Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

Summary

Amas de protéines récepteurs germinant dans « germinosomes » dans la membrane interne de spores de Bacillus subtilis . Les auteurs décrivent un protocole utilisant des protéines de super-résolution microscopie et fluorescentes de journaliste pour visualiser germinosomes. Le protocole précise également domaines de membrane interne de spores qui sont préférentiellement souillées avec le colorant de membrane FM4-64.

Abstract

La petite taille des spores et la relativement faible abondance des protéines de la germination, causer des difficultés dans leurs analyses microscopiques à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Super-résolution microscopie de Illumination structurée en trois dimensions (3D-SIM) est un outil prometteur pour surmonter cet obstacle et de révéler les détails moléculaires du processus de la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis). Nous décrivons ici l’utilisation d’un SIMcheck modifié (ImageJ)-processus d’imagerie 3D assistant et protéines fluorescentes journaliste pour la microscopie SIM de germinosomes des spores de b. subtilis , grappes des protéines de la germination. Nous présentons également une procédure d’imagerie 3D (standard)-SIM pour FM4-64 la souillure des membranes de spores de b. subtilis . Grâce à ces procédures, nous avons obtenu une résolution inégalable pour la localisation de germinosome et montrent que > 80 % des KGB80 de b. subtilis spores dormantes obtenues après la sporulation sur milieu minimal défini de MOPS ont un ou deux GerD-GFP et GerKB-mCherry foyers. Foyers lumineux ont été également observés dans FM4-64 colorées des images 3D-SIM des spores suggérant qu’il existe des domaines de lipides de membrane interne de fluidité différente susceptible. D’autres études qui utilisent double étiquetage des procédures avec des colorants de la membrane et germinosome protéines de journaliste pour évaluer la co-localisation et ainsi obtenir un aperçu optimal de l’organisation des protéines de la germination de bacille dans la membrane interne de spores sont possible.

Introduction

Les spores de l’ordre des Bacillales et Clostridiales sont métaboliquement inactives et extraordinairement résistant à des régimes sévères de décontamination, mais à moins qu’elles germent, ne causent pas des effets délétères dans les humains¹. En éléments nutritifs germinant déclenchée la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis), l’événement d’initiation est germinant liant aux récepteurs germinant (GRs) situé dans la membrane interne de la spore (IM). Par la suite, les GRs transmettre des signaux à la protéine de canal de SpoVA que se trouve également dans le IM. Cela se traduit par l’apparition de l’échange de spore noyau pyridine-2, 6-dicarboxylique (acide dipicolinique ; DPA ; composée de 20 % du poids sec de la spore core) pour l’eau via le canal de SpoVA. Par la suite, la libération DPA déclenche l’activation de l’hydrolyse du peptidoglycane cortex et l’absorption d’eau supplémentaire suit^2,3,4. Ces événements conduisent à un stress mécanique sur les couches du manteau, sa rupture ultérieure, l’apparition de l’excroissance et, enfin, la croissance végétative. Toutefois, les détails moléculaires exacts de la germination sont encore loin d’être résolues.

Une question majeure pour la germination des spores concerne les propriétés biophysiques des lipides qui entourent les protéines de germination IM ainsi que les protéines de canal IM SpoVA. Cette couche lipidique en grande partie immobile IM est la barrière de perméabilité principal pour beaucoup de petites molécules, y compris des conservateurs chimiques toxiques, dont certains exercent leur action dans la base de spores ou de la cellule végétative cytoplasme^5,6. La bicouche lipidique IM est probablement dans un état de gel, mais il y a une fraction importante des lipides mobiles dans l’IM⁵. IM de la spore a également le potentiel d’expansion considérable⁵. Ainsi, la superficie de la messagerie instantanée augmente de 1,6 fois à la germination sans synthèse membranaire supplémentaires et s’accompagne de la perte de cette membrane caractéristique faible perméabilité et lipides immobilité^5,6.

Alors que les détails moléculaires de l’activation des protéines de la germination et organisation des lipides IM dans les spores sont des sujets attrayants pour l’étude, la petite taille des spores de b. subtilis et la relativement faible abondance des protéines de la germination, posent un défi analyses microscopiques. Griffiths et al une épifluorescence microscope preuve concluante, à l’aide de reporters fluorescents fusionnés aux protéines de la germination, donne à penser que dans les spores de b. subtilis , la protéine d’échafaudage GerD organise trois sous-unités GR (A, B et C) de GerA, B et K GRs, dans un cluster⁷. Ils a inventé le terme « germinosome » pour ce cluster des protéines de la germination et les structures qualifiées de ~ 300 nm grand IM protéine foyers⁸. Au début de la germination des spores, fluorescent germinosome foyers en fin de compte transforment en plus disperser modèles fluorescents, avec > 75 % des populations de spores affichant ce modèle dans les spores germent pendant 1 h avec la L-valine,⁸. Notez que le document mentionné ci-dessus utilisés en moyenne des images depuis des dizaines d’images fluorescentes consécutives, pour gagner la puissance statistique et surmonter l’obstacle des faibles signaux fluorescents observées en imagerie. Cette visualisation de ces structures dans les spores bactériennes était au bord de ce qui est techniquement faisable avec les outils classiques de microscopiques et ni une évaluation du montant des foyers dans une seule spore ni leur localisation subcellulaire plus détaillée possible avec cette approche.

Ici, nous montrons l’utilisation de microscopie de Illumination structurée (SIM) pour obtenir une visualisation détaillée et la quantification de le germinosome(s) dans les spores de b. subtilis, ainsi que de leurs IM lipides domaines⁹. Le protocole contient également des instructions pour la sporulation, la préparation et l’analyse d’image par SIMcheck (v1.0, un plugin d’imageJ) ainsi que de ImageJ^10,11,12.

Protocol

1. b. subtillis Sporulation (Timing : 7 jours avant l’Observation microscopique)

1. Jour 1
   1. Ensemencer une culture bactérienne sur un bouillon Luria-Bertani (LB) agar plaque (tryptone 1 %, extrait de levure 0,5 %, 1 % de NaCl, 1 % d’agar)¹³ et incuber une nuit à 37 ° C pour obtenir des colonies individuelles. Utiliser la souche de b. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry chat, gerD-gfp kan) et sa souche de fond parent b. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) comme décrit plus haut⁷.
      Remarque : L’utilisation des spores avec le fond de ΔcotEΔgerE est indispensable à la visualisation de germinosome, afin de minimiser l’autofluorescence des spores couche couches⁷.
   2. Stériliser tous les médias, tubes, pipettes et autres matériaux de la culture pour être utilisée avec les méthodes appropriées.
2. Jour 2
   1. Ensemencer une seule colonie dans 5 mL de milieu LB tôt dans la matinée et incuber la culture sous agitation continue dans un tube avec bouchon à vis à 200 tours/minute et 37 ° C jusqu'à ce que l' OD₆₀₀ atteint 0,3-0,4 (environ 7 h).
   2. Faire 500 mL de milieu MOPS (pH 7.5) contenant 3 nM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,4 μM H₃BO₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 nM ZnSO₄·7H₂O, 1,32 mM K₂HPO₄, 0,4 mM MgCl₂·6H₂O, 0,276 mM K₂SO₄, 0,01 mM FeSO₄·7H₂O, 0,14 mM CaCl₂·2H₂O, 80 mM VADROUILLES, la Tricine, 0,1 mM MnCl₂·2H₂O, 10 mM D-glucose-monohydrate de 4 mM et 10 mM NH₄Cl.
   3. Préparer à bouchon à vis tubes 10^-1- 10^-7 série de dilutions de la culture de la LB dans 5 mL milieu de MOPS chaque et incuber les cultures du jour au lendemain sous agitation continue à 200 tours/minute et 37 ° C.
      Remarque : La série de dilutions préparées ici vise à obtenir une dilution en phase exponentielle tôt le lendemain. Cette étape et l’étape suivante sont nécessaires pour permettre les cellules de s’adapter au milieu de croissance mises en mémoire tampon MOPS.
3. Jour 3
   1. Sélectionnez l’une des dilutions MOPS avec un OD₆₀₀ de 0,3 à 0,4. Inoculer 0,2 mL de la culture à préchauffé (37 ° C) 20 mL de milieu MOPS dans une fiole conique de 250 mL et incuber en agitant continuellement jusqu'à ce que l' OD₆₀₀ atteint 0,3-0,4 (~ 7 h).
   2. Ensemencer le milieu de sporulation base de MOPS (250 mL) avec 1 % (v/v) de pré-culture étape 1.3.1 et incuber pendant 3 jours à 37 ° C dans une fiole conique litre sous agitation continue. FM4-64 la coloration des spores PS4150, ajouter 2 µg/mL FM4-64 sonde (voir Table des matières) à la sporulation moyen 1 ou 2 h après avoir atteint le sommet valeur₆₀₀ OD de la croissance végétative (généralement environ 2) et permettent la culture de par la suite sporuler tout en les protégeant de la lumière⁵.
4. Jour 7 : Récolte de spores
   1. Déterminer le rendement de la sporulation (cellules végétatives de spores vs) à l’aide de microscopie à contraste de phase à un grossissement de 100 X à distinguer les spores lumineux de phase de cellules en phase sombre et éventuellement non-mures spores. Un rendement de spore lumineux phase 90 % est attendue.
   2. Les spores à 4 270 x g pendant 15 min à 4 ° C dans des tubes à centrifuger fond rond a granulé. Laver le culot de spore 2 - 3 fois avec 40 mL d’eau ultra pure stérile de Type 1 déminéralisée dans les tubes à centrifuger coniques 50 mL (voir Table des matières). Spin down à chaque lavage à 4 270 x g pendant 15 min (4 ° C).
5. Jour 7 : Purification de spore
   1. La purification des spores : suspendre le culot de spore dans 750 µL de milieu gradient de densité non ioniques 20 % (voir tableau des matériaux) et chargez à 800 µL de milieu dégradé densité non ioniques de 50 % dans des tubes de microcentrifuge stérilisé. Centrifuger pendant 60 min à 21 500 x g. Le culot obtenu contient les spores libres. Suspendre le culot de spore dans 200 µL de milieu dégradé de 20 % densité non ioniques et charger sur 1 mL de milieu de gradient de densité non ioniques 50 % dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 21 500 x gpendant 15 minutes.
   2. Laver la préparation finale de spore et stockage : le culot obtenu contient les spores dormantes purifiées. Laver le culot de spore 2 - 3 fois avec 1,5 mL d’ultra pure stérile Type 1 de l’eau (voir Table des matières) et spin down dans l’intervalle à 9 560 x g pendant 15 min à 4 ° C. Enfin, suspendre le culot dans eau ultra pure stérile de Type 1 à un final de l’OD₆₀₀ environ 30. Aliquotes des spores peuvent être stockées à-80 ° C pendant 8 semaines¹⁴.

2. décapage

1. Traiter les spores de PS4150 avec 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% sodium dodecyl sulfate (SDS) / 0,1 M le dithiothréitol (DTT) à 70 ° C pendant 1 h. laver les spores 10 fois avec stérilisé ultra pure Type 1 eau^15,16. Ce faisant, toute adsorbé sonde FM4-64 dans la membrane externe de spore et couches extérieures seront supprimés.

3. lamelle et préparation¹¹ (Timing : 1 H avant l’Observation)

1. Lamelles en pré nettoyage haute précision (voir Table des matières) avec du 1 HCl M pendant 30 min dans un bain d’eau secouer doucement. Laver les lamelles couvre-objet deux fois dans l’eau ultra pure Type 1 et rangez-les dans 100 % (vol/vol) EtOH. Laissez-les sécher et vérifier leur clarté avant utilisation. Un nettoyage préalable des lames de verre dans 70 % EtOH. Laissez-les sécher et vérifier leur clarté avant utilisation.

4. l’échantillonnage des microsphères fluorescentes ou Spores dans le cadre du gène diapositive¹⁰ (calendrier 15 Min)

1. Préchauffer les deux 70 % EtOH nettoyé et lames de verre séchées (voir Table des matières) de l’air pendant quelques secondes sur un bloc de chauffage de 70 ° C, déposer 65 μL de stérilisé 2 % d’agarose qui s’est tenue à 70 ° C au sommet d’une lame et placer l’autre lame de verre sur le dessus pour répandre l’agarose b ntre les diapositives. Le patch d’agarose sèche en environ 5 min.
2. Découpez le gel d’agarose dans une section de 1 x 1cm après avoir enlevé une des diapositives verre, ajouter 0,4 μL d’échantillon (microsphères fluorescentes ou spores de 10 ~8/ml) et transférer le patch sur la lamelle de haute précision en plaçant la lamelle sur le patch et glisser.
3. Fixer un gène Frame (1,5 x 1.6 cm², 65 µL) sur la lame séchée, sur lequel la lamelle est placée la fermeture de tous les coins du cadre, complétant ainsi la diapositive pour utilisation en microscopie.

5. imagerie^11,17(Timing : 1 H)

1. Capturer les images de transmission et de la fluorescence des spores ainsi qu’un mélange de rouge et de jaune-vert carboxylate-modification des microsphères fluorescentes sur un Microscope à éclairage structuré (voir Table des matières) équipée d’un 100 x (objective) huile Ouverture numérique = 1,49), un logiciel d’analyse CCD caméra et l’image (voir la Table des matières). Générer toutes les images à température ambiante sans la perturbation de la lumière ambiante. Veillez à toujours nettoyer 100 x objectif et la lame avec de l’éthanol 75 % avant l’imagerie.
2. Mettre l’accent sur des microsphères fluorescentes 100 nm (diamètre) et d’optimiser la fonction de point propagation (psf) en ajustant la bague de correction sur l’objectif 100 x jusqu'à l’obtention d’un psf symétrique, minimisant ainsi le flou de l’image. La psf est la réponse impulsionnelle ou la réponse d’un système d’imagerie à une source ponctuelle ou un objet point.
3. Sélectionnez un champ de vision avec des microsphères fluorescentes rondes environ 10. Appliquer une grille de concentrer l’ajustement pour les deux 561 nm et 488 longueurs d’onde nm excitation comme le guide pour le logiciel d’analyse de l’image.
4. Concentrer les spores avec la lumière de la transmission et de capturer une image lumineuse de transmission en mode moyenne 16 × 200 ms après exposition pour chaque image.
5. Capturer les images fluorescentes raw 3D-SIM des spores avec le mode d’éclairage « 3D-SIM », les paramètres de la caméra au mode de lecture électronique multipliant (EM) Gain 10MHz à 14 bits et le gain de EM à 175. Exciter la sonde FM4-64 dans les spores de PS4150 à 561 nm laser à la puissance de laser de 20 % et un temps d’illumination de 400 ms.
6. Exciter la GerKB-mCherry et des spores de GerD-GFP dans KGB80 avec, respectivement, 561 nm lumière laser à la puissance de laser de 30 % pour 1 s et 488 nm laser lumière à 60 % puissance du laser pour 3 s. Z-pile paramètres se trouvent dans le haut en bas mode, 0,2 µm / step, 7 étapes et 20 étapes pour germinosome et Analyse de l’IM, respectivement.
   Remarque : Ces paramètres de laser ont été appliqués afin d’assurer une luminosité maximale de la fenêtre d’histogramme d’environ 4 000.

6. reconstruire les Images Raw 3D-SIM de FM4-64 teinté PS4150 Spores

1. Effectuer la Reconstruction de tranche N-SIM FM4-64 colorées des données brutes des spores de PS4150. Cliquez sur le bouton de Param pour Reconstruire tranche sur la feuille d’onglet bloc N-SIM pour ouvrir la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM.
2. Définissez les paramètres de reconstruction dans la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM . Pour obtenir des images reconstituées parfaites, suivre la suggestion de la notice N-SIM et cliquez sur les contrôles appropriés dans la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM pour l' Illumination Modulation contraste (IMC) la valeur Auto, haute Suppression de bruit de résolution (HRNS) à 1,00 et Hors de la répression flou Focus (EF) à 0,05 comme points de départ.
3. Cliquez sur le bouton de Tranche de reconstruire dans la fenêtre de N-SIM tranche de Reconstruction pour reconstruire l’image. Évaluer la qualité des images reconstituées par les images de Fast Fourier transforme (FFT) et le score de reconstruction, qui affiche après reconstruction¹².
4. Régler le HRNS de 0.10 à 5.00 et ef de 0,01 à 0,50 en cliquant sur les contrôles appropriés dans la fenêtre N-SIM tranche Reconstruction jusqu'à obtient les meilleurs réglages de paramètre.
5. Cliquez sur le bouton appliquer dans la fenêtre de N-SIM tranche reconstruire pour appliquer les paramètres modifiés. Cliquez sur le bouton fermer pour fermer la fenêtre.
6. Faire un FM4-64 teinté PS4150 image raw spores active et cliquez sur le bouton Reconstituer tranche sur l’onglet Pad N-SIM pour exécuter la Reconstruction de la tranche. Enregistrez l’image reconstruite.

7. image Analysis

1. Convertir des images de Pseudo-Widefield de la germinosome de KGB80
   1. Convertir les images raw 3D-SIM de KGB80 Pseudo-Widefield images en activant d’un simple clic gauche le plugin ImageJ SIMcheck utilitaire Raw Data SI au Pseudo-Widefield¹². Pseudo-Widefield moyenne des images à partir des données brutes de SIM et assemble, à titre de comparaison, une image équivalente à widefield classiques éclairage¹². Pour ImageJ elle-même voir https://imagej.net/Welcome. Choisir au hasard les spores ~ 25 dans chaque image transmission inversée pour une analyse ultérieure de germinosome dans les images de Pseudo-Widefield fluorescents.
   2. Sélectionnez dans les spores KGB80 total environ 350 (dans cet exemple, 346) 14 champs de vision des deux lames. Le nombre de foyers fluorescents GerD-GFP et GerKB-mCherry dans les spores de KGB80 sélectionnés devrait être compté indépendamment par deux chercheurs. Le chercheur peut renvoyer les images raw 3D-SIM quand dans le doute de la présence de foyers distincts germinosome fluorescent dans les spores.
   3. Évaluer les intensités maximales de chaque concentration de GerD-GFP et GerKB-mCherry et de l’intensité intégrée d’image 3D de chaque spore KGB80 avec ImageJ.
2. Analyser les images de Pseudo-Widefield de la germinosome de KGB80
   1. Utiliser la valeur de moyenne intensité intégrée de 7 piles comme l’intensité du signal intégré de la spore KGB80. Déterminer les intensités de l’arrière-plan par imagerie de la souche de fond PS4150 à l’aide des paramètres identiques. Jugeaient taches fluorescentes dans les spores de KGB80 individuels germinosome foyers quand ils sont distinguent nettement de l’arrière-plan.
   2. Appliquer unidirectionnels ANOVA-essais pour la détermination de l’importance avec le logiciel origine 9.0. compte tenu des valeurs de P < 0,05 comme statistiquement significative. De grade coefficient de corrélation de Spearman¹⁸ permet d’évaluer la corrélation entre le nombre de foyers de GerD-GFP et GerKB-mCherry et les mesures de l’intensité du signal intégrée.

Results

Le protocole actuel présente une procédure d’imagerie de microscope SIM pour les spores bactériennes. Les procédures de préparation de la sporulation et la glissière ont été effectuées tel qu’indiqué dans la Figure 1 avant l’imagerie. Plus tard, les procédures d’imagerie et d’analyse ont été appliquées pour dim (protéine fluorescente étiqueté protéines de germination) et lumineux spore (sonde lipophiles coloré IM) échantillons comme indiqué dans le texte suiv...

Discussion

Le protocole présenté contient une procédure standard 3D-SIM pour l’analyse de FM4-64 teinté de spores de b. subtilis qui inclut la sporulation, préparation et processus d’imagerie. En outre, le protocole décrit une mis à jour le SIMcheck (ImageJ)-assistée des processus pour la microscopie SIM de b. subtilis spore germinosomes marqués avec des journalistes fluorescents d’imagerie 3D. Cette dernière procédure nous a permis d’observer cette sous-structure dim avec un contraste amélioré. En couplant deux e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lames en verre séché à l’air	Menzel Glä ; ser	630-2870
APO TIRF N20R8 objectif à huile 100× (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 &Delta ; gerE ::spc, &Delta ; cotE ::tet)
Erlenmeyer 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres Microsphères modifiées au carboxylate	Invitrogen, 0.1 &mu ; m	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz gradient de densité non ionique moyen	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 Caméra CCD	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Tubes microfuges 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Logiciel d’imagerie microscope	Nikon, Japon	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Eau déminéralisée ultrapure	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Microscope
Flacon à bouchon à vis en polypropylène 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
Lamelles de précision	Paul Marienfeld	117650
Tubes à fond rond 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Tubes à bouchon à vis 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM