Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

A K M Nawshad Hossian; Chandra Mohan Reddy Muthumula; Md. Sanaullah Sajib; Paul  E. Tullar; April  M. Stelly; Karen  P. Briski; Constantinos  M. Mikelis; George Mattheolabakis

doi:10.3791/59460

Article de méthode

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

DOI :

10.3791/59460

⸱

30 mars 2019

A K M Nawshad Hossian¹ , Chandra Mohan Reddy Muthumula¹ , Md. Sanaullah Sajib² , Paul E. Tullar³ , April M. Stelly¹ , Karen P. Briski¹ , Constantinos M. Mikelis² , George Mattheolabakis¹

¹School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, ²Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, ³Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

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miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Résumé

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Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.

miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Introduction

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Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique¹. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire². Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression³. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire⁴et CDK1 activation est essentielle pour la division cell....

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Protocole

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1. transfection miR-143 et miR-506

Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.

Cellules A549 NSCLC graines dans une assiette bien T25 cm²flacon/6/96, en milieu DMEM/F12K additionné de 10 % SVF et 1 % la pénicilline-streptomycine (milieux de culture) dans une hotte de cultu....

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Résultats

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Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse

Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe entre miRs individuels et a.......

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Discussion

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miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs aimerait remercier John Caskey à Louisiana State University pour son aide sur l’analyse de la voie des données de séquençage de l’ARN et l’Université du Texas Southwestern Medical Center, McDermott prochaine génération séquençage central pour effectuer l’analyse de données et de séquençage des RNA. Cette recherche a été financée par le collège de pharmacie, Université de la Louisiane Monroe fonds de démarrage et les National Institutes of Health (NIH) par le biais de l’Institut National de générale Medical Science subventions 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 de P20-15 s 1.

Remerciements

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Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
-80 ° ; C Congélateur	VWR	VWR40086A
96 puits	plaque CELLTREAT Scientific ;	50-607-511
Plaques à micropuits à 96 puits ; ;	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules	ATCC	ATCC ; CCL-185
Agarose	VWR	0710-25G
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent Technologies	G2938c
Silencieux Ambion Contrôle négatif n° 1 siRNA	Ambion	AM4611
Solution antibiotique-antimycosique (100x)	Gibco	15240-062 ; ;
Kit de dosage de réseau d’anticorps, 2 réactions	Full Moon Bio	KAS02
Microscope à champ clair ; ;	Microscopique ;	IV-900
Microscope à champ clair ; ;	New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 lames	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Étapes 5.14 ; 6.13 : Utilisé pour calculer la distribution de la population en fonction de la phase du cycle cellulaire et pour calculer la distribution de la population pour l’analyse de apoptose ;
Système temps réel CFX96		BioRad	CFX96
Système d’imagerie tactile Chemidoc Système d’imagerie		BioRad	Chemidoc
Incubateur de CO2	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex Facteur de croissance réduit Matrice de membrane basale	Trevigen	3433-010-01
Appareil photo numérique	AmScope ;	FMA050
DMEM 4,5 g/L de glucose, sans pyruvate de sodium, avec L-glutamine	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets	Eppendrof	05-403-152
Éthanol, absolu (200 proof), moléculaire Niveau de biologie, ;	Fisher BioReagents	BP2818500
Bromure d’éthidium	Alfa acar	L07462
F-12K Mélange de nutriments (Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine, Corning	Corning	45000-354
FACS Calibur Flowcytometer	Becton Dickinson
Sérum de veau fœtal - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal Sérum bovin (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes avec bouchons à pression standard	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Series II Water Jacket Incubateur CO2 Solution d’héparine	Thermo Scientific
(5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Système d’électrophorèse horixontal	Benchtop système de laboratoire	BT102
has-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire recombinant humain (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394 ; ;
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)	Donneurs individuels	IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen	Results : Used for bioinformatics Pathway
Analysis Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free	Distilled Water Invitrogen	10-977-015
Lipofectamine 2000 ;	Invitrogen	11-668-027
Teinture de chargement 10X	ward’s science+	470024-814
Medium M199 (avec Earle&prime ; sels de sodium, L-glutamine et bicarbonate de sodium)	Sigma Aldrich	M4530
Microscope Appareil photo numérique	AmScope ;	MU130
Modfit LT	Verity Software	Étape 5.15 : Logiciel alternatif pour l’analyse des distributions
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco by life technologies	31985-070
Pénicilline-streptomycine 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UP sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Iodure de propidium	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Scanner de microréseaux	Perkin elmer	ASCNPHRG. Nous avons utilisé la longueur d’onde du laser d’excitation à 543 nm.
q Couvercle adhésif optique PCR	Applied Biosystems	4360954
Kits d’ARN rapides	Zymo Research	R1055
Ribonuclease A à partir de pancréas bovin	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Étape 7.33 : Logiciel
Shaker	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
SpectraTube Tubes à centrifuger 15ml	VWR	470224-998
Tubes à centrifuger SpectraTube 50ml	VWR	470225-004
Tampon TBS, 20x liquide	VWR	10791-796
Centrifugeuse matchine à température contrôlée	Thermo Scientific	ST16R
Micro-centrifugeuse à température contrôlée matchine	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite Flacons traités pour la culture cellulaire	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96 puits à jupe complète	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso kit de synthèse d’ADNc (100 passages)	Thermo Scientific	AB1453B
Échelle à ADN ultra basse gamme	Invitrogen	10597012
VWR réfrigérateur de laboratoire à porte pleine standard	VWR

Module optique tactile de population du cycle cellulaired’analyse de microréseaux

Références

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Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
Malumbres, M., Barbacid, M.

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

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George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Mots-clés

Traitement par miARN r gulation du cycle cellulaire inhibition de l angiogen se cellules de cancer du poumon analyse de l expression g nique cytom trie en flux analyse par qPCR extraction d ARN protocole de transfection analyse par micropuces

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

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