropre à être utilisé en conjonction avec la canalrhodopsine, qui a une longueur d'onde d'excitation similaire de 473 nm. Ainsi, afin de coupler les mesures de calcium avec la stimulation de canalrhodopsine, la protéine fluorescente verte de GCaMP doit être remplacée par une protéine fluorescente rouge, mRuby (RCaMP). L'utilisation du muscle exprimé RCaMP, en combinaison avec l'expression cholinergique de neurone moteur de la canalrhodopsine, permet des études à la jonction neuromusculaire de ver (NMJ) avec l'utilisation simultanée de l'optogénétique et de l'imagerie fonctionnelle dans le même animal 2.

L'utilisation de la canalrhodopsine contourne la nécessité de la stimulation électrique pour dépolariser les jonctions neuromusculaires de C. elegans, qui ne peuvent être réalisées que dans les préparations disséquées, rendant ainsi cette technique à la fois plus facile à utiliser et plus précise en ciblant des tissus spécifiques. Par exemple, channelrhodopsin a été précédemment utilisé dans C. elegans pour activer de façon réversible des neurones spécifiques, conduisant à l'activation robuste des neurones excitateurs ou inhibiteurs3,4. L'utilisation de la dépolarisation stimulée par la lumière contourne également la question des dommages neuronaux dus à la stimulation électrique directe. Ceci fournit l'occasion d'examiner les effets de beaucoup de différents protocoles de stimulation, y compris les stimulations soutenues et répétées, sur la dynamique de calcium postsynaptic4.

La nature transparente de C. elegans le rend idéal pour l'analyse fonctionnelle de l'imagerie fluorescente. Cependant, en stimulant les neurones excitatifs d'acétylcholine au NMJ, les animaux sont censés répondre avec une contraction musculaire immédiate4,rendant l'immobilisation des vers critique en visualisant les changements discrets de calcium. Traditionnellement, les agents pharmacologiques ont été utilisés pour paralyser les animaux. Un tel médicament utilisé est le lévamisole, un agoniste récepteur de l'acétolcholine cholinergique5,6,7. Puisque le lévamisole conduit à l'activation persistante d'un sous-type de récepteurs musculaires excitatifs, ce réactif est impropre à l'étude de la dynamique du calcium musculaire. L'action du lévamisole induit la dépolarisation postsynaptique, élevant le calcium cytosolique, et occluding observations suivant la stimulation presynaptic. Pour éviter l'utilisation de médicaments paralysants, nous avons examiné deux méthodes alternatives pour immobiliser C. elegans. Les animaux ont été collés vers le bas et puis disséqués ouverts pour exposer les muscles de la paroi du corps, semblable à la méthode d'électrophysiologie C. elegans NMJ8, ou nanobeads ont été utilisés pour immobiliser les animaux intacts9. Les deux procédures ont permis les mesures reproductibles du repos et ont évoqué des transitoires de calcium de muscle qui étaient facilement quantifiables.

Les méthodes dans cet article peuvent être employées pour mesurer les niveaux cytosoliques de base de calcium et les transitoires dans les cellules de muscle de corps postsynaptic dans C. elegans. Des exemples de données utilisant les deux techniques d'immobilisation différentes sont donnés. Les deux techniques tirent parti de l'optogénétique pour dépolariser les cellules musculaires sans l'utilisation de stimulation électrique. Ces exemples démontrent la faisabilité de cette méthode dans l'évaluation des mutations qui affectent la manipulation du calcium postsynaptique dans les vers et soulignent les avantages et les inconvénients des deux approches d'immobilisation.

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Protocole

1. Configuration du microscope

  1. Utilisez un microscope composé avec des capacités de fluorescence. Pour cette étude, les données ont été recueillies sur un microscope droit(Tableau des matériaux) équipé de LED pour l'excitation.
  2. Afin de visualiser correctement les changements de fluorescence dans les muscles de la paroi du corps, utilisez un objectif de grossissement élevé.
    1. Pour les préparations disséquées, utilisez un objectif d'immersion de l'eau 60x NA 1.0 (Tableau des matériaux).
    2. Pour les préparations utilisant des nanobelées, utilisez un objectif d'immersion d'huile 60x NA 1.4 (Tableau des matériaux). Ce grossissement assure une résolution suffisante des muscles sur le capteur de la caméra.
  3. Utilisez une caméra à haute sensibilité fixée au microscope pour capturer des images à un taux d'images élevé afin de suivre les changements rapides des niveaux de calcium. Pour cette étude, l'image avec un système sCMOS (Table of Materials) capable d'imagerie à monture complète à 100 Hz, car les temps d'élévation pour les signaux Ca 2peuvent être aussi rapides que des dizaines de millisecondes.
  4. Contrôlez l'acquisition de la caméra et l'excitation de la fluorescence LED avec un logiciel de micro-gestionnaire fonctionnant dans ImageJ10 selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
  5. Utilisez un plugin de plate-forme électronique open-source, qui relie un microcontrôleur externe open-source(Tableau des matériaux),pour gérer les impulsions de synchronisation externe pour contrôler l'excitation de fluorescence.
    REMARQUE : Les sorties numériques sont disponibles à partir des broches numériques 8 à 13 fournissant des bits de sortie 0 à 5. Ceux-ci peuvent être abordés comme valeurs de base 2 de 1, 10, 100, etc. Les paramètres des ports en série sont indiqués dans le tableau 1 et sont disponibles sur le site Web des microgestionnaires(tableau des matériaux). Firmware pour le conseil de microcontrôleur est également disponible sur ce site.
  6. Pour contrôler la logique de synchronisation, activez le protocole d'acquisition de microgestionnaire dans le logiciel selon les instructions du fabricant (Tableau des Matériaux).
    REMARQUE: Cela initie simultanément une durée de trame de caméra préréglé et le nombre de cadres à activer, ainsi que l'obturateur logique et préréglé AMBRE LED pour l'excitation de fluorescence. Dans ce cas, le commutateur à l'état solide LED ambre est contrôlé par microcontrôleur bit 1 sortie par la broche 9. La caméra encadre TTL (plaque arrière sur 3 connecteur) déclenche un stimulateur. Ceci fois précisément l'activation de la LED de lumière bleue pour l'activation de channelrhodopsin e à un moment fixé suivant l'activation de la séquence d'imagerie.
  7. Pour stimuler la canalrhodopsine avec la lumière bleue et enregistrer les changements DeL, utilisez deux LED. Activer la canalrhodopsine avec une LED avec une longueur d'onde d'émission maximale de 470 nm et un filtre de bandpass (455 à 490 nm) et exciter RCaMP avec une LED avec une longueur d'onde d'émission maximale de 594 nm et un filtre de bandpass (570 à 600 nm).
  8. Afin d'activer simultanément la canalrhodopsine et de capturer les changements dans les niveaux fluorescents RCaMP, co-illuminer les deux LED et transmettre la lumière à la même trajectoire optique à l'aide d'un faisceau dichroique.
  9. Contrôlez le moment de l'éclairage LED avec des interrupteurs à l'état solide(tableau des matériaux)contrôlés par des signaux TTL (temps d'allumage maximum nominal, 1 ms, temps d'arrêt de 0,3 ms : 0 à 90 % d'allumage et d'arrêt de temps de 100 euros).
  10. Régler l'intensité LED avec les alimentations linéaires à faible bruit contrôlées par courant (Tableau des matériaux).
  11. Pour assurer le moment précis de la LED de lumière bleue, activez-la directement par l'impulsion de TTL au relais à l'état solide d'un stimulateur. Programmez le protocole de stimulation de la lumière bleue dans un stimulateur (Table of Materials), qui agit comme un minuteur précis depuis le début de l'acquisition d'image à l'éclairage LED bleu. Dans cette expérience, activez la stimulation de la lumière bleue après 2 s de la capture de la fluorescence RCaMP seulement et utilisez un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue avec des intervalles interpulsede de 50 ms pour activer la canalrhodopsine.
    REMARQUE : Le délai avant les impulsions de lumière bleue, la durée des impulsions de lumière bleue, le temps entre les impulsions et le nombre d'impulsions dans le train peuvent tous être réglés à ce stade et devraient refléter les paramètres spécifiques d'intérêt expérimental.

2. C. elegans préparation d'échantillons et acquisition de données

  1. Pour stimuler optiquement les neurones presynaptiques, obtenir des animaux exprimant la nérhodopsine dans les neurones cholinergiques excitateurs, conduits avec la région de promoteur unc-17, et RCaMP exprimé dans tous les muscles de la paroi du corps conduit avec le promoteur myo-3 région2.
    REMARQUE : Seule l'utilisation d'animaux avec des transgènes intégrés et des niveaux robustes de fluorescence sont recommandées car l'expression variable dans les types de cellules correspondants peut affecter la fiabilité de l'acquisition de données.
  2. Faire un stock de travail de rétinetout-trans en diluant la poudre rétinienne (Tableau des matériaux) dans l'éthanol pour créer une concentration finale de 100 mM et stocker à -20 oC. Ce stock de travail sera stable pendant environ un an.
  3. Créer un stock d'OP50 E. coli, cultivé dans les médias LB, complété par la rétinetout-trans à partir du stock de travail fait à l'étape 2.2, à une concentration finale de 80 M. Le volume utilisé pour le stock OP50-retinal dépendra du nombre de plaques nécessaires à l'expérience.
  4. Plaques de support de croissance de nématodes de graine (NGM) avec approximativement 300 l du stock de rétine d'OP50 et permettent aux plaques de sécher pendant la nuit à la température ambiante dans l'obscurité.
  5. Grow C. elegans tend jusqu'à l'âge désiré dans l'obscurité sur les plaques NGM OP50-retinal à 20 oC. Pour cette expérience, utilisez des vers adultes.
    1. Pour l'expérience utilisant la préparation disséquée, il est extrêmement difficile d'utiliser uniquement des vers adultes gravid comme dissection sur des animaux plus jeunes et plus petits. Laissez les animaux sur les plaques OP50-retinal pendant un minimum de 3 jours pour une activation efficace de channelrhodopsine.
  6. Si vous utilisez la préparation disséquée8,11 (Figure 1A), effectuer des dissections en basse lumière.
    1. Placer les animaux dans un plat disséqué avec une base de couverture recouverte de silicone qui est rempli d'une solution extracellulaire de 1 mM Ca2 composé de 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM de glucose, 5 mM de saccharose, et 15 mM HEPES (pH 7,3 , -340 Osm).
    2. Collez les animaux à l'aide de l'adhésif liquide topique de la peau avec une coloration bleue le long du côté dorsal du ver et faites une incision latérale de cuticule le long de l'interface colle/ver utilisant des aiguilles en verre.
    3. Utilisez une pipette buccale pour dégager les viscères internes de la cavité du ver.
    4. Collez le rabat cuticule de l'animal pour exposer les muscles ventrales médiéques de la paroi du corps pour l'imagerie.
  7. Si vous utilisez la préparation des nanobilles (Figure 1B)
    1. Faire une solution d'agarose en fusion de 5 % à l'aide de ddH2O jusqu'à un volume final de 100 ml.
    2. À l'aide d'une pipette Pasteur, placez une goutte de solution d'agarose fondue sur un toboggan en verre et placez immédiatement une deuxième glissière en verre sur le dessus, perpendiculaire à la première, en utilisant une légère pression pour créer un tampon même agarose. Retirez la diapositive supérieure avant utilisation.
    3. Ajouter environ 4 l de nanobeles de polystyrène(Tableau des matériaux)au milieu du tampon d'agarose.
    4. Dans la faible lumière, choisissez 4-6 C. elegans dans la solution de nanoperles, en s'assurant que les animaux ne gisent pas les uns sur les autres, et placez soigneusement une feuille de couverture sur le dessus.
  8. Placez la lame ou le plat de dissection préparé sur le microscope, et trouvez et concentrez-vous sur un ver en utilisant le grossissement 10x et l'éclairage lumineux de champ.
  9. Passez à l'agrandissement 60x et à l'excitation de fluorescence de RCaMP pour identifier un muscle ventromedial de paroi de corps qui est antérieur à la vulve et dans le plan focal correct.
    REMARQUE : Les muscles antérieurs à la vulve sont sélectionnés car ils reflètent les muscles généralement stimulés dans les expériences d'électrophysiologie.
  10. Changer la voie d'image de l'oculaire à la caméra en tirant le basculement et en cliquant en direct dans le logiciel d'acquisition de données ( Tableaudes matériaux).
    REMARQUE : Assurez-vous que la voie de stimulation de la lumière bleue est désactivée à ce stade pour vous assurer que la canalrhodopsine ne s'active pas avant de capturer des images.
  11. Concentrez l'image dans le logiciel d'acquisition de données à l'aide de la mise au point fine microscope.
  12. Une fois que le muscle est clairement au point, éteignez l'image en direct en décochant le bouton Live.
  13. Cliquez sur le bouton ROI dans le logiciel d'acquisition de données et créez une boîte autour du muscle concentré sur.
  14. Sur le stimulateur, allumez la voie de stimulation de la lumière bleue qui a été programmée à l'étape 1.10.
  15. Cliquez sur Acquérir dans le logiciel d'imagerie pour capturer l'image à travers la caméra CMOS. Pour ce faire, régler le temps d'exposition à 10 s avec 1000 images et 2x binning.

3. Analyse des données

  1. Ouvrez le fichier de données dans le logiciel d'imagerie (Table of Materials) et, à l'aide de l'outil Polygone, décrire le muscle d'intérêt. C'est le retour sur investissement.
  2. Aller à l'image (fr) Piles ( Tracer le profil de l'axe Z et exporter les points de données qui en résultent dans le logiciel de tableur (Tableau des matériaux). Cette fonction trace la valeur moyenne de sélection de retour sur investissement par rapport au point de temps.
  3. Déplacez le retour sur investissement musculaire créé avec l'outil Polygon à l'extérieur de l'animal pour obtenir une mesure de fluorescence de fond en utilisant les étapes décrites dans 3.2. Exportez les données résultantes dans le cahier de calcul.
  4. Dans le cahier de calcul, soustrayez les valeurs de fluorescence de fond des valeurs de fluorescence musculaire à chaque moment. Cela fournit l'arrière-plan soustrait le signal fluorescent.
  5. Moyenne de l'arrière-plan soustrait la fluorescence pour les 2 premiers s de points de données. Cela donnera la mesure de base de fluorescence, F.
  6. Utilisez la mesure de base de la fluorescence pour calculer le niveau de fluorescence normalisé à chaque moment. Pour ce faire, utilisez l'équation (F/F) 1. Le F représente (F(t)-F), où F(t) est la mesure de fluorescence à un moment donné et F est la valeur de base. Le numéro 1 est ajouté sous forme de décalage de l'axe y.
  7. Répétez les étapes 3.2-3.6 pour chaque image musculaire qui est recueillie. L'utilisation de cellules musculaires simples ou multiples par image est à la discrétion du chercheur. Le n de l'expérience peut être déterminé en effectuant une analyse de puissance.
  8. Utilisez les données traitées des étapes 3.2-3.6 pour faire une trace des valeurs fluorescentes dans le logiciel de graphique selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
  9. À partir de cette trace, mesurez la cinétique du calcium transitoire, comme l'élévation à l'heure de pointe et le temps de désintégration demi, en utilisant les outils fournis dans le logiciel de graphique selon les instructions du fabricant.

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Résultats

Cette technique a évalué les changements chez les mutants qui auraient une incidence sur la manipulation du calcium ou la dépolarisation musculaire. Les niveaux de fluorescence de ligne de base et les transitoires fluorescents ont été visualisés et les cinétiques cytosoliques de calcium et de calcium de repos dans le muscle ont été évaluées. Il est important que les animaux aient été cultivés sur la rétine tout-trans pendant au moins trois jours pour assurer l'incorporation réussie de la ...

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Discussion

Les GECI sont un outil puissant en neurobiologie de C. elegans. Des travaux antérieurs ont utilisé des techniques d'imagerie calcique pour examiner une grande variété de fonctions dans les neurones et les cellules musculaires, y compris les réponses sensorielles et comportementales, avec des méthodes variées de stimulation. Certaines études ont utilisé des stimuli chimiques pour déclencher les transitoires de calcium dans les neurones sensoriels ASH22,23...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Alexander Gottschalk pour ZX1659, le RCaMP et la channelrhodopsine contenant la souche de ver, le Dr Hongkyun Kim pour la souche de ver slo-1(eg142), et le National Bioresource Project pour la souche de ver sca-1(tm5339).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
all-trans rétinienSigma-AldrichR2500Nécessaire pour l’excitation du canal rhodopsine
Éclairage LEDambré RCaMP
Arduino UNOMouser782-A000066Contrôle l’éclairage par fluorescence
LEDbleuéclairage rhodopsin
Microscope BX51WI OlympusMicroscope composé à état fixe
Alimentation linéaire à faible bruit contrôlée par courantAmetekSorensonControls Intensité des LED
Igor ProWavemetricsWavemetrics.comLogiciel de graphisme
ImageJNIHimagej.nih.govLogiciel de traitement
d’images LUMFLN 60x water NA 1.4OlympusObjectif d’immersion dans l’eau pour préparation disséquée
Stimulateur Master-8A.M.P.IMinuterie maîtresse pour l’acquisition d’images et l’éclairage LED
Micro-Managermicro-manager.orgCommandes acquisition de caméra et excitation LED
Microsoft ExcelMicrosoftTabsheet logiciel
pco.edge 4.2 Caméra CMOSpco.4.2Caméra haute vitesse
PlanApo N 60x huile NA 1.4OlympusObjectif à immersion dans l’huile pour la préparation de nanobilles
Microsphères de polybillesPolysciences, Inc.00876-15Pour l’immobilisation à vis sans fin
Interrupteurs à semi-conducteursSensata TechnologiesCrydom CMX100D6Contrôle la synchronisation de l’éclairage LED
Déformation transgénique, sca-1(tm5339) ; [zxIs6{Punc17 ::chop-2
(h134R) ::yfp,lin-15(+)} ;
Pmyo3 ::RCaMP35]Richmond		LabSY1627Canal neuronal excitateurrhodopsine et muscle de la paroi corporelle RCaMP exprimant une lignée de vers avec l’allèle mutant SERCA
Souche transgénique, slo-1 (eg142) ; [zxIs6{Punc17 ::chop-2
(h134R) ::yfp,lin-15(+)} ;
Pmyo3 ::RCaMP35]		Richmond LabCanal neuronal excitateurrhodopsine et muscle de la paroi corporelle RCaMP exprimant une lignée de vers avec allèle mutant du canal potassique BK activé par le calcium Souche
transgénique, [zxIs6{Punc17 ::chop-2
(h134R) ::yfp,lin-15(+)} ;
Pmyo3 ::RCaMP35]		Gottschalk LabZX1659Canal neuronal excitateurrhodopsine et muscle de la paroi corporelle RCaMP exprimant la ligne de ver
Canal

Références

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