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Récupération de fluorescence après Photoblanchiment du jaune Fluorescent Protein tag p62 en Structures induites ressemblant à Aggresome

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DOI :

10.3791/59288

⸱

26 mars 2019

 ,  , 
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole complet et pratique pour la récupération de fluorescence après que Photoblanchiment expérimente vivre les cellules. Bien que le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des jaune fluorescent protein-tag p62 en structures induites en aggresome, il peut être appliqué à une variété de systèmes de microscopie et de protéines fluorescentes.

Résumé

Récupération de fluorescence après Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la mobilité des protéines dans des cellules vivantes. Dans une expérience typique de FRAP, fluorescence en état stationnaire est observé par imagerie répété avec la lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Informations sur la mobilité des protéines sont obtenues en contrôlant la récupération de la fluorescence. FRAP nous permettant de déterminer la mobilité des p62 dans aggresome-comme des structures induites (ALIS) dans les macrophages murins après stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS). Parce que de nombreux protocoles existants de FRAP sont incomplets ou complexes, notre objectif était de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Nous décrivons ici la transfection de macrophage RAW264.7 avec la protéine fluorescente jaune-p62 (YFP-p62), induction d’ALIS en exposant les cellules à LPS et une méthode étape par étape pour rassembler les prebleach et postbleach FRAP, analyse des images et des données. Finalement, nous discutons des facteurs importants à considérer lorsqu’il procède à une expérimentation de PAF.

Introduction

Récupération de fluorescence après que Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la dynamique des protéines en direct des cellules1,2. La popularité du PAF a augmenté en raison de la disponibilité commerciale de microscopes confocaux à haute résolution, vitesse et sensibilité à balayage laser, et un « arc-en-ciel » de codé génétiquement des protéines fluorescentes, comme le vert fluorescent protéine (GFP) et protéine fluorescente jaune (YFP)3. Génétiquement codés protéines fluorescentes sont fondues à une protéine d’intérêt afin de permettre la localisation intracellulaire de la protéine d’intérêt. Dans une expérience typique du PAF, la fluorescence en état stationnaire dans une région d’acquisition d’intérêt (ROI) dans une cellule est observée par imagerie répété de ce ROI avec lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées chez un sous-ensemble prédéfini de l’acquisition de retour sur investissement, ci-après dénommé l’eau de Javel ROI, par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Comme les nouvelles protéines écrus reconstituer les protéines blanchies au fil du temps, la vitesse et l’intensité de la reprise de fluorescence de l’eau de Javel ROI fournit des informations sur la protéine mobilité (Figure 1)4.

Notre intérêt dans la détermination de la mobilité de l’ubiquitine liaison protéine p62 (également connu sous le nom de sequestosome-1) en structures induites semblables à aggresome (ALIS) dans les macrophages murins RAW264.7 après que stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS) nous a conduit à revoir du PAF littérature. Malheureusement, bon nombre des protocoles existants FRAP sont incomplètes ou excessivement complexe5,6,7,8,9. Certains ne fournissent pas d’informations détaillées sur les paramètres laser et configuration de chemins faisceau image acquisition paramètres5,6,7,8,9. D’autres omis des détails clés au sujet de l’analyse des données, telles que d’aborder la question de l’eau de Javel ROI dérive6,9 ou comment calculer les paramètres de récupération importante, y compris la fraction mobile (Mf), la fraction immobile (J’aif) et de temps de récupération (t½)5,7. À l’inverse, d’autres mettait trop l’accent sur des formules mathématiques complexes permettant de calculer Mf, j’aifet t1/25,6,8,9. Ainsi, notre but est de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes.

Protocole

1. RAW264.7 Macrophage Transfection

  1. La culture de 100 000 cellules RAW264.7 (Table des matières) dans le milieu de culture complet (support de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)) (Table des matières) contenant 4,5 g/L de glucose additionné de sérum de veau fœtal de 10 % (Table des matières ) et la pénicilline/streptomycine (Table des matières) sur non traitée mets 35 mm fond en verre (Table des matières) et placer les capsules dans une étuve à2 °C/5% CO 37. Le lendemain, transfecter les cellules à l’aide de 1 mg/mL polyéthylènimine (PEI) (Table des matières).
  2. Mélanger 1,5 μg de YFP-p62 avec 8 μL de PEI 166 μL de sérum-free DMEM (base milieu sans sérum de veau fœtal et la pénicilline/streptomycine).
  3. Laisser le mélange complexe de transfection à température ambiante pendant 15 minutes avant d’ajouter le mélange dans chaque boîte.
  4. Ajouter les complexes au milieu existant avec les cellules et rock la plaque doucement.
  5. Place la plaque dans une étuve de2 des CO 5 % 37 ° C pendant la nuit.
  6. Le lendemain matin, aspirer le milieu de la plaque, puis rincez une fois avec milieu complet. Ajouter 2 mL de milieu complet à la plaque et laisser les cellules récupérer jusqu’au lendemain.

2. induction d’ALIS avec le Lipopolysaccharide (LPS)

  1. Le lendemain, aspirer le milieu des plaques, puis ajouter 1 mL de complet moyen contenant 10 ng/mL LPS (Table des matières). Laisser les plaques à incuber pendant 5 heures dans une étuve à2 °C/5% CO 37.
  2. Après le traitement de LPS, aspirer le milieu, puis ajouter 1 mL de tampon de Tyrode froide et stérile contenant 145 mM NaCl, KCl 5 mM, 10 mM de glucose, 1,5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2et 10 mM HEPES (pH 7,4) pour rincer la plaque.
  3. Aspirer la mémoire tampon, puis ajouter 1 mL de tampon de Tyrode froide et stérile additionné de 10 μg/mL nocodazole (Table des matières). Laisser les plaques à incuber à 4 ° C pendant 15-20 min avant le PAF d’imagerie et d’analyse.
    Remarque : L’utilisation du tampon de Tyrode contenant HEPES comme la mise en mémoire tampon composé permet l’imagerie qui s’effectue à température ambiante. Nocodazole a été utilisé pour diminuer le mouvement ALIS par des microtubules. Milieu de culture contient le bicarbonate comme un tampon composé nécessitant de CO2 à tampon. Sinon, le bicarbonate contenus dans pH moyen de changements en l’absence de CO2.

3. mise en place de la microscopie confocale et en sélectionnant la région d’intérêt

  1. Sélection et Configuration de chemins de faisceau laser
    1. Utilisez n’importe quel microscope confocal adapté (Table des matières) équipé du logiciel AIM ou ZEN (Table des matières) ou n’importe quel logiciel d’imagerie appropriée.
    2. Sélectionnez la ligne de 514 nm du laser Argon/2, comme YFP a excitation de pic à 512 emission nm et le pic à 527 nm. Cliquez sur le bouton acquérir , puis cliquez sur le bouton de Laser . Dans la fenêtre de contrôle Laser, cliquez Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, puis cliquez sur le bouton de veille . Après avoir attendu environ 3 min pour le laser pour se réchauffer, cliquez sur le bouton (Figure 2A) .
    3. Régler la puissance de laser de la gamme de laser Argon/2 nm 514 à 100 % (8,6 A). Cliquez sur le bouton acquérir , puis cliquez sur le bouton de Laser . Dans la fenêtre de contrôle Laser, entrez 100 dans le champ de résultat [%] , puis appuyez sur la touche Enter (Figure 2A).
    4. Définir la transmission de la ligne de laser Argon/2 nm 514 à 5 %. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton chaînes . Dans la fenêtre de Scan Control , cliquez sur le bouton de chaînes , puis cliquez sur la boîte carrée blanche à gauche du texte 514 nm dans la colonne de la ligne active pour activer la ligne de laser 514 nm. Entrez 5 dans le domaine de la Transmission [%] pour la raie laser de 514 nm (Figure 2D).
    5. Régler le diviseur de faisceau dichroïque primaire (Teiler Haupt Farb (HFT)) sur la position de HFT 458/514/561 telle que ces bandes sont déviés à l’échantillon pour l’excitation. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Config . Dans la fenêtre de Contrôle de la Configuration , cliquez sur le bouton Mode canal , puis sur le bouton Voie unique . Cliquez sur le bouton HFT , puis sélectionnez HFT 458/514/561 dans le menu déroulant (Figure 2B).
    6. Réglez le premier séparateur de faisceau dichroïque secondaire (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) sur la position du miroir , qui va détourner 100 % de la lumière pour le second séparateur de faisceau dichroïque secondaire (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Config . Dans la fenêtre de Contrôle de la Configuration , cliquez sur le bouton Mode canal , puis sur le bouton Voie unique . Cliquez sur le bouton NFT1 , puis sélectionnez le miroir dans le menu déroulant (Figure 2B).
    7. Mettez le deuxième séparateur de faisceau dichroïque secondaire (NFT2) sur la position de NFT 515 pour assurer cette longueur d’onde < 515 nm se reflétera et longueurs d’onde > 515 nm sera transmise. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Config . Dans la fenêtre de Contrôle de la Configuration , cliquez sur le bouton Mode canal , puis sur le bouton Voie unique . Cliquez sur le bouton NFT2 , puis sélectionnez NFT 515 dans le menu déroulant (Figure 2B).
    8. La valeur du filtre d’émission longue passe (LP) (EF) LP 530, afin que longueurs d’onde > 530 nm n’est transmise à la tube photomultiplicateur (PMT, détecteur). Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Config . Dans la fenêtre de Contrôle de la Configuration , cliquez sur le bouton Mode canal , puis sur le bouton Voie unique . Cliquez sur le bouton d’émission filtre , puis sélectionnez LP 530 dans le menu déroulant (Figure 2B).
    9. Sélectionnez le canal 3. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Config . Dans la fenêtre de Contrôle de la Configuration , cliquez sur le bouton Mode canal , puis sur le bouton Voie unique . Cliquez sur la boîte carrée blanche à gauche du bouton Ch3 .
  2. Set-up image Acquisition
    1. Sélectionnez le Plan-Apochromat 63 x / 1,40 oil objectif (Table des matières). Découvre le spécimen dans l’oculaire du microscope et placer l’ALIS au centre du champ de vision. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Micro . Dans la fenêtre de Contrôle de Microscope , cliquez sur objectifs, puis sélectionnez le Plan-Apochromat x 63 / 1,40 oil objectif dans le menu déroulant.
    2. Définir la taille de l’image de 512 x 512 pixels, la vitesse de balayage à 8et la profondeur des données à 12 bits. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton numériser . Dans la fenêtre de Scan Control , cliquez sur le bouton Mode et le bouton de l’image , puis cliquez sur le bouton de 512 . Entrée 8 dans le champ de Vitesse de balayage , appuyez sur entrée, puis cliquez sur le bouton 12 bits (Figure 2C).
    3. La moyenne de scan la valeur 1 et le zoom optique 3. Cliquez sur le bouton acquérir , puis cliquez sur le bouton numériser . Dans la fenêtre de Scan Control , cliquez sur le bouton flèche bas du champ numéro moyen scan, puis sélectionnez 1 dans le menu déroulant. Entrez la valeur 3 dans le domaine de l’optique zoom, puis appuyez sur Enter (Figure 2C).
    4. Le trou d’épingle la valeur gain 1,95 unités aérées et détecteur à 582 (juste en dessous de saturation). Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton numériser . Dans la fenêtre de Scan Control , cliquez sur le bouton de chaînes , entrez 196 dans le champ de trou d’épingle, puis appuyez sur entrée. Entrez 582 dans le champ Gain de détecteur, puis appuyez sur Enter (Figure 2D).
    5. Veiller à ce que la gamme de laser Argon/2 nm 514 est définie sur 100 % de puissance (8,6 A). Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Laser . Dans le menu de Contrôle Laser , la valeur dans le champ de sortie [%] doit être de 100 (Figure 2A).
    6. Assurez-vous que la ligne de laser Argon/2 nm 514 est défini sur 5 % de transmission. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton numériser . Dans la fenêtre de Scan Control , la valeur dans le champ de Transmission [%] de la ligne de laser 514 nm doit être 5 (Figure 2D).
    7. Créer un carrée ROI (retour sur investissement acquisition) qui a les dimensions 150 x 150 pixels (194,6 µm2). Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Éditer ROI . Dans le menu Edit de ROI , cliquez sur l’icône du rectangle, puis cliquez et faites glisser dans la fenêtre d’image pour créer un carré qui a les dimensions 150 x 150 pixels (194,6 µm2) (Figure 1A).
      Remarque : L’acquisition de ROI comprend un ALIS d’intérêt, (b) une zone de fluorescence qui n’est pas un ALIS (contrôle ROI) et est au moins 20 x 20 pixels (3,3 µm2) et (c) une zone peu ou aucune fluorescence (fond ROI) qui est au moins 20 x 20 pixels (3,3 µm 2) (figure 1A). Il est important d’inclure un contrôle du retour sur investissement dans l’acquisition de ROI afin que le Photoblanchiment qui peut-être survenir avec l’imagerie répété peut être contrôlé. L’acquisition de ROI celui défini ici sera le seul domaine qui est analysé. Répétées laser numérisation dans une acquisition ROI seulement restreindra Photoblanchiment au ROI plutôt que, par exemple, le Photoblanchiment toute la cellule ou plusieurs cellules, et le nombre de pixels prélevés à la PMT (détecteur) sera supérieur au nombre de pixels prélevés à la PMT (détecteur) après avoir numérisé une cellule entière ou plusieurs cellules.
    8. Set-up les séries temporelles telles que l’acquisition de ROI est analysée 35 fois, une fois toutes les 30 s. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton de Séries chronologiques . Dans la fenêtre de Commande de série de temps , cliquez sur le bouton de démarrage manuel série et le bouton manuel arrêter la série . Renseignez le champ arrêt manuel de la série de 35 , appuyez sur la touche entrée , puis cliquez sur le bouton de délai de cycle sec 30,0 (Figure 2E).
    9. Définissez le contrôle de l’eau de Javel telle que le Photoblanchiment interviendra après scan numéro 5, pour recueillir 5 images prebleach de l’acquisition de ROI. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Edit d’eau de Javel . Dans la fenêtre de Contrôle de l’eau de Javel , cliquez sur le carré blanc à côté de l' eau de Javel après analyses numéros. Entrez 5 dans le champ numéro de scan, puis appuyez sur la touche entrée (Figure 2F).
      Remarque : Images prebleach et postbleach doivent être acquises à la même profondeur optique.
    10. Créer un agent de blanchiment en forme de cercle ROI au sein de l’ALIS qui a un diamètre de 10 pixels (zone = 0,8 µm2). Cliquez acquérir | Modifier l’eau de Javel | Définir des zones. Dans la fenêtre de l’Eau de Javel des régions , cliquez sur l’icône de cercle . Cliquez et faites glisser dans la fenêtre d’image pour créer un cercle qui a un diamètre de 10 pixels (zone = 0,8 µm2) (Figure 2F).
    11. Définir les itérations à 300. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Edit d’eau de Javel . Dans la fenêtre de Contrôle de l’eau de Javel , entrez 300 dans le domaine d’itérations, puis appuyez sur la touche entrée (Figure 2F).
    12. Définissez la ligne 514 nm laser Argon/2 à 100 % de puissance (8,6 A) et la transmission de 100 % au cours de l’eau de Javel. Cliquez sur le bouton acquérir , puis sur le bouton Edit d’eau de Javel . Dans la fenêtre de Contrôle de l’eau de Javel , cliquez sur le carré blanc à gauche de 514 nm. Entrez 100 dans le domaine de la Transmission [%] de la ligne de laser 514 nm, puis appuyez sur la touche Enter (Figure 2F).
      Remarque : Le nombre d’itérations doit être déterminée empiriquement. Elle variera selon le fluorophore, la taille de la structure qui va être blanchie et le laser.
  3. Collecte de données
    1. Lancer le test de PAF. Collecter les 5 premières images prebleach et la première image de postbleach, puis calculer la profondeur d’eau de Javel selon l’équation suivante.
      figure-protocol-1
      Si la profondeur de l’eau de Javel est < 90, arrêter l’expérience et jetez les données, car la profondeur de l’eau de Javel ne suffisait pas. Lorsque la profondeur de l’eau de Javel est ≥ 90, recueillir des données pour l’analyse avec une programme et un programme de tableur (Table des matières) de traitement d’image.
      Remarque : La dérive de l’ALIS est ≥ 3 µm, arrêter l’expérience et jeter les données, que ce montant de dérive de l’image ne peut être corrigé pour analyse avec le logiciel de traitement d’image (Table des matières). Quelle est la dérive de l’ALIS < 3 µm, recueillir les données pour l’analyse des données avec une programme et un programme de tableur (Table des matières) de traitement d’image.
    2. Collecter les données de la PAF de 10 ALIS de 10 cellules avec moins de 3 µm de dérive de l’ALIS. Ensuite, transférer les fichiers de .lsm but à un ordinateur personnel pour l’analyse des données.
  4. Analyse des données dans un programme de traitement d’Image
    1. Bonne image dérive en alignant ou correspondantes (c.-à-d. inscription) la pile d’images chronologiques de l’acquisition de ROI. Pour ce faire, ouvrez chaque fichier .lsm de but avec un programme de traitement de l’image (Table des matières), puis sélectionnez Plugins | Inscription | StackReg | Traduction. Ensuite, sélectionnez Plugins | Inscription | StackReg | Corps rigide10.
    2. Configuration Manager de ROI pour mesurer l’intensité du signal dans l’eau de Javel ROI. Sélectionnez analyse | Outils | Gestionnaire de ROI. Sélectionnez l’outil ovale , puis tracez un cercle dans l’eau de Javel ROI avec un diamètre de 10 pixels, puis cliquez sur le bouton ajouter .
    3. Configuration Manager de ROI pour mesurer l’intensité du signal dans le contrôle ROI. Dans le gestionnaire de ROI, sélectionnez l’outil Rectangle , puis dessinez un carré de 20 x 20 pixels dans la région ROI de contrôle, puis cliquez sur le bouton ajouter .
    4. Set-up Manager de ROI pour mesurer l’intensité du signal dans le fond ROI. Dans le gestionnaire de ROI, sélectionnez l’outil Rectangle , dessinez un carré de 20 x 20 pixels dans la région ROI d’arrière-plan, puis cliquez sur le bouton ajouter .
    5. Renommez la ROIs. Après avoir ajouté la ROIs à analyser dans le Gestionnaire de ROI, renommez-les Bleach ROI, ROI de contrôleet ROI de l’arrière-plan en conséquence.
    6. Intensité du signal de mesure dans la ROIs. Sélectionnez Bleach ROI, ROI de contrôleet ROI de l’arrière-plan, puis sélectionnez plus | Mesure multi. Vérifiez que mesurer toutes les tranches de 35 et une ligne par tranche sont sélectionnés. Dans la fenêtre Définir les mesures , vérifiez que seulement gris valeur moyenne est sélectionnée.
      Remarque : Ce sont les données brutes de la PAF (Figure 1B).
    7. Collez les résultats dans un tableur (Table des matières). Copie l’eau de Javel ROI, contrôler le retour sur investissement, et intensité de signal pour le ROI fond résultats puis collez-les à colonnes intitulées Bleach ROI, ROI de contrôleet ROI de l’arrière-plan, respectivement dans un tableur (Table des matières).
  5. Analyse des données dans un tableur
    1. Fond-corriger l’intensité du signal dans l’eau de Javel ROI et contrôle ROI (Figure 1A, C). Utiliser l’outil Insérer une fonction dans un tableur (Table des matières) pour soustraire les valeurs dans la colonne intitulée Fond ROI des valeurs dans la colonne intitulée Bleach ROI. Soustraire les valeurs dans la colonne intitulée Fond ROI des valeurs dans la colonne intitulée Contrôle ROI. Ces nouvelles colonnes Corrigé Bleach ROI et ROI de contrôle corrigéde l’étiquette.
    2. Normaliser le signal dans l’eau de Javel ROI au signal de référence-corrigée dans le contrôle ROI (Figure 1A, D). Utilisez la fonction insérer dans un tableur (Table des matières) pour diviser les valeurs dans la colonne intitulée Corrigé Bleach ROI par les valeurs dans la colonne intitulée Corrigé contrôle ROI. Cette nouvelle colonne Normalisé corrigé Bleach ROIde l’étiquette.
    3. Normaliser le signal dans la colonne Normalisé de ROI Bleach corrigé à la moyenne des 5 valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI (Figure 1A, E). Calculer la moyenne des 5 valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Ensuite, diviser les valeurs dans la colonne intitulée Normalisé de ROI Bleach corrigé par la moyenne des 5 valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Cette nouvelle colonne Normalisé corrigé Prebleach moyen Bleach ROIde l’étiquette.
  6. Fraction mobile et la moitié du temps de récupération de données courbe ajustée
    1. Courbe-fit les données ROI de Javel normalisée et corrigés à l’aide d’un programme de traitement de l’image (Table des matières). Dans le programme de traitement d’imagerie (Table des matières), sélectionnez Analyze | Outils | Ajustement de la courbe. Copie le postbleach normalisé et corrigé les valeurs de retour sur investissement de Javel et les valeurs correspondantes de l’époque, puis collez-les dans la fenêtre de Courbe Fitter . Sélectionnez Recovery exponentielle dans le menu déroulant Courbe Ajusteur , puis sélectionnez ajuster.
    2. Calculer la Mf dans les paramètres de la fonction de récupération, qui fournit des valeurs pour : « a, » une fraction lentement de récupération ; « b, » le taux de récupération ; et « ce, une fraction diffusant rapidement. Calculer Mf en branchant les valeurs pour « a » et « c » dans l' équation Mf = a + c. calculer l’If à l’aide de l’équation j’aif = 1 - Mf. Calculer t½ en substituant la valeur de « b » dans l’équation figure-protocol-2 puis résoudre pour t1/2. 11

Résultats

Montré ici sont le résultat d’une expérience typique dans lequel nous avons utilisé le FRAP afin d’examiner le degré de mobilité de p62 dans ALIS RAW264.7 cellules traitées avec le LPS pour 3-5 h12. Figure 3 A montre les fichiers RAW provenant d’une eau de Javel, contrôler et ROI d’arrière-plan après la pile d’images avait été alignée pour corriger pour les petits montants (< 3 ~ µm) de dérive d’image d’ALIS. YFP-p62 fluorescence dans cette ALIS à prebleach et postbleach est montré en Figure 3E et supplémentaire vidéo 1. Figure 3 B montre ces données après correction du fond. Figure 3 C affiche ces données après correction pour la fluorescence dans le contrôle ROI. Figure 3 D montre ces valeurs normalisés à la fluorescence moyenne des 5 valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Le degré de blanchiment ne suffisait pas dans cette expérience (profondeur d’eau de Javel = 91.94). YFP-p62 fluorescence dans cette ALIS récupéré lentement, comme t1/2 = 128,27 s (2,14 min). YFP-p62 n’était pas une protéine très mobile dans cette expérience, comme Mf = 21.97 If = 78.03.

figure-results-1
Figure 1 : Un diagramme d’une cellule RAW264.7 et étapes pour l’analyse de l’image après les images de la PAF ont été alignés pour corriger la dérive d’image de l’ALIS. (A) schéma d’une cellule RAW264.7 illustrant plusieurs ALIS et l’eau de Javel, de régulation et ROIs de fond au sein de l’acquisition de ROI. (B) une représentation idéalisée de FRAP brute tirées dans l’eau de Javel, de régulation et fond ROIs dans panneau A. (C) un graphique en données brutes de PAF qui ont été corrigées idéalisé. (D) un graphique idéalisé de données FRAP-corrigées ont été normalisés à fluorescence dans le contrôle ROI. (E) un idéalisé graphique des données FRAP normalisées et correction de fond qui ont été normalisées pour la fluorescence prebleach l’eau de Javel ROI. Abréviations : Con = contrôle ; BG = fond. Ce chiffre a été modifié de Rabut et Ellenberg4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Images de l’interface utilisateur dans le logiciel AIM (Table des matières) pour la sélection de laser à faisceau configuration du chemin d’accès et paramètres d’acquisition image pour les expériences FRAP. Laser (A) contrôler l’écran montrant les lignes laser Argon/2, sortie et courant de tube utilisé. (B) Configuration écran montrant le faisceau de commande splitter et émission filtrent les paramètres utilisés. Scan (C) contrôler l’écran montrant le paramètre utilisé pour l’acquisition d’images. (D) Scan contrôler l’écran montrant le sténopé, gain de détecteur, amplificateur offset, gain de l’amplificateur et les paramètres de transmission pour la ligne de laser Argon/2 514 nm. (E) séries temporelles contrôlent l’écran indiquant les paramètres de série temps utilisés. Eau de Javel (F) contrôler l’écran montrant le prebleach et postbleach des paramètres utilisés. Abréviations : HFT = Haupt Farb Teiler (séparateur de faisceau dichroïque primaire) ; NT1 = 1 de Teiler Neben Farb (séparateur de faisceau dichroïque première secondaire) ; NT2 = Neben Farb Teiler 2 (séparateur de faisceau dichroïque deuxième secondaire) ; EF = filtre d’émission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Une expérience FRAP représentative pour l’étude dynamique de la YFP-p62 dans ALIS dans les cellules RAW264.7. (A) données d’intensité de fluorescence Raw pour une eau de Javel, de régulation et fond ROI. (B) les données contenues dans la paroi A après que l’eau de Javel et le contrôle ROI avaient été corrigées pour la fluorescence dans le fond ROI. (C) les données contenues dans les groupes A et B après la normalisation de l’intensité de fluorescence dans le ROI de l’eau de Javel pour tenir compte de la fluorescence dans le contrôle arrière-plan corrigé ROI. (D) les données contenues dans les panneaux A-C après normalisation de l’intensité de fluorescence dans le bleach normalisée et corrigées ROI à la moyenne des 5 premières valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Mf = 21.97, j’aif = 78.03, t1/2 = 128,27 s (2,14 min) et la profondeur de l’eau de Javel = 91.94. (E), l’image d’un ALIS à prebleach (1,5 min) et postbleach (0, 6 et 16 min). Echelle = 5 µm et est valable pour tous les panneaux. Abréviations : Con = contrôle ; BG = bruit de fond ; Corr. = corrigé ; Norm. = normalisé ; Prix moyen = moyenne. Ce chiffre a été modifié de Cabe et al.12s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Supplémentaire vidéo 1 : un ALIS typique dans un macrophage RAW264.7 avant et après Photoblanchiment. YFP-p62 fluorescence est lent à se rétablir après le photobleach ; p62 n’est donc pas une protéine très mobile. Pour cette expérience, Mf = 25.62, j’aif = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) et la profondeur de l’eau de Javel = 90.19. Echelle = 5 µm. Cette vidéo a été modifiée de Cabe et al.12s’il vous plaît cliquez ici pour regarder cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Nous fournissons un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Dans les présentes, le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des YFP-p62 dans ALIS RAW264.7 macrophages, mais elle peut être appliquée à de nombreux systèmes de microscope confocal à balayage laser et codé génétiquement des protéines fluorescentes qui sont maintenant disponibles. Pour n’importe quel système de microscopie, les expériences pilotes sont essentiels pour déterminer les paramètres optimaux de FRAP, incluant l’acquisition, eau de Javel et de tailles de contrôle ROI, intensité du laser pour le Photoblanchiment et acquisition d’images prebleach et postbleach. Il est raisonnable de s’attendre les paramètres optimaux de FRAP diffèrent pour chaque ligne de protéines et cellules fluorescente codé génétiquement.

Facteurs importants à considérer quand mène une expérience FRAP incluent (a) réalisation convenable de Javel profondeur, (b) l’utilisation d’une brève étape de blanchiment, (c) ce qui permet aux postbleach de temps suffisant pour observer la fonction de restauration complète, l’efficacité de Photoblanchiment (d), (e). cytotoxicité avec répétitions FRAP et (f) l’inclusion d’un contrôle pour la perte de fluorescence en raison de l’imagerie répété. Nous recommandons que la profondeur de l’eau de Javel, qui peut être calculé selon l’équation fournie dans la section 3.3.1, soit ≥ 9013. Quelle est la profondeur de l’eau de Javel < 90, le degré de fluorescence postbleach récupération sera sous-estimée et les valeurs d’IfMfet t1/2 sera incorrectes. Bien que la durée et l’intensité des impulsions laser induisant la javel peuvent varier entre les expériences du PAF, il est important que l’étape de Photoblanchiment être bref et sensiblement plus rapide que la fonction de récupération de fluorescence. Si ce n’est pas le cas, une quantité importante de récupération de la fluorescence peut se produire pendant l’étape de blanchiment. Avec un temps de l’eau de Javel long, récupération de fluorescence au cours de l’étape de blanchiment ne serait pas être mesurée, et cela donnerait lieu à des mesures erronées d’If, M,f, ett1/2. En outre, pour obtenir des valeurs correctes pour If, M,f, ett1/2, l’acquisition de retour sur investissement doit être observée postbleach jusqu'à ce que le degré de fluorescence dans l’eau de Javel ROI atteint un plateau. Par exemple, dans nos expériences FRAP, il n’y avait aucun différence entre l’If, M,fet t1/2 valeurs lorsque nous avons observé YFP-p62 fluorescence dans le ROI de l’eau de Javel pour 32,2 min postbleach contre quand nous avons observé YFP-p62 dans l’eau de Javel ROI pour 15,1 min postbleach ; ainsi, nous avons conclu que la fonction de récupération atteint un plateau à 15,1 min postbleach12. En ce qui concerne l’efficacité de Photoblanchiment, Photoblanchiment augmente avec le carré du facteur de zoom optique14. Ainsi, l’utilisation de zooms optiques hautes est favorable pour le Photoblanchiment rapid mais peut entraîner le Photoblanchiment indésirable lors de l’acquisition ; ce dernier peut s’expliquer par un contrôle ROI d’imagerie. Photoblanchiment répété doit être évitée car elle peut conduire à la génération de cytotoxiques reactive oxygen species (ROS). Toutefois, le degré de génération ROS dus à l’exposition d’un laser à haute intensité est plus faible pour des protéines fluorescentes génétiquement codés que pour fluorophores chimiques (p. ex. anticorps fluorescents)15et les ROS générées sont plus susceptibles de réagir au sein de la protéine fluorescente génétiquement encodée qu’avec d’autres molécules dans la cellule4. En plus de la probabilité accrue de générer ROS cytotoxique, répété Photoblanchiment est à éviter car il est difficile à contrôler. Enfin, bien que la transmission laser faible sert à acquérir toutes les images non-eau de Javel, certains Photoblanchiment invariablement se produira, qui doit être contrôlée. Contrôles possibles pour cela incluent la surveillance fluorescence dans un contrôle de retour sur investissement dans l’acquisition de ROI, obtenir des images de contrôle dans une cellule voisine écrue et effectuent des expériences de contrôle avec les paramètres identiques à ceux utilisés dans le expériences de Photoblanchiment mais sans l’événement Photoblanchiment.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Seth Robia à Loyola University Chicago pour ses précieux commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les NIH grant 1R01NS073967-01 a 1 à Joanna C. Bakowska.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle MediumHycloneSH30022.01Glycémie élevée (4,5 g/L)
Sérum fœtal bovinGemini Bio-Products100-106
Plats à fond en verreMatTekP35G-1.5-14-C35 mm
Logiciel ImageJNational Institutes of HealthN.A.
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL4391
NocodazoleSigmaM1404
Pénicilline-streptomycine solutionCorning30-002-Cl100× ;
Plan-Apochromat 63× ;/1.40 Objectif à huileCarl Zeiss MicroImaging, Inc4407629904000000
Polyéthylénimine (PEI)Polysciences23966-1linéaire (MW 25 000)
RAW 264.7 Macrophages murinsATCCTIB-71
Microscope confocal ZeissCarl Zeiss MicroImaging, IncLSM 510

Références

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747(2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696(2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568(2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Restauration de fluorescence après photoblanchimentQuantification de la mobilité des protéinesImagerie sur cellules vivantesTransfection de YFP-p62Macrophages RAW264.7Stimulation au lipopolysaccharideTraitement au nocodazoleImagerie au laser à argonProtocole d'analyse des données
Récupération de fluorescence après Photoblanchiment du jaune Fluorescent Protein tag p62 en Structures induites ressemblant à Aggresome
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