Surexprimant ARN Long non codantes en utilisant activation génique CRISPR

Résumé

Techniques traditionnelles axées sur l’ARNC surexpression ont une portée limitée pour la surexpression de l’ARN long non codantes en raison de leurs multiples formes d’épissure avec fonctionnalité potentielle. Cette étude rapporte un protocole utilisant la technologie CRISPR pour surexprimer multiples variants d’épissage d’un ARN long non codant.

Résumé

Longtemps non codante biologie des ARN (lncRNA) est un domaine nouveau et passionnant de recherche, avec le nombre de publications de ce domaine en croissance exponentielle depuis 2007. Ces études ont confirmé que les lncRNAs soient modifiées dans presque toutes les maladies. Toutefois, il reste difficile en raison du manque de produits protéiques, expression tissu-spécifique, les niveaux d’expression faible complexité sous formes d’épissage et de la conservation des espèces d’étudier les rôles fonctionnels pour lncRNAs dans le contexte de la maladie. Compte tenu de l’expression spécifique à l’espèce, lncRNA études se limitent souvent aux contextes de recherche humaine lorsque l'on étudie les processus morbides. Étant donné que lncRNAs fonctionne au niveau moléculaire, disséquer la biologie lncRNA consiste à enlever la lncRNA ou surexpriment les effets cellulaires lncRNA et mesure. Dans cet article, un protocole écrit et visualisé de surexprimer lncRNAs in vitro est présenté. Comme une expérience représentative, une lncRNA associée à la maladie intestinale inflammatoire, l’interféron Gamma antisens 1 (IFNG-AS1), s’est avéré être surexprimé dans un modèle de cellules T Jurkat. Pour ce faire, la technique activateur de régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster est utilisée pour permettre à la surexpression dans les locus génomiques endogènes. La technique CRISPR activation vise un ensemble de facteurs de transcription sur le site de début de transcription d’un gène, qui permet une surexpression robuste de multiples formes d’épissure de lncRNA. Cette procédure va être décomposée en trois étapes, à savoir (i) guide RNA (gRNA) conception et vector construction, génération de virus (ii) et transduction et criblage de colonie (iii) pour la surexpression. Pour cette expérience représentative, a plus de 20 fois amélioration dans IFNG-AS1 dans les cellules T Jurkat a été observée.

Introduction

Alors que la recherche biomédicale plus a porté sur transcrits codant pour des protéines, la majorité des gènes transcrits se compose en réalité d’ARN non codants (Ensembl release 93). La recherche actuelle commence à explorer ce domaine, avec le nombre de publications sur lncRNAs dans le processus de la maladie augmente de façon exponentielle entre 2007 et 2017¹. Ces publications démontrent que de nombreux lncRNAs sont associés aux maladies. Cependant, les mécanismes moléculaires de ces lncRNAs sont difficiles à étudier en raison de leurs fonctions diverses de mRNA. Le problème de la compréhension du rôle de lncRNAs dans la maladie de mélange,....

Protocole

Remarque : Il est important de noter que ce protocole utilise des lentivirus réplication déficient. Effectuer la manipulation virale qu’après la formation de sécurité de laboratoire appropriées. Eau de Javel tous les éléments et les surfaces qui entrent en contact avec des virus vivants pendant au moins 10 min après l’avoir manipulé. Utiliser une laboratoire jetables manteau et visage/lunettes de protection, ainsi que des gants doubles, à tout moment. Virus tâches en biosécurité niveau 2 + labs avec certification virale. Dédie hottes de culture de tissus et d’incubateurs à travail virale.

1. conception

Résultats

Un système de double vecteur de surexprimer le lncRNA IFNG-AS1
L’expérience de l’exemple dans ce manuscrit est la surexpression d’un système de modèle de cellules T Jurkat exprimant le lncRNA AS1-IFNG⁹. IFNG-AS1 est un lncRNA associé à la maladie intestinale inflammatoire, qui a été vu à réglementer l’interféron Gamma¹⁰. Le gène IFNG-AS1 contient trois variants d’épissage qui utilisent le même site d’initiation transcript.......

Discussion

Ce manuscrit présente un protocole permettant d’utiliser l’activation CRISPR pour surexprimer lncRNAs in vitro. Il s’agit d’une technique particulièrement importante lorsque l'on étudie les ARN long non codantes puisque le produit de transcriptomique est l’unité fonctionnelle. Après surexpression, le chercheur peut, ensuite, utiliser ces cellules pour augmenter le rapport signal-bruit lorsque l'on étudie les partenaires de liaison et même de mesurer les conséquences cellulaires d’augmentation du lncRNAs. En outre, comme .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
kit de synthèse d’ADNc (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 amorce avant	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA  ;
dCas9 amorce inverse	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
vecteur dCas9	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
plasmide d’ARNg	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cellules	ATCC	’sp ; CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 amorce directe	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT  ;
HPRT1 amorce inverse	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycine B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cellules	ATCC	; Clone TIB-152	E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB gélose	Fisher Scientific	BP1425-500
LB bouillon	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Kit de purification de plasmide)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich
Optimem I sérum médium réduit  ;	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Pénicilline et streptomycine	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene   ;	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene  ;	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Dichlorhydrate de puromycine	Sigma Aldrich	P8833
Kit de purification d’ARN (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Butyrate de sodium	Sigma Aldrich	B5887
SYBR vert (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100