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Article de méthode

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

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DOI :

10.3791/59460

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30 mars 2019

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1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Résumé

Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.

miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Introduction

Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique1. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire2. Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression3. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire4et CDK1 activation est essentielle pour la division cellulaire avec succès5. Plusieurs inhibiteurs de CDK ont été développés et évalués dans des essais cliniques au cours des dernières décennies, indiquant le potentiel du ciblage cdk2 dans le traitement du cancer. En fait, trois inhibiteurs de CDK ont été approuvés pour le traitement du cancer du sein récemment6,7,8,9,10. Ainsi, cdk2, et en particulier, la CDK1 et CDK4/6, sont d’un grand intérêt dans la régulation de la progression du cancer cell.

miARN (miRs) est petites, non codantes RNAs et régulateurs post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, régulation environ 30 % de tous les gènes humains11. Leur activité est basée sur la répression traductionnelle ou dégradation des ARN messagers (ARNm)12. Illustrant leur signification biologique, plus de 5 000 miARN ont été identifiées et une molécule de miRNA seul peut régler plusieurs gènes11,13. Plus important encore, miRNA expression a été associée à différentes maladies et les statuts de la maladie, y compris le cancer13. En fait, les miARN ont été caractérisées comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur, ayant la capacité à promouvoir ou à supprimer la tumeur développement et la progression de14,15. L’expression relative des miARN dans les tissus malades peut réguler la progression de la maladie ; ainsi, la tradition exogène des miARN a potentiel thérapeutique.

Cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer et plus grande que 60 % de tous les cancers du poumon non à petites cellules16,les cancers du poumon17, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 20 %18. L’utilisation de miR-143-3 p et p miR-506-3 a été récemment évaluée afin de cibler les cycles cellulaires de cellules du cancer du poumon11. miR-143 et miR-506 ont des séquences qui sont complémentarité CDK1 et CDK4/CDK6, et les effets de ces deux miRs sur cellules A549 ont été analysés. Les détails expérimentaux sont présentés et discutés dans cet article. L’expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l’apoptose ont été évalués à l’aide de différents protocoles expérimentaux et h après transfection. Nous avons utilisé des méthodes PCR (RT-qPCR) quantitatives en temps réel ainsi que l’analyse de microarray de mesurer l’expression de gènes spécifiques et séquençage de RNA de prochaine génération a servi à déterminer le gène global dysrégulation11. Cette dernière méthode identifie l’abondance relative de transcription de chaque gène avec la sensibilité élevée et de la reproductibilité, tandis que des milliers de gènes peuvent être analysés d’une seule analyse expérimentale. En outre, apoptotic analyse suite à un traitement miRNA a été réalisée et est décrite ici. Bio-informatique complété l’analyse de la voie. Présentées ici sont protocoles utilisés pour l’analyse de la thérapeutique potentielle de la combinatoire miR-143 et miR-506.

L’objectif principal du présent protocole est d’identifier les effets des miARN dans les cellules, en mettant l’accent sur le cycle cellulaire. La variété des techniques présentées ici qui s’étend de l’analyse de l’expression génique prétraduction (à l’aide de qPCR) chargé d’élaborer et de nouvelles techniques d’analyse de gène au niveau des protéines, telles que l’analyse microarray. Il est à espérer que ce rapport est utile pour les chercheurs intéressés à travailler avec les miARN. Par ailleurs, la méthodologie d’analyse en cytométrie en flux du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules est présenté.

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Protocole

1. transfection miR-143 et miR-506

Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.

  1. Cellules A549 NSCLC graines dans une assiette bien T25 cm2 flacon/6/96, en milieu DMEM/F12K additionné de 10 % SVF et 1 % la pénicilline-streptomycine (milieux de culture) dans une hotte de culture de tissus et incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus.
  2. Suspendre l’imite miR-143 et/ou miR-506 ou brouiller les siARN avec agent de transfection (2,4 µg de miR ont été mélangés avec 14 µL d’agent de transfection ; voir Table des matières) dans 500 µL de médias de transfection et 1,5 mL de sérum et sans antibiotique milieu DMEM/F12K à une concentration de miRNA final de 100 nM. miRNA montant peut exiger l’optimisation différentes cellules et concentrations. Des approches appropriées incluent la transfection de cellules avec une augmentation des concentrations de miRNA (c.-à-d., 50-200 nM) et l’évaluation de la diminution d’expression des gènes d’intérêt.
  3. Retirer des milieux de culture de fiole/plaque et laver une fois avec du PBS 1 x.
  4. Ajouter miRNA/scramble-transfectants des complexes agent et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 6 h (taille de ballon définit le volume ajouté d’incubation).
  5. Remplacer les médias avec 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pour 24h ou 48 h.
  6. Récolter les cellules transfectées par trypsinisation, en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA dans chaque fiole de2 cm T25, incuber pendant 5-10 min à 37 ° C et ajouter 3 mL de milieu de culture de récolter les cellules. Placez le contenu de chaque fiole dans un tube séparé, marqué 15 mL. Travailler sous une hotte de culture de tissus.
  7. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
    NOTE : Attention est nécessaire au moment du retrait de surnageant, comme de l’agitation du tube peut entraîner une perte de cellules.
  8. Ajouter 2 mL de solution 1 PBS x et centrifuger pendant 5 min à 751 x g.
  9. Répétez les étapes 7 et 8 fois pour éliminer toute trace de médias et surnageant.
    Remarque : À ce stade, tubes d’échantillons peuvent être conservés à-80 ° C ou peuvent être utilisés immédiatement.

2. extraction de l’ARN

  1. Nettoyer l’espace de travail par pulvérisation d’alcool isopropylique à 70 % et la solution de décontamination de RNAse.
  2. Extraction de l’ARN doit être effectuée à l’aide d’un ARN approprié nécessaire (voir la Table des matières).
  3. Retirer les tubes de-80 ° C et laissez-les décongeler. Ajouter 300 µL de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane des cellules.
  4. Ajouter un volume égal d’éthanol ultra purs à 100 %.
  5. Bien mélanger et placer dans la colonne de séparation.
  6. Centrifuger entre 11 et 16 g pendant 30 s et supprimer les intermédiaires.
  7. Ajouter 400 µL de tampon et centrifugeuse pour retirer le tampon de lavage.
  8. Ajouter 5 µL de la DNAse I 75 µl de la digestion de l’ADN de la mémoire tampon dans chaque échantillon et incuber pendant 15 min.
  9. Laver l’échantillon avec 400 µL de tampon de préparation de RNA.
  10. Laver 2 x avec tampon de lavage RNA.
  11. Ajouter l’eau exempte de nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillir l’ARN.
  12. Mesurer la concentration d’ARN totale avec un spectrophotomètre UV.

3. RT-qPCR

  1. Avant la RT-qPCR, synthèse de l’ADNc. À la suite de quantification de RNA de concentration, placer 1 µg d’ARN dans un volume final de 20 µL de réaction pour préparer des ADNc dans un tube PCR. Toujours travailler sur un banc propre.
  2. Tous les autres ingrédients nécessaires sont inclus dans le tableau 1.
IngrédientsQuantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
5 X cDNA Master mix4
dNTPs2
Hexamères aléatoire1
Rehausseur de RT1
Mélange enzymatique au verso1
Eau libre de DNase et RNaseQté nécessaire après l’ajout de RNA pour faire 20 µL

Tableau 1 : Matériaux pour la synthèse de cDNA d’échantillons d’ARN. Besoin de quantités d’ingrédients respectifs pour préparer un mélange maître pour un échantillon de la synthèse de cDNA.

  1. Incuber dans un thermocycleur avec les conditions de température suivantes : 42 ° C pendant 30 min ; 95 ° C pendant 2 min ; 4 ° C jusqu’au prélèvement d’échantillons.
  2. Utilisez immédiatement régulière PCR ou qPCR ou stocker des ADNc à-20 ° C.
  3. Préparer les solutions d’apprêt avant et arrière avec DNase/RNase-libre eau à une concentration de 10 µM de solution stock amorce.
  4. Préparer des mélanges maîtres distincts pour chaque gène être détectée, selon le nombre d’échantillons. Pour chaque échantillon d’ADNc (qPCR bien), la quantité de réaction est établie selon le tableau 2.
IngrédientsQuantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
Mix master SYBR10
Primer avant - 10 μM2
Reverse Primer - 10 μM2
Eau libre de DNase et RNase3
échantillon d’ADNc3

Tableau 2 : matériaux pour des PCR quantitative en temps réel provenant d’échantillons de cDNA. Nécessaire la quantité des ingrédients pour préparer un mélange maître pour un échantillon de qPCR.

  1. Placer chaque échantillon dans les puits respectifs.
  2. Concevoir le schéma prédéterminé pour la plaque 96 puits qPCR. Pour chaque échantillon et gènes analysés, effectuer la réaction dans la géométrie, ou au moins en doublons.
  3. Sceller la plaque 96 puits avec un couvercle optiquement transparent adhésif.
  4. Accès rapide-spin la plaque pour permettre le mélange réactionnel atteindre le fond de chaque puits.
  5. Exécutez RT-qPCR selon le gradient thermique suivant :
    1) 50 ° C pendant 2 min
    2) 95 ° C pendant 2 min
    3) 95 ° C pendant 15 s
    4) prendre la lecture
    5) 60 ° C pendant 1,5 min
    6) Répétez l’étape 3 pour 39 fois
  6. Exécutez le gradient thermique suivant dans le prolongement de ce qui précède afin de déterminer la courbe de fusion qui indique l’amplification monoproduit.
    7) 65 ° C pour 0,31 min
    0,5 ° C/cycle
    9) lecture de plaques
    10) Répétez l’étape 8 pour 60 fois jusqu'à 95 ° C
    11) 72 ° C pendant 2 min

4. gel d’agarose pour confirmer l’amplification génique unique

  1. Préparer un gel d’agarose de 1 % dans un tampon de x TBE 1.
  2. Ajouter le bromure d’éthidium (EtBr) en gel chaud (~ 50 ° C) jusqu'à obtenir une concentration finale d’environ 0,2 à 0,5 µg/mL. Bromure d’éthidium se lie avec l’ADN et lui permet d’être visible sous les rayons dans un imageur de gel UV.
  3. Verser chaud gel dans un plateau de gel fourni avec une boîte de gel d’électrophorèse. Fixer le peigne fourni étroitement pour puits uniformes.
  4. Laisser le gel au repos et laisser refroidir à température ambiante (RT) pendant environ 30 min.
  5. Lorsque le gel est solidifié, placer le gel et la barre d’état dans la boîte de gel.
  6. Remplir la boîte gel avec 1 x TBE tampon jusqu'à ce que le gel soit complètement recouvert.
  7. Mesurer la concentration de l’ADN de processus d’amplification PCR à l’aide d’un spectromètre UV.
  8. Prendre environ 15 ng d’ADN dans un petit tube PCR, ajouter 5 µL de colorant et ajouter la quantité nécessaire d’eau exempte de nucléase afin d’obtenir un volume total de 15 µL.
  9. Charger l’échelle d’ADN et des échantillons dans les puits.
  10. Exécutez le gel à 100 V jusqu'à ce que la ligne de colorant est environ 75 à 80 % vers le bas le gel.
    Remarque : Veillez à ce que le gel relie un négatif à charge positive.
  11. Retirer le gel et le placer dans l’imageur de gel pour visualiser l’ADN.

5. analyse de cycle de cellules

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de2 cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, puis de récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
  4. Centrifuger les échantillons à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
  7. Resuspendre et briser le culot en ajoutant 200 µL de PBS glacée 1 x par pipetage.
  8. Fixer les cellules en ajoutant 2 mL d’éthanol à 70 % et glacée goutte à goutte dans le tube tout en produisant des tourbillons doucement.
  9. Incuber les tubes pendant 30 min à RT et placer les tubes à 4 ° C pendant 1 h.
  10. Retirer les tubes de 4 ° C et centrifuger à 751 x g pendant 5 min.
  11. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  12. Ajouter 500 µL de solution de 1 PBS x avec l’iodure de propidium (50 µg/mL) et de la ribonucléase A (200 µg/mL)
  13. Incuber 30 min à ta tout en protégeant les échantillons de la lumière.
  14. Acquisition de données sur le cytomètre en flux. Utiliser avant vs diffusion latérale (FSC vs SSC) pour sélectionner la principale population de cellules, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche des clusters intrigue et cellule densité FSC vs SSC en haut en haut-droite de la courbe de densité FSC vs SSC.
  15. Analyser les données pour l’identification des populations de cellules par étape du cycle de la cellule avec un logiciel approprié.

6. dosage de l’apoptose

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de2 cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
  4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
  7. Diluer 10 x tampon de liaison annexine V à 1 x avec glacee dH2O.
  8. Ajouter 1 mL de 1 x tampon de liaison de l’annexine V dans chaque tube d’échantillon et resuspendre doucement.
  9. Suspension du lieu 96 µL des cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  10. Ajouter 1 µL de Annexin V-FITC conjugué et 12,5 µL de l’iodure de propidium (PI) dans le tube contenant la suspension cellulaire.
  11. Incuber la suspension cellulaire pendant 10 min sur la glace dans l’obscurité.
  12. Ajouter 250 µL glacée 1 x tampon de liaison Annexin V dans chaque tube d’échantillon pour diluer.
  13. Analyser des échantillons avec cytomètre en flux immédiatement.

7. expression de la protéine par anticorps cycle cellulaire microarray

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans des flacons de2 cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transfert des suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
  4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x.
  7. Ajouter 150 µL de tampon de lyse additionné d’inhibiteurs de la protéase. Pipette de haut en bas doucement pour perturber les membranes cellulaires.
  8. Pour éviter toute interférence de tampon de lyse, effectuer un échange tampon pour remplacer le tampon de lyse avec tampon de marquage, à l’aide de colonnes échange solvant du fabricant.
  9. Quantifier les protéines totales avec un dosage BCA.
  10. Prenez 70 µg d’échantillon de protéine et ajouter pour obtenir un volume final de 75 µL de tampon étiquetage.
  11. Ajouter 100 µL de diméthylformamide (DMF) à 1 mg de réactif de biotine (biotine/DMF).
  12. Ajouter 3 µL de la biotine/FMM dans chaque échantillon de protéine (échantillon de protéine biotinylé) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
  13. Ajouter 35 µL de réactif de stop et mélanger au vortex.
  14. Incuber les échantillons à RT pendant 30 min.
  15. Enlever les lames microarray du réfrigérateur pour qu’ils réchauffent à RT pendant 1 h avant utilisation.
  16. Effectuer un blocage pour les liaisons non spécifiques en incubant les lames avec une solution de lait sec 3 % (en bloquant réactif fournie par le fabricant) dans une boîte de pétri avec agitation continue pendant 45 min à température ambiante.
  17. Laver les lames avec de l’eau2O ddH (sauf indication contraire, le lavage se déroule avec FD2O).
  18. Répétez l’étape de lavage ~ 10 x pour supprimer complètement la solution de blocage des surfaces de glissement. C’est important d’obtenir un arrière-plan uniform et faible.
  19. Enlever l’eau excessive des surfaces slide et passez à l’étape suivante sans laisser les diapositives à sec.
  20. Préparer la solution de couplage en dissolvant le lait sec 3 % dans un réactif de couplage.
  21. Ajouter 6 mL de la solution de couplage et de la quantité totale de l’échantillon de protéines biotinylées préalablement préparée à l’étape 7.12.
  22. Place une diapositive dans un puits de la chambre de couplage fournis par le vendeur et ajouter environ 6 mL de protéine mélange de couplage pour elle.
    Remarque : Veiller à ce que la diapositive soit totalement immergée en protéines mélange solution de couplage.
  23. Couvrir la chambre de couplage et incuber pendant 2 heures au RT avec agitation continue dans un agitateur orbital.
  24. Transférer les lames à une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de 1 x tampon de lavage. Placez la boîte de pétri en agitateur orbital, agiter pendant 10 min et jetez la solution.
  25. Répétez l’étape 7,24 2 x.
  26. Rincer les lames avec de l’eau2O ddH intensivement comme décrit aux étapes 7.17 et 7.18 et passez à l’étape suivante immédiatement pour éviter le séchage.
  27. Ajouter 30 µL de streptavidine-Cy3 (0,5 mg/mL) dans 30 mL de tampon de détection.
  28. Placez la diapositive dans une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de tampon de détection contenant streptavidine-Cy3.
  29. Incuber dans un agitateur orbital pendant 20 min avec agitation continue protégée de la lumière.
    NOTE : Cy-3 est un colorant fluorescent. Couvrir avec du papier aluminium ou fonctionnent dans des conditions sombres pour maintenir l’intensité de la fluorescence.
  30. Procédez comme 7.24-7,26 et laisser la lame sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de la diapositive dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 1300 x g pendant 5-10 min.
  31. Placez la lame dans porte-lames et recouvrir de papier d’aluminium.
  32. Scan de la lame dans un scanner de microarray les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Dans le cas de Cy3, le pic de longueur d’onde d’excitation est à ~ 550 nm et émission maximum à ~ 570 nm.
  33. Analyser les données (voir la Table des matières) pour le logiciel utilisé).

8. séquençage de RNA

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans des flacons de2 cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
  4. Extrait de RNA conformément à l’article 2, étapes 1-6.
  5. Vérifier la qualité de RNA ainsi que la concentration avec une bioanalyzer. Une intégrité de RNA score (RIN) supérieur à huit et échéant histogrammes sont nécessaires pour confirmer la qualité de la RNA.
  6. À partir de l’ARN total, utilisez ~ 2 µg de l’échantillon pour l’ARN (ARN messager de l’ARN total) le séquençage
  7. Séquence à l’aide d’un séquenceur de prochaine génération11.
  8. Exécuter le parage de qualité et carte avec un génome de référence de FASTQ les fichiers générés à partir de l’ARN séquençage machine11.
  9. Télécharger des fichiers FASTQ et cru lire les données de comptage à la banque de gènes, suivant les instructions de la < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> site.
    Remarque : Voir numéro SRP133420 pour les résultats antérieurs.

9. test de formation tube

  1. Évaluer le potentiel angiogénique de veine ombilicale humaine transfectées miRNA cellules endothéliales (HUVEC) 36 h après la transfection, tel que décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5, à l’aide de cellules HUVEC au lieu de cellules A549.
  2. Affamer HUVECs avec médias famine M199 pendant 4 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  3. Supprimer le facteur de croissance réduite matrice de la membrane basale de-80 ° C et conserver à 4 ° C durant la nuit, permettant à un dégel progressif afin d’éviter la polymérisation et la formation de bulles.
  4. Soigneusement et lentement recouvrir le puits d’une plaque 96 puits en 0,04 mL de matrice de membrane basale de facteur de croissance réduite, en évitant la formation de bulles. Effectuer l’ensemble de la procédure sous une hotte à flux laminaire.
  5. Remplir les puits adjacents de la plaque 96 puits avec 0,1 mL de PBS, afin de maintenir l’humidité et protéger la température.
  6. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant au moins 20 min pour que la polymérisation de l’extrait de la membrane basale est atteint. Pas incuber pendant plus de 1 heure.
  7. Trypsinize transfectées HUVECs de chaque groupe et remettre en suspension en milieu M199 à une concentration de 1 x 105 cellules/mL.
  8. Ajouter 0,1 mL de chaque suspension de cellules dans les puits contenant la matrice des membranes basales polymérisé dans la plaque 96 puits.
  9. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant que la préparation des facteurs de croissance se déroule. Préparation des facteurs de croissance se fait sous la hotte à flux laminaire.
  10. Reconstituer les facteurs de croissance (VEGF) à 2 x la concentration finale souhaitée (concentration de 4 ng/mL pour la concentration finale de 2 ng/mL) et ajouter 0,1 mL de milieu de famine M199 contenant du facteur de croissance sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules. Pour les puits non traitées VEGF, ajouter 0,1 mL de milieu famine M199 sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules.
  11. Incuber la plaque 96 puits pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  12. À la fin de la période d’incubation, obtenir des images de chaque puits avec un grossissement x 4, à l’aide d’un microscope à fond clair connecté avec un appareil photo numérique.
  13. Traiter des images avec le logiciel équipé d’un plug-in « angiogenèse analyzer »19. Trois paramètres, le nombre de nœuds, le nombre de jonctions et longueur totale sprout, permet de comparer les effets du traitement miRNA sur l’angiogenèse.

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Résultats

Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse

Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe entre miRs individuels et a...

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Discussion

miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs aimerait remercier John Caskey à Louisiana State University pour son aide sur l’analyse de la voie des données de séquençage de l’ARN et l’Université du Texas Southwestern Medical Center, McDermott prochaine génération séquençage central pour effectuer l’analyse de données et de séquençage des RNA. Cette recherche a été financée par le collège de pharmacie, Université de la Louisiane Monroe fonds de démarrage et les National Institutes of Health (NIH) par le biais de l’Institut National de générale Medical Science subventions 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 de P20-15 s 1.

Remerciements

Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-80 ° ; C CongélateurVWRVWR40086A
96 puitsplaque CELLTREAT Scientific  ;50-607-511
Plaques à micropuits à 96 puits  ;   ;Thermo Scientific12-556-008
A549 Cellules cancéreuses du poumon non à petites cellulesATCCATCC  ; CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Bioanalyseur Agilent 2100Agilent TechnologiesG2938c
Silencieux Ambion Contrôle négatif n° 1 siRNAAmbionAM4611
Solution antibiotique-antimycosique (100x)Gibco15240-062  ;   ;
Kit de dosage de réseau d’anticorps, 2 réactionsFull Moon BioKAS02
Microscope à champ clair  ;   ;Microscopique  ;IV-900
Microscope à champ clair  ;   ;New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 lamesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceÉtapes 5.14 ; 6.13 : Utilisé pour calculer la distribution de la population en fonction de la phase du cycle cellulaire et pour calculer la distribution de la population pour l’analyse de apoptose  ;
Système temps réel CFX96BioRadCFX96
Système d’imagerie tactile Chemidoc Système d’imagerieBioRadChemidoc
Incubateur de CO2Thermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Facteur de croissance réduit Matrice de membrane basaleTrevigen3433-010-01
Appareil photo numériqueAmScope  ;FMA050
DMEM 4,5 g/L de glucose, sans pyruvate de sodium, avec L-glutamineVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
Éthanol, absolu (200 proof), moléculaire Niveau de biologie,  ;Fisher BioReagentsBP2818500
Bromure d’éthidiumAlfa acarL07462
F-12K Mélange de nutriments (Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Sérum de veau fœtal - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Sérum bovin (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes avec bouchons à pression standardFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II Water Jacket Incubateur CO2 Solution d’héparineThermo Scientific
(5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Système d’électrophorèse horixontalBenchtop système de laboratoireBT102
has-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire recombinant humain (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  ;   ;
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)Donneurs individuelsIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults : Used for bioinformatics Pathway
Analysis Invitrogen UltraPure DNase/RNase-FreeDistilled Water Invitrogen10-977-015
Lipofectamine 2000  ;Invitrogen11-668-027
Teinture de chargement 10Xward’s science+470024-814
Medium M199 (avec Earle&prime ; sels de sodium, L-glutamine et bicarbonate de sodium)Sigma AldrichM4530
Microscope Appareil photo numériqueAmScope  ;MU130
Modfit LTVerity SoftwareÉtape 5.15 : Logiciel alternatif pour l’analyse des distributions
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Pénicilline-streptomycine 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Iodure de propidiumMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Scanner de microréseauxPerkin elmerASCNPHRG. Nous avons utilisé la longueur d’onde du laser d’excitation à 543 nm.
q Couvercle adhésif optique PCRApplied Biosystems4360954
Kits d’ARN rapidesZymo ResearchR1055
Ribonuclease A à partir de pancréas bovinSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerÉtape 7.33 : Logiciel
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube Tubes à centrifuger 15mlVWR470224-998
Tubes à centrifuger SpectraTube 50mlVWR470225-004
Tampon TBS, 20x liquideVWR10791-796
Centrifugeuse matchine à température contrôléeThermo ScientificST16R
Micro-centrifugeuse à température contrôlée matchineEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Flacons traités pour la culture cellulaireThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96 puits à jupe complèteThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso kit de synthèse d’ADNc (100 passages)Thermo ScientificAB1453B
Échelle à ADN ultra basse gammeInvitrogen10597012
VWR réfrigérateur de laboratoire à porte pleine standardVWR
Module optique tactile de population du cycle cellulaired’analyse de microréseaux

Références

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

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