Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Résumé

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Résumé

Pour exprimer les phénotypes cellulaires dans les organismes, les cellules vivantes exécutent l'expression de gène en conséquence, et les programmes transcriptionnels jouent un rôle central dans l'expression de gène. La machinerie transcriptionnelle cellulaire et ses protéines de modification de chromatine coordonnent pour réguler la transcription. Pour analyser la régulation transcriptionnelle au niveau moléculaire, plusieurs méthodes expérimentales telles que le déplacement de mobilité électrophorétique, le report transitoire et l'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sont disponibles. Nous décrivons un test modifié de ChIP en détail dans cet article en raison de ses avantages en montrant directement des modifications d'histone et des interactions entre des protéines et l'ADN dans les cellules. L'une des étapes clés d'un succès d'un jeu d'enfant est le cisaillement de la chromatine. Bien que la sonication soit couramment utilisée pour la chromatine de cisaillement, il est difficile d'identifier les conditions reproductibles. Au lieu de tonte de chromatine par sonication, nous avons utilisé la digestion enzymatique avec la nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir des résultats plus reproductibles. Dans cet article, nous fournissons un protocole d'assay ChIP simple en utilisant MNase.

Introduction

L'expression génique dans les cellules de mammifères est étroitement et dynamiquement réglée, et la transcription est l'une des étapes clés. La transcription génique est principalement réglementée par des facteurs de transcription et des histones. Un facteur de transcription est une protéine qui se lie à des séquences d'ADN spécifiques et contrôle la transcription des gènes. Ces facteurs favorisent ou inhibent le recrutement de la polymérase II (PolII), qui initie la synthèse de l'ARNm à partir de l'ADN génomique comme modèle¹. Les modifications d'histone telles que l'acétylation et la méthylation des résidus de queue d'histone affectent positi....

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Faire une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 18,5 %. Ajouter 0,925 g de PFA, 4,8 ml d'eau (utiliser de l'eau ultrapurifiée tout au long du protocole) et 35 L de 1 M KOH dans un tube en plastique conique de 50 ml. Fermez le bouchon hermétiquement et chauffez le tube dans un bécher en verre de 400 à 600 ml contenant environ 200 ml d'eau à l'aide d'un four à micro-ondes. Retirez le tube avant que l'eau commence à bouillir et vortex le tube pour dissoudre PFA. Laisser le PFA refroidir à température ambiante et conserver sur la glace.
   REMARQUE: Répéter le chauffage et le mélange jusqu'à ce que pfA se dissout comp....

Résultats

La digestion de la chromatine est l'une des étapes importantes d'un résultat d'analyses ChIP. Nous avons utilisé MNase pour digérer la chromatine pour obtenir un mélange d'oligomères nucléosomes. Dans l'étape de digestion MNase, MNase peut passer par la membrane nucléaire et digérer la chromatine. Cependant, la chromatine digérée ne peut pas passer par la membrane et reste dans les noyaux. Pour libérer la chromatine digérée des noyaux, une brève sonication est nécessaire. La figure 1A montre.......

Discussion

Bien que la sonication soit couramment utilisée pour obtenir la chromatine fragmentée, il est long et lourd d'identifier les conditions reproductibles. Dans ce protocole, nous avons utilisé la digestion MNase parce que la digestion enzymatique devrait être plus facile d'identifier les conditions reproductibles. Une brève étape de sonication après la digestion de MNase (voir étape 2.2) a été nécessaire pour casser la membrane cellulaire et pour libérer la chromatine digérée. Par conséquent, la puissance de sonication dans.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Thermo Scientific	AM9010
2 M KCl	Thermo Scientific	AM9010
2x iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	1706862
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9010
50 bp Échelle d’ADN	New England Biolabs	N3236S
Agarose	Produit de recherche International	A20090
Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol ramifié	Millipore Sigma	I8896	IGEPAL CA-630
Protéines G de qualité ChIP Billes magnétiques	Technologie de signalisation cellulaire	9006S
Tampon de dilution par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) Millipore	Sigma	20-153	Composition du tampon : 0,01 % SDS, 1,1 % Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S
Glycine	Bio-Rad	161-0724	Glycogène de qualité électrophérèse
	Millipore Sigma	G1767	19-22 mg/mL
Halt Cocktail inhibiteur de protéase et de phosphatase, sans EDTA (100x)	Thermo Scientific	78445
Tampon de lavage Complexe immunitaire à haute teneur en sel	Millipore Sigma	20-155	Composition du tampon : 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Anticorps histone H3K4me3 (pAb)	Motif actif	39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer	Millipore Sigma	20-156	Composition du tampon : 0,25 M LiCl, 1 % IGEPAL CA630, 1 % d’acide désoxycholique (sel de sodium), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampon de lavage Complexe immunitaire à faible teneur en sel	Millipore Sigma	20-154	Composition du tampon : 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 puits)	Millipore Sigma	20-400	Tout type de support de séparation magnétique compatible avec un tube de 1,5 mL convient.
Nucléase micrococcique	New England Biolabs	M0247S	est livré avec un tampon 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 à 25 ° ; C) et 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3	JT Baker	3506-01
IgG de lapin normal	Millipore Sigma	12-370
PIPES	Millipore Sigma	P6757
Protéinase K	Millipore Sigma	3115887001
Système de PCR en temps réel	Bio-Rad	CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5	anticorps Active Motif	39749
SDS	Boehringer Mannheim	100155	Acétate de sodium de qualité électrophérèse
	Millipore Sigma	S5636
Sonicateur équipé d’une sonde à micro-pointes	QSONICA	Q700	Tout type de sonicateur compatible avec un tube de 1,5 ml convient.
Phénol UltraPure :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)	Thermo Scientific	15593031	pH 8,05