Article de méthode

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

DOI :

10.3791/59375

⸱

10 mai 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour exprimer les phénotypes cellulaires dans les organismes, les cellules vivantes exécutent l'expression de gène en conséquence, et les programmes transcriptionnels jouent un rôle central dans l'expression de gène. La machinerie transcriptionnelle cellulaire et ses protéines de modification de chromatine coordonnent pour réguler la transcription. Pour analyser la régulation transcriptionnelle au niveau moléculaire, plusieurs méthodes expérimentales telles que le déplacement de mobilité électrophorétique, le report transitoire et l'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sont disponibles. Nous décrivons un test modifié de ChIP en détail dans cet article en raison de ses avantages en montrant directement des modifications d'histone et des interactions entre des protéines et l'ADN dans les cellules. L'une des étapes clés d'un succès d'un jeu d'enfant est le cisaillement de la chromatine. Bien que la sonication soit couramment utilisée pour la chromatine de cisaillement, il est difficile d'identifier les conditions reproductibles. Au lieu de tonte de chromatine par sonication, nous avons utilisé la digestion enzymatique avec la nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir des résultats plus reproductibles. Dans cet article, nous fournissons un protocole d'assay ChIP simple en utilisant MNase.

Introduction

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L'expression génique dans les cellules de mammifères est étroitement et dynamiquement réglée, et la transcription est l'une des étapes clés. La transcription génique est principalement réglementée par des facteurs de transcription et des histones. Un facteur de transcription est une protéine qui se lie à des séquences d'ADN spécifiques et contrôle la transcription des gènes. Ces facteurs favorisent ou inhibent le recrutement de la polymérase II (PolII), qui initie la synthèse de l'ARNm à partir de l'ADN génomique comme modèle1. Les modifications d'histone telles que l'acétylation et la méthylation des résidus de queue d'histone affectent positivement et négativement la transcription de gène en changeant la structuredechromatine 2. Puisque les altérations de l'expression génique affectent le contexte cellulaire, il est essentiel d'examiner les mécanismes moléculaires par lesquels la transcription est réglementée.

À ce jour, plusieurs méthodes d'étude de la régulation de la transcription génétique sont disponibles. L'analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), également appelée analyse de changement de gel, est utilisée pour analyser une interaction protéine-ADN3. Un extrait nucléaire de cellules d'intérêt est incubé avec une sonde d'ADN étiquetée par isotope radioactif (par exemple, 32P) et électrophoresed sur un gel de polyacrylamide. Son autoradiogramme montre que le complexe ADN-protéine migre plus lentement que la sonde dans un gel. En présence d'un anticorps contre la protéine, le complexe ADN-protéine-anticorps migre dans un gel plus lentement que le complexe ADN-protéine. Cette bande superdécalée révèle une liaison spécifique entre l'ADN et la protéine. Cependant, l'EMSA détermine seulement une interaction ADN-protéine spécifique dans un système sans cellules, et par conséquent on ne sait pas si l'interaction contrôle la transcription dans les cellules vivantes. L'exemple de journaliste transitoire, communément appelé test de journaliste de luciferase, a été développé pour aborder la régulation d'expression de gène dans les cellules. Typiquement, une région génomique en amont d'un gène d'intérêt est insérée dans un plasmide de journaliste, transfectée transitoirement dans les cellules, et l'activité de journaliste est mesurée. Une variété de mutants de suppression permet l'identification des régions qui sont responsables de la régulation des gènes. Même si un test de journaliste est un outil utile pour identifier les facteurs de transcription et lier les séquences d'ADN contrôlant la transcription, cette méthode a un inconvénient majeur en ce qu'un plasmide journaliste est exempt de structure de chromatine et ne reflète pas «réel» machines de transcription. En outre, les modifications apportées aux modifications de l'histone ne peuvent pas être déterminées par le système.

Le développement de la méthode d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) a été basé sur les rapports de Jackson et Chalkley que la fixation de « cellule entière » avec la structure préservée de chromatine de formaldéhyde4,5. Depuis lors, de nombreuses techniques connexes ont été développées et améliorées6. Dans les analyses ChIP, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde pour relier l'ADN et les protéines. La chromatine est fragmentée puis immunoprécipitée avec des anticorps d'intérêt. Le complexe immunitaire est lavé, et l'ADN est purifié. L'amplification de PCR avec des amorces ciblées à une région particulière du génome indique l'occupation des protéines d'intérêt dans le génome.

Bien que ChIP soit un outil puissant pour identifier les interactions des protéines telles que les facteurs de transcription et les histones modifiées avec l'ADN, la méthode implique quelques difficultés, telles qu'une étape de fragmentation de chromatine, dans la pratique. Sonication a été largement utilisé pour la chromatine de cisaillement; cependant, il est difficile d'identifier les conditions reproductibles. Le traitement de nucléase micrococcique (MNase) est une méthode alternative pour le tonte de chromatine. MNase est une endo-exonucléase qui digère l'ADN et l'ARN à double brin, à brin unique, circulaire et linéaire. Il est relativement facile de déterminer les conditions, y compris les quantités de chromatine et d'enzyme, la température et le temps d'incubation, pour une fragmentation optimale de la chromatine. Nous avons modifié et simplifié les protocoles existants, et nous avons établi une méthode simple et reproductible. Cet article fournit le protocole pour un examen ChIP en utilisant MNase dans les cellules de mammifères.

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Protocole

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1. Préparation des réactifs

  1. Faire une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 18,5 %. Ajouter 0,925 g de PFA, 4,8 ml d'eau (utiliser de l'eau ultrapurifiée tout au long du protocole) et 35 L de 1 M KOH dans un tube en plastique conique de 50 ml. Fermez le bouchon hermétiquement et chauffez le tube dans un bécher en verre de 400 à 600 ml contenant environ 200 ml d'eau à l'aide d'un four à micro-ondes. Retirez le tube avant que l'eau commence à bouillir et vortex le tube pour dissoudre PFA. Laisser le PFA refroidir à température ambiante et conserver sur la glace.
    REMARQUE: Répéter le chauffage et le mélange jusqu'à ce que pfA se dissout complètement. Préparer la solution PFA immédiatement avant de le relier (étape 2.1.3).
  2. Faire 1,25 M solution de glycine. Dissoudre 14,07 g de glycine dans 150 ml d'eau et filtrer à travers un filtre de la taille d'un pore de 0,22 m. Conserver à 4 oC.
  3. Faire tampon de lyse de cellules ChIP. Dissoudre 378 mg de PIPES, 10,6 ml de 2 M KCl et 1,25 g d'octylphénoxy poly(éthylène) éthanol ramifié dans l'eau. Ajuster le pH à 8,0 avec 1 M KOH à 4 oC et faire jusqu'à 250 ml. Filtrer à travers un filtre de la taille d'un pore de 0,22 m et entreposer à 4 oC.
  4. Faire tampon de digestion de nucléane micrococcique (MNase). Pour faire 1 ml, mélanger 0,1 ml de tampon de digestion MNase 10x, 10 oL de 100x solution BSA, 10 oL de 0,1 M de dithiothreitol et 0,88 mL d'eau.
  5. Faire 1 M NaHCO3. Dissoudre 4,2 g de NaHCO3 dans 50 ml d'eau et filtrer à travers un filtre de la taille d'un pore de 0,22 m. Conserver à température ambiante.
  6. Faire 10% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS). Dissoudre 5 g de SDS dans 50 ml d'eau. Conserver à température ambiante.
  7. Faire tampon d'élution. Mélanger 15 'L de 1 M NaHCO3, 15 'L de 10% SDS, et 120 'L d'eau pour obtenir 150 'L de tampon d'élution pour un échantillon.
    REMARQUE: Augmenter les volumes proportionnellement en fonction du nombre d'échantillons.
  8. Faire une solution d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2). Dissoudre 24,6 g d'acétate de sodium anhydre dans l'eau. Ajuster le pH à 5,2 avec de l'acide acétique et faire 100 ml. Filtrer à travers un filtre de la taille d'un pore de 0,22 m et conserver à température ambiante.

2. Détermination des conditions de digestion MNase

REMARQUE: Dans l'étape 2 du protocole, un exemple utilisant VCaP, les cellules cancéreuses humaines de prostate sont présentées. Toutes les lignées cellulaires de mammifères peuvent être utilisées; voir Note aux marches.

  1. Préparation de la chromatine croisée
    1. Maintenir les cellules VCaP dans le glucose DME-haut complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) à 37 oC dans un incubateur de dioxyde de carbone. Cellules VCaP de graine à 4 x 106 cellules dans six plats de 6 cm dans 4 ml de médias et de culture de culture pendant 3 jours.
      REMARQUE: Utilisez des supports de culture appropriés pour chaque ligne cellulaire. Jusqu'à 10 x 106 cellules peuvent être ensemencées dans un plat de 6 cm ou 10 cm. Pour les cellules en suspension, les cellules de semence dans les flacons T25. Le nombre de plats ou de flacons dépend du nombre de doses testées pour la digestion de MNase. Si 4 doses sont testées, préparer 6 plats ou flacons. Voir aussi l'étape 2.2.
    2. Détachez les cellules VCaP d'un plat à l'aide de la trypsine et comptez la cellule. Calculer le numéro de cellule dans un plat. Pour les cellules suspendues, retirer une petite quantité de suspension cellulaire d'un flacon et compter le numéro de cellule.
    3. Ajouter 0,229 ml de 18,5 % de PFA à un plat de 6 cm dans 4 ml de culture à une concentration finale de 1 %. Tournoyer doucement mais soigneusement un plat ou une fiole pour répartir uniformément le PFA. Incuber à température ambiante pendant exactement 10 min.
      REMARQUE: Dans cette étape, la chromatine et les protéines sont reliées entre elles. Comme la PFA est toxique, effectuez cette étape dans une hotte chimique de fumée et utilisez l'équipement de protection individuelle approprié.
    4. Après 10 min, ajouter 0,47 ml de 1,25 M de solution de glycine à une concentration finale de 125 mm. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE: La glycine neutralise l'excès de PFA pour arrêter d'autres liaisons croisées.
    5. Aspirez les médias formaldéhyde/glycine/culture. Laver les cellules en ajoutant 4 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS) deux fois. Pour les cellules suspendues, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et une centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le supernatant et ajoutez un volume moyen de PBS et suspendez complètement. Répétez cette étape. Éliminer correctement les déchets liquides puisqu'ils contiennent du formaldéhyde.
    6. Préparer PBS contenant de la protéase et du cocktail inhibiteur de la phosphatase (PIC) en ajoutant 1/100 volume de 100x PIC à PBS. Aspirez PBS à partir d'un plat et ajoutez 1 ml par plat de PBS contenant pic. Gratter les cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Pour les cellules suspendues, il suffit de transférer la suspension dans un tube de 1,5 ml.
    7. Tubes centrifugeà 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante pour récupérer le granule cellulaire. Retirez complètement le PBS à l'aide d'une pipette. Enregistrez le numéro de cellule par tube et rangez la pastille cellulaire à -80 oC.
  2. Lyse cellulaire et digestion de MNase
    REMARQUE: Le volume de réactif dans les étapes suivantes est basé sur un tube contenant 6 x 106 cellules. Ajuster le volume de réactif proportionnellement en fonction du nombre de cellules; lorsqu'un tube contient 2 x 106 cellules, utilisez 100 l de tampon de lyse cellulaire ChIP (étape 2.2.1), tampon de digestion MNase (étape 2.2.3), et tampon de dilution ChIP (étape 2.2.5), et 10 'L de 0.5 M EDTA (pH 8.0) (étape 2.2.4).
    1. Décongeler la pastille cellulaire stockée (cellules VCaP, contenant 6 x 106 cellules par tube) préparée à l'étape 2.1.7 sur la glace. Préparer la lyse cellulaire ChIP tampon complété avec PIC en ajoutant 1/100 volume de 100x PIC à la mémoire tampon. Ajouter 300 l de tampon de lyse cellulaire ChIP complété par PIC et resuspendre la pastille à fond. Vortex le tube pendant 15 s et couver la suspension sur glace pendant 10 min.
    2. Centrifugeuse à 9 000 x g pendant 3 min à 4 oC et retirer complètement le supernatant. Resuspendre la pastille dans 300 'L de tampon de digestion MNase.
    3. Diluer mNase (2 000 gels unités/L) avec tampon de digestion MNase pour donner 50 unités de gel/L. Ajouter 0, 0,5, 1, 2, 4 l de 50 unités de gel/L de MNase à la suspension et incuber à 37 oC pendant exactement 10 min, en mélangeant par inversion toutes les 2,5 min.
      REMARQUE : Le tableau 1 montre des quantités optimales de MNase dans plusieurs lignées cellulaires.
    4. Ajouter 30 OL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) pour mettre fin brièvement à la digestion et au vortex de MNase. Incuber 5 min sur glace. Centrifugeuse à 9 000 x g pendant 5 min à 4 oC et retirer complètement le supernatant.
    5. Préparer le tampon de dilution ChIP complété avec PIC en ajoutant 1/100 volume de 100x PIC à la mémoire tampon. Resuspendre le granule dans 300 L de tampon de dilution ChIP complété par PIC.
    6. Sonicate la suspension sur la glace à l'aide d'un sonicator équipé d'une sonde micropointe. Utilisez les conditions de sonication suivantes : amplitude 2, temps traité 15 s, impulsion ON 5 s, impulsion OFF 30 s. Prenez 1 l de la suspension et apercevez-le sur un verre coulissant et observez-les à l'aide d'un microscope. Assurez-vous que la structure cellulaire est presque cassée.
      REMARQUE: La figure 1A montre des microphotographies représentatives de la suspension de la cellule VCaP avant et après la sonication. Cette étape est pour libérer la chromatine digérée dans le supernatant en cassant les membranes nucléaires. Un réglage de puissance doit être ajusté à moins de 5% de la puissance maximale et essayer la sonication pour 5 s trois fois avec plus d'un intervalle de 30 s. Si le contrôle de la puissance est disponible, ajustez le réglage de puissance à 5 W et traitez les échantillons pour un total de 15 s comme mentionné ci-dessus pour donner une puissance totale de 70-75 J. Vérifiez si la structure cellulaire est cassée comme mentionné ci-dessus. Si ce n'est pas suffisant, répétez une fois de plus. La condition décrite ci-dessus est pratiquement appliquée à toutes les lignées cellulaires testées.
    7. Centrifugeuse à 9 000 x g pendant 10 min à 4 oC, transférez le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml et économisez 20 ll de la chromatine digérée pour l'étape 2.3. Conserver le reste à -80 oC.
  3. Reverse crosslinking, purification de l'ADN et analyse de la chromatine digérée
    1. Ajouter 75 l'eau, 4 l de 5 M NaCl et 1 An de protéinase K à un tube à vis de 1,5 ml. Ajouter 20 l de chromatine digérée de diverses conditions de digestion MNase préparées à l'étape 2.2.7 aux tubes contenant de l'eau, NaCl, et la protéinase K. Fermez le bouchon hermétiquement, mélangez complètement, et incubez le tube à 65 oC pendant la nuit.
      REMARQUE: Cette étape est pour l'élimination des liens croisés entre les protéines et l'ADN.
    2. Préparer deux tubes microcentrifuges de 1,5 mL par condition. Ajouter 100 ll de phénol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) à un tube de 1,5 ml. Ajouter 10 l d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et 2 l de glycogène dans un autre tube.
      REMARQUE: L'utilisation de chloroforme:isoamylalcohol n'est pas nécessaire7. L'augmentation du volume peut entraîner une faible récupération de l'ADN après la précipitation de l'éthanol8.
    3. Centrifuger le tube contenant de la chromatine digérée à partir de l'étape 2.3.1 brièvement et ajouter 100 L de PCI. Fermez le bouchon hermétiquement et vortex zetez vigoureusement pour former l'émulsion. Centrifuger le tube à vitesse maximale (p. ex. 20 000 x g) pour 30 s à température ambiante.
    4. Prenez soigneusement la phase supérieure contenant de l'ADN et ajoutez au tube contenant du PCI préparé à l'étape 2.3.2. Vortex vigoureusement et centrifuger le tube comme étape 2.3.3.
      REMARQUE: Si la phase inférieure est contaminée, centrifuger le tube à nouveau, ou enlever la majeure partie de la phase inférieure d'abord, centrifuger le tube, et prendre la phase supérieure.
    5. Prenez soigneusement la phase supérieure décrite à l'étape 2.3.4 et ajoutez au tube contenant de l'acétate de sodium et du glycogène préparé à l'étape 2.3.2. Ajouter 250 l d'éthanol. Mélanger par inversion et incuber pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger le tube à vitesse maximale (p. ex. 20 000 x g) pendant 30 min à 4 oC.
      REMARQUE: L'incubation de la solution à température ambiante n'affecte pas la récupération de l'ADN8,9.
    6. Confirmer les granulés au fond du tube. Retirez soigneusement le supernatant afin de ne pas déranger le granule et ajoutez 500 L d'éthanol à 70 %. Centrifuger le tube à vitesse maximale (p. ex. 20 000 x g) pendant 5 min à 4 oC.
    7. Retirer complètement le supernatant et sécher le granule pendant environ 5 min à température ambiante. Dissoudre la pastille dans 20 l de 10 mM Tris HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Mesurer la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre UV.
    8. Mélanger 0,5 g d'ADN avec un colorant de chargement de gel et appliquer sur le gel agarose de 2 %. Électrophorise les échantillons à 100 V dans le tampon tris-acétate-EDTA jusqu'à ce que le colorant violet migre vers les deux tiers du gel et tache un gel avec du bromure d'éthidium de 0,5 g/mL pendant 10 min. Prenez une photo du gel.
      REMARQUE: Voir La figure 2 pour plus de détails.

3. ChromatinImmunoprécipitation

  1. Préparation de la chromatine digérée
    1. Préparer les cellules. Pour les cellules adhérentes, ensemencez 2-10 x 106 cellules par plat dans 2 plats (6 cm ou 10 cm) par groupe de traitement et laissez les cellules se fixer au fond de la vaisselle pendant plus d'une journée. Pour les cellules en suspension, graines dans 2 flacons T25 par groupe de traitement. Traiter les cellules comme vous le souhaitez.
    2. Prenez un plat ou un flacon de chaque groupe et comptez le numéro de cellule tel que décrit à l'étape 2.1.2. Préparer la chromatine à liens croisés mentionnée dans les étapes 2.1.3-2.1.7.
    3. Lyse la pastille cellulaire et la digestion MNase comme décrit dans les étapes 2.2.1-2.2.7. Utilisez la quantité optimale de MNase pour digérer la chromatine telle qu'elle est déterminée à l'étape 2. Conserver la chromatine digérée à -80 oC.
    4. Lien croisé inverse 20 l de chromatine digérée et purifier l'ADN tel que décrit à l'étape 2.3.8. Mesurer la concentration d'ADN telle que décrite à l'étape 2.3.7. Électrophorese les échantillons dans 2% gel agarose pour vérifier la taille de la chromatine digérée comme mentionné à l'étape 2.3.
      REMARQUE: La concentration d'ADN est identique à celle de la chromatine digérée stockée préparée à l'étape 3.1.3.
    5. Diluer un échantillon de chromatine digérée interconnecté inversé à partir de l'étape 3.1.4 pour donner 10 ng/L avec de l'eau et diluer en série pour faire des concentrations de 1, 0,1 et 0,01 ng/L. Magasin à -20 oC.
      REMARQUE: Ces échantillons sont utilisés pour les normes PCR en temps réel.
  2. Immunoprécipitation
    REMARQUE: Dans les étapes 3.2-3.5 du protocole, l'occupation de l'histone h3 4 (H3K4me3) anti-triméthylique dans les cellules VCaP est déterminée. Voir aussi Figure 3.
    1. Décongeler la chromatine digérée à partir de l'étape 3.1.3. Gardez tous les échantillons sur la glace.
    2. Préparer le tampon de dilution ChIP complété avec PIC en ajoutant 1/100 volume de 100x PIC à la mémoire tampon. Diluer la chromatine digérée à 5 'g/500 'L avec le tampon de dilution ChIP complété avec PIC. Préparer 1 000 l plus un supplément pour (1) IP avec IgG non immunisé (Control IgG), (2) IP avec H3K4me3.
    3. Ajouter 5 'L de 5 'g/500 'L de chromatine digérée à un tube à vis de 1,5 mL comme échantillon d'entrée (1% d'une ADRESSE IP). Conserver l'échantillon à -80 oC.
    4. Ajouter 500 L chacun de 5 g/500 chromatined digérée à un tube à vis de 1,5 mL comme échantillon IP. Ajouter 2 g d'anticorps au tube. Fermez le bouchon et incubez le tube à 4 oC pendant la nuit avec un mélange doux à l'aide d'une plate-forme à bascule.
      REMARQUE: Bien que la quantité optimale d'anticorps soit déterminée empiriquement, 2 g par IP sont recommandés dans un premier temps.
    5. Ajouter 30 l de perles magnétiques de protéine G de qualité ChIP par IP. Incuber le tube à 4 oC pendant 2 h avec un mélange doux à l'aide d'une plate-forme à bascule.
      REMARQUE: Le prélavage des perles magnétiques n'est pas nécessaire.
  3. Lavage du complexe immunitaire et inversion des liaisons croisées
    1. Faites tourner le tube de l'étape 3.2.5 brièvement. Placez le tube dans une grille en polyéthylène contenant des aimants en néonium pendant 1 min. Retirez soigneusement le supernatant par aspiration.
    2. Ajouter 0,5 ml par tube de tampon de lavage complexe immunitaire faible en sel. Disperser les perles en tapant doucement ou en faisant un vortex bref avec le tube. Incuber le tube à 4 oC pendant 5 min avec un mélange doux à l'aide d'une plate-forme à bascule. Après 5 min, répétez l'étape 3.3.1.
    3. Ajouter 0,5 ml de tampon de lavage complexe immunitaire à haute teneur en sel par tube. Dispersez et lavez les perles à l'étape 3.3.2. Après le lavage, répétez l'étape 3.3.1.
    4. Ajouter 0,5 ml de tampon de lavage complexe immunitaire LiCl par tube. Dispersez et lavez les perles à l'étape 3.3.2. Après le lavage, répétez l'étape 3.3.1.
    5. Placer le tube dans un support magnétique pendant 1 min. Retirez complètement le reste du supernatant.
    6. Ajouter 150 l de tampon d'élution au tube. Vortex le tube pour disperser complètement les perles. Fermer le bouchon et incuber le tube à 65 oC pendant 30 min, en mélangeant par inversion ou en vortexant toutes les 5 minutes pour disperser soigneusement les perles.
    7. Pendant l'incubation, préparer un tube à vis de 1,5 ml et ajouter 6 l de 5 M NaCl et 2 L de proteinase K. Dégeler 1 % d'échantillon d'entrée préparé à l'étape 3.2.3. Ajouter 150 l de tampon d'élution, 6 l de 5 M NaCl et 2 l d'échantillon d'entrée de protéase K à 1%.
    8. Après l'incubation, faites tourner le tube. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 min et transférez le supernatant sur le tube à vis contenant NaCl et proteinase K préparé à l'étape 3.3.7.
    9. Fermer le bouchon et le vortex tous les échantillons ip et d'entrée pour mélanger complètement. Incuber le tube à 65 oC pendant la nuit.
  4. Purification de l'ADN
    1. Préparer le tube tel que décrit dans 2.3.2 et ajouter 150 L de PCI au lieu de 100 l. Dans un autre tube, ajouter 12 oL d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et 2 l de glycogène.
    2. Retirer le tube de l'incubateur. Faites une rotation vers le bas du tube et ajoutez 150 l de PCI.
    3. Vortex vigoureusement le tube pour former l'émulsion. Centrifuger le tube à vitesse maximale (p. ex. 20 000 x g)pour 30 s à température ambiante.
    4. Transférer soigneusement 140 L de la phase supérieure vers le tube contenant du PCI préparé à l'étape 3.4.1. Répétez l'étape 3.4.3.
      REMARQUE: Voir aussi Note à l'étape 2.3.4.
    5. Transférer délicatement 120 l de phase supérieure dans le tube contenant de l'acétate de sodium et du glycogène préparé à l'étape 3.4.1.
      REMARQUE: Voir aussi Note à l'étape 2.3.4.
    6. Ajouter 300 l d'éthanol. Mélanger par inversion et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    7. Centrifuger le tube à vitesse maximale (p. ex. 20 000 x g) pendant 30 min à 4 oC. Laver la pastille telle que décrite à l'étape 2.3.6.
    8. Après le séchage de la pastille telle que décrite à l'étape 2.3.7, dissoudre la pastille dans 50 'L de TE. Conserver à -20 oC.
  5. Détection de fragments d'ADN à l'aide de PCR en temps réel
    1. Décongeler les échantillons suivants : (1) IP avec Control IgG, (2) IP avec anti-H3K4me3, (3) échantillon d'entrée de 1 %. Décongeler également 4 doses de normes préparées à l'étape 3.1.5 (total de 7 échantillons).
      REMARQUE: Utiliser les normes du même groupe pour la quantification des quantités d'ADN dans les échantillons d'entrée et de propriété intellectuelle.
    2. Faire la solution de travail DE PCR pour 8 échantillons. Mélanger 40 L de 2 x supermix PCR en temps réel, 8 L chacun de 4 amorces avant et inversées, et 8 l d'eau.
      REMARQUE: Un mélange de réaction PCR contient 5 L de 2 x supermix PCR en temps réel, 1 L chacun de 4 amorces avant et inversées, et 1 l d'eau. Les séquences d'apprêt sont énumérées dans le tableau 2.
    3. Aliquot 8 L de solution de travail PCR dans un puits d'une plaque PCR. Ajouter 2 'L d'échantillons de l'étape 3.4.8 ou des normes de l'étape 3.1.5.
    4. Sceller la plaque PCR et faire fonctionner le PCR en utilisant les conditions suivantes : 1) 95 oC pour 3 min pour la dénaturation initiale, 2) 95 oC pour 10 s pour la dénaturation, 3) 56 oC pour 30 s pour l'annealing, 4) 72 oC pour 30 s pour l'extension et la collecte de données , répéter les étapes 2) à 4) pendant 55 cycles. Après le vélo, mesurer une courbe de fusion du produit PCR. Analyser les données.
      REMARQUE: Les données brutes de la figure 3 sont affichées dans le tableau 3. Calculer la quantité de départ (SQ) des échantillons à l'aide d'une courbe standard. Multipliez sq en 1% d'entrée par 100 pour ajuster un échantillon de 1% d'entrée SQ à un IP pour donner SQ ajusté dans l'entrée (Eq. 1). Divisez la SQ dans l'échantillon IP par SQ ajusté dans l'entrée pour donner la valeur d'entrée de % (méthode d'entrée de pourcentage, Eq. 2). Pour calculer l'enrichissement du pli, divisez SQ en IP avec anti-H3K4me3 par SQ en IP avec contrôle IgG (méthode d'enrichissement de pli, Eq. 3).
      SQ ajusté en entrée (SQ en entrée de 1 %) x 100 (1)
      Pourcentage d'entrée de H3K4me3 100 x (SQ en IP avec anti-H3K4me3) / (SQ ajusté en entrée) (2)
      Plier l'enrichissement de H3K4me3 (SQ en IP avec anti-H3K4me3) / (SQ en IP avec contrôle IgG) (3)

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La digestion de la chromatine est l'une des étapes importantes d'un résultat d'analyses ChIP. Nous avons utilisé MNase pour digérer la chromatine pour obtenir un mélange d'oligomères nucléosomes. Dans l'étape de digestion MNase, MNase peut passer par la membrane nucléaire et digérer la chromatine. Cependant, la chromatine digérée ne peut pas passer par la membrane et reste dans les noyaux. Pour libérer la chromatine digérée des noyaux, une brève sonication est nécessaire. La figure 1A montre...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bien que la sonication soit couramment utilisée pour obtenir la chromatine fragmentée, il est long et lourd d'identifier les conditions reproductibles. Dans ce protocole, nous avons utilisé la digestion MNase parce que la digestion enzymatique devrait être plus facile d'identifier les conditions reproductibles. Une brève étape de sonication après la digestion de MNase (voir étape 2.2) a été nécessaire pour casser la membrane cellulaire et pour libérer la chromatine digérée. Par conséquent, la puissance de sonication dans...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche est appuyée par les redevances de Genentech à la Ville de l'Espoir. Ce travail n'est pas soutenu en tout ou en partie par les National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp Échelle d’ADNNew England BiolabsN3236S
AgaroseProduit de recherche InternationalA20090
Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol ramifiéMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
Protéines G de qualité ChIP Billes magnétiquesTechnologie de signalisation cellulaire9006S
Tampon de dilution par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) MilliporeSigma20-153Composition du tampon : 0,01 % SDS, 1,1 % Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Glycogène de qualité électrophérèse
Millipore SigmaG176719-22 mg/mL
Halt Cocktail inhibiteur de protéase et de phosphatase, sans EDTA (100x)Thermo Scientific78445
Tampon de lavage Complexe immunitaire à haute teneur en selMillipore Sigma20-155Composition du tampon : 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Anticorps histone H3K4me3 (pAb)Motif actif39915
LiCl Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-156Composition du tampon : 0,25 M LiCl, 1 % IGEPAL CA630, 1 % d’acide désoxycholique (sel de sodium), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampon de lavage Complexe immunitaire à faible teneur en selMillipore Sigma20-154Composition du tampon : 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 puits)Millipore Sigma20-400Tout type de support de séparation magnétique compatible avec un tube de 1,5 mL convient.
Nucléase micrococciqueNew England BiolabsM0247Sest livré avec un tampon 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 à 25 ° ; C) et 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
IgG de lapin normalMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Protéinase KMillipore Sigma3115887001
Système de PCR en temps réelBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5anticorps Active Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155Acétate de sodium de qualité électrophérèse
Millipore SigmaS5636
Sonicateur équipé d’une sonde à micro-pointesQSONICAQ700Tout type de sonicateur compatible avec un tube de 1,5 ml convient.
Phénol UltraPure :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8,05

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Nucl ase micrococciquedosage ChIPmodifications des histonesinteractions prot ine ADNcisaillement de la chromatinedigestion la MNaselyse cellulairepurification de l ADN

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