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Article de méthode

Traitement par rayonnement des cultures organotypiques de modèles de glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides clés caractéristiques in vivo

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DOI :

10.3791/59484

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17 mai 2019

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1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

Dans cet article

Résumé

L’utilisation de cultures organotypiques tridimensionnelles pour visualiser la morphologie et les marqueurs fonctionnels des glandes salivaires peut donner de nouvelles perspectives sur les mécanismes des lésions des tissus après rayonnement. Décrit ici est un protocole à la section, culture, irradier, tache, et l’image des sections de glande salivaire d’épaisseur 50 – 90 μM avant et après l’exposition aux rayonnements ionisants.

Résumé

L’hyposalivation et la xérostomie créent des complications orales chroniques qui diminuent la qualité de vie chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou qui sont traités par radiothérapie. Les approches expérimentales de la compréhension des mécanismes du dysfonctionnement et de la restauration des glandes salivaires se sont concentrées sur des modèles in vivo, qui sont handicapés par l’incapacité de dépistage systématique des candidats thérapeutiques et d’efficacité dans la transfection capacité à manipuler des gènes spécifiques. Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Nous avons utilisé la coloration immunofluorescente et la microscopie confocale pour déterminer quand des populations de cellules et des marqueurs spécifiques sont présents au cours d’une période de culture de 30 jours. En outre, les marqueurs cellulaires précédemment rapportés dans les modèles de rayonnement in vivo sont évalués dans les cultures qui sont irradiées ex vivo. Pour aller de l’avant, cette méthode est une plate-forme attrayante pour l’évaluation ex vivo rapide des réponses tissulaires de la glande salivaire et humaine aux agents thérapeutiques qui améliorent la fonction salivaire.

Introduction

La fonction de glande salivaire appropriée est essentielle à la santé bucco-dentaire et est altérée après le traitement du cancer de la tête et du cou avec la radiothérapie1. En 2017, près de 50 000 nouveaux cas de cancer de la tête et du cou ont été signalés aux États-Unis2. En raison des effets nocifs tissulaires et souvent irréversibles de la radiothérapie sur les tissus normaux environnants tels que les glandes salivaires, les patients sont souvent laissés avec des effets secondaires sévères et une qualité de vie diminuée2,3, 4. les autres. Les complications courantes causées par les radiations se manifestent par des symptômes tels que la xérostomie (le sentiment subjectif de la bouche sèche), les caries dentaires, la capacité altérée de mâcher et d’avaler, les troubles de la parole et les microbiomes oraux infectés2, 3 les trois , 4. ces symptômes collectivement peuvent conduire à la malnutrition et à la survie altérée chez les personnes touchées5. Alors que le dysfonctionnement de la glande salivaire dans cette population a été bien documenté, les mécanismes sous-jacents de dommages aux cellules acineuses ont été contestés, et il y a peu d’intégration parmi les différents modèles animaux6,7.

Les méthodes actuelles d’étude de la fonction des glandes salivaires et des dommages induits par les radiations comprennent l’utilisation de modèles in vivo, de lignées cellulaires immortalisées, de cultures de cellules primaires bidimensionnelles (2d) et de cultures tridimensionnelles (3-D) de salisphères8, 9,10,11,12. Traditionnellement, les modèles de culture cellulaire des lignées cellulaires immortalisées et des cultures 2D impliquent des cellules monocouches cultivées sur des surfaces planes et sont précieuses pour une expérimentation rapide, facile et rentable. Cependant, les conditions de culture de cellules artificielles peuvent altérer l’état de différenciation et les réponses physiologiques des cellules exposées à diverses conditions, et les résultats ne parviennent souvent pas à se traduire en modèles d’organismes entiers14,15. En outre, les cultures cellulaires immortalisées nécessitent une modulation de l’activité de la culture, ce qui est essentiel pour la réponse de la glande salivaire aux dégâts de l’ADN16,17.

les cultures de salisphères 3-D sont enrichies pour les cellules souches et progénitrices aux premiers moments de la culture et ont été utiles pour comprendre la radiosensibilité de ce sous-ensemble de cellules de glandes salivaires9,18. Une limitation critique de tous ces modèles de culture est qu’ils sont inefficaces dans la visualisation de la structure 3D de la glande salivaire, y compris la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule sur diverses couches, qui sont cruciales dans la modulation salivaire la sécrétion15. La nécessité d’une méthode qui englobe le comportement du tissu dans son ensemble, mais peut également être manipulé dans des conditions de laboratoire pour étudier les effets du traitement est nécessaire pour découvrir plus loin les mécanismes sous-jacents de la glande salivaire induite par rayonnement dysfonction.

La culture et la sectionnement des tissus vivants ont été documentées antérieurement19,20 et sont souvent utilisées pour étudier les interactions cerveau-tissu21. Dans des études antérieures, le tissu de la glande salivaire parotide (PAR) des souris a été sectionné à environ 50 μM et cultivé jusqu’à 48 h, et l’analyse de la viabilité, de la mort cellulaire et de la fonction a été effectuée par la suite19. Su et coll. (2016) a élargi cette méthodologie en cultivant les glandes sous-mandibulaires humaines (SMGs) sectionnées à 35 μm ou 50 μM pendant 14 jours20. La méthode proposée est une avancée en ce qu’elle comprend à la fois les glandes salivaires parotidiques et sous-mandibulaires sectionnées à 50 μM et 90 μm et l’évaluation des cultures pendant 30 jours. La capacité de couper une gamme d’épaisseur tissulaire est importante dans l’évaluation des interactions cellule-cellule et cellules-ECM qui sont pertinentes pour les processus cellulaires, y compris la polarité apical-basolatérale et l’innervation pour la sécrétion. En outre, les tranches de glandes salivaires ont été irradiées alors qu’elles étaient en culture pour déterminer la faisabilité de ce modèle de culture pour étudier les dommages causés par la glande salivaire induite par le rayonnement.

Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Pour déterminer les sections de temps maximales qui sont viables post-dissection, coloration bleu trypan, coloration des cellules vivantes, et la coloration immunohistochimique pour la mort cellulaire ont été effectuées. La microscopie confocale et la coloration immunofluorescente ont été utilisées pour évaluer les populations cellulaires spécifiques, les structures morphologiques et les niveaux de prolifération. Les cultures des sections tissulaires ont également été exposées à des rayonnements ionisants pour déterminer les effets du rayonnement sur divers marqueurs dans ce modèle 3D. L’induction de la mort cellulaire, la perturbation du cytosquelette, la perte de marqueurs de différenciation et la prolifération compensatoire dans les cultures ex vivo irradiées ont été comparées à des études antérieures de modèles in vivo. Cette méthodologie fournit un moyen d’étudier le rôle des interactions cellulaires-cellules suite aux dommages causés par les radiations et fournit un modèle expérimental pour évaluer efficacement l’efficacité des interventions thérapeutiques (manipulations géniques ou agents pharmacologiques ) qui peuvent être moins adaptés aux modèles in vivo.

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Protocole

1. préparation du vibratome

  1. Vaporisez des composants détachables du vibratome, y compris le plateau tampon, l’attachement de la lame, le moule de bloc d’d’agarose, et le film de laboratoire avec 70% d’éthanol, puis stériliser UV pendant au moins 30 min.
  2. Placez et fixez une feuille supplémentaire de film de laboratoire sur le plateau de tampon pour empêcher la glace de tomber dedans.
  3. Remplissez la chambre de glace avec de la glace pilée, enlevez le film de laboratoire du plateau de tampon, et remplissez le plateau de tampon avec 100 mL de solution saline de sérum de phosphate de glace-froid 1x (PBS) complétée avec 1% de pénicilline-streptomycine-ampicilline (PSA).
  4. Placez une lame de rasoir en acier inoxydable dans le porte-lame. Utilisez le tournevis pour serrer/desserrer et changer l’angle de la lame.

2. préparation de l’échantillon de tissu dans le bloc d’d’agarose et sectionnement en utilisant le vibratome

  1. Autoclaver tous les outils de dissection et de sectionnement nécessaires, y compris forceps, ciseaux, et pinceaux.
  2. Préparer 3% d’d’agarose de point de fusion faible dans le PBS 1x stérile et le micro-ondes jusqu’à ce que l’d’agarose se dissout en solution. S’assurer que la solution ne se fait pas bouillir et agiter périodiquement la bouteille pour la mélanger.
    Remarque: empêchez l’d’agarose à faible fusion de se solidifier en le gardant dans un bain d’eau tiède. L’d’agarose à faible fonte est fluide à 37 ° c et se fixe à 25 ° c. Cependant, le bain d’eau doit être inférieur à 40 ° c afin de verser l’d’agarose autour du tissu à température physiologique.
  3. Isoler les glandes salivaires et placer le tissu disséqué dans 2 mL de glace froide 1x PBS complétée par 1% de PSA dans un plat de culture stérile de 30 mm.
  4. En utilisant des pinces autoclavées, retirer les glandes salivaires de 1x PBS + 1% solution PSA et la position au fond d’un moule d’incorporation. Remplissez le moule avec du liquide 3% de point de fusion faible d’agarose pour couvrir le tissu.
  5. À l’aide de la pince, ajustez le tissu au milieu du bloc et positionnez la glande salivaire dans le plan approprié. Les meilleures coupes transversales pour les glandes sous-mandibulaires et parotides se trouvent dans le plan vertical.
  6. Placer le bloc d’d’agarose sur la glace pendant 10 min pour durcir.
  7. Faites soigneusement tourner une lame de rasoir autour du bord extérieur de l’d’agarose pour desserrer et laisser le bloc glisser sur le film de laboratoire stérilisé UV de l’étape 1,1.
  8. Utilisez une lame de rasoir pour découper une boîte d’d’agarose contenant la glande salivaire. Assurez-vous que le plan de la section est droit et parallèle au côté opposé du bloc (la surface qui sera collée vers le bas). Puisque l’d’agarose n’infiltrent pas le tissu, ne coupez pas trop d’d’agarose autour du tissu ainsi le tissu sera bien soutenu.
  9. Utilisez de la colle superglue pour attacher le bloc à la surface de coupe.
  10. Section à 50 μM ou 90 μM d’épaisseur par vibratome à une vitesse de 0,075 mm/s et une fréquence de 100 Hz.
    Remarque: le réglage du vibratome à la fréquence la plus élevée et la vitesse de la lame la plus basse fournit les tranches les plus optimales.
  11. Recueillir des sections dans un plat de culture de tissus de 24 puits contenant ~ 1 mL de PBS glacé par puits à l’aide d’un pinceau à poils naturels autoclavés, en plaçant la brosse dans 70% d’éthanol entre les collections de tranches pour maintenir la stérilité.

3. les sections culturing

  1. Autoclave une micro-spatule et forceps.
  2. Faire des milieux de culture de vibratome de stock avec ou sans sérum bovin fœtal (FBS): DMEM/F12 milieux additionnés de 1% PSA, 5 μg/mL de transferrine, 1,1 μM d’hydrocortisone, 0,1 μM d’acide rétinoïque, 5 μg/mL d’insuline, 80 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 5 mM de 50 L sulfate de gentamicine et 10 μL/mL de mélange d’oligo-éléments. Ajoutez une quantité appropriée de FBS pour faire 0%, 2,5%, 5,0%, ou 10% solutions.
  3. Avant la coupe, ajouter 300 μL de milieu préchauffé et placer un insert de 12 mm de diamètre, 0,4 μm de dimension interstitielle dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Les médias doivent atteindre le fond de la membrane pour créer une interface air-liquide pour la culture.
  4. Poser délicatement les sections salivaires au-dessus de l’insert membranaire à l’aide de la micro-spatule et de la culture à 37 ° c dans un incubateur humidifié à 5% CO2 et 95% air atmosphère.
    1. Ajouter environ 300 μL de milieu de culture primaire dans le puits et quelques gouttes dans les inserts membranaires (environ 40 μL) tous les deux jours ou selon les besoins. Une culture appropriée a montré que les cellules sont capables de survivre et d’être maintenues jusqu’à 30 jours ex vivo.

4. irradiation des sections de la glande salivaire

  1. Traiter les sections avec une seule dose de rayonnement (5 Gy) à l’aide de l’irradiateur cobalt-60 (ou équivalent).
    1. Sections de transport à l’installation d’irradiateur à l’aide d’un récipient de styromousse recouvert pour éviter les fluctuations de température. En outre, les soins doivent être pris pendant le transport de nouveau à l’incubateur de laboratoire pour s’assurer que les médias n’éclaboussent pas sur le couvercle de culture et induisent la contamination.
    2. Placer la plaque de 24 puits contenant les sections de la glande salivaire à 80 cm de la source de rayonnement, au centre d’un champ de rayonnement de 32 "x 32". Les calculs de dose de rayonnement et le temps correspondant dans l’irradiateur varient selon l’instrument et la désintégration du cobalt-60.
  2. Continuer à surveiller et à cultiver ces sections comme décrit à la section 3.

5. coloration de la viabilité

  1. Aspirer les vieux médias et laver les tranches deux fois avec du PBS 1x stérile et pré-chauffé.
  2. Sections de teinture avec colorant bleu trypan.
    1. Utilisez une micro-spatule pour déplacer la tranche de la culture à une glissière en verre.
    2. Ajouter 0,4% de solution de bleu trypan à la tranche de vibratome avec suffisamment de volume pour couvrir le tissu (10 – 20 μL).
    3. Incuber les tranches à température ambiante (RT) dans le bleu trypan pendant 1 – 2 min pour que le colorant pénètre dans le tissu. Les cellules non viables seront colorées en bleu, et les cellules viables seront non colorées.
  3. Sections de teinture avec calcéine, colorant de cellules vivantes AM.
    1. Ajouter suffisamment de volume de tache pour recouvrir la section dans un puits d’une plaque de 24 puits (200 – 300 μL).
    2. Incuber les tranches à RT pendant 15 min pour permettre la pénétration de colorant.
    3. Retirez délicatement la section du puits et placez-la sur une glissière en verre. Montez les tranches avec 1 goutte de support de montage.
    4. Sections d’image sur un microscope fluorescent à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 488 nm et 515 nm.

6. coloration des anticorps des sections vibratomes

NOTE: ce qui suit fournit un protocole général de coloration d’anticorps spécifique pour le Ki-67; Cependant, ce protocole peut être utilisé avec n’importe quel anticorps. Tous les lavages sont effectués à RT, sauf indication contraire.

  1. Dans le plat de culture de tissus multi-puits, aspirer les médias et laver au moins 2x avec le PBS 1x stérile.
  2. Fixer les sections en utilisant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit à 4 ° c.
  3. Aspirer 4% PFA et laver 3x avec PBT [1x PBS, 1% albumine de sérum bovine (BSA), 0,1% Triton X-100].
    Remarque: les sections peuvent être stockées dans 1x PBS à 4 ° c et colorées ultérieurement. Le temps de stockage maximal testé dans ce manuscrit était de 3 semaines. Une durée de stockage plus longue devra être optimisée par l’utilisateur individuel si cela est souhaité.
  4. Perméabilize sections utilisant 0,3% Triton X-100 en 1x PBS pendant 30 min.
    Remarque: cette étape peut être modifiée et optimisée pour la coloration et la perméabilization spécifiques des anticorps.
  5. Solution de perméabilization de Pipet OFF.
  6. Laver les tranches 3x pendant 5 min avec 1x PBS, 1% BSA, et 0,1% Triton X-100 (PBT).
  7. Bloquez les tranches avec un agent bloquant avec 1% de sérum de chèvre normal pendant 1 h.
  8. Laver les tranches 3x pendant 5 min avec PBT.
  9. Incuber les tranches pendant la nuit à 4 ° c avec 500 μL d’anticorps monoclonal de lapin anti-KI67 dilué dans 1% de BSA dans 1x PBS.
    Remarque: pour la coloration de la phalloidine, sautez l’étape 6,9 et continuez à utiliser le protocole pour la phalloidine spécifique utilisée. Pour la contre-tache d’ADN, passez à l’étape 6,15.
  10. Aspirate anticorps monoclonal de lapin anti-KI67.
  11. Laver les tranches 6x pendant 5 min en 1x PBS.
  12. Incuber les tranches dans 500 μl d’anticorps secondaires conjugués fluorescent compatibles avec l’anticorps anti-KI67 dilué dans 1% de BSA dans 1x PBS à RT pour 1,5 h recouvert de lumière.
    Remarque: en fonction de l’anticorps secondaire utilisé, le temps d’incubation avec l’anticorps secondaire peut être optimisé par l’utilisateur individuel. En outre, l’anticorps secondaire est sensible à la lumière. Tous les lavages ultérieurs doivent être exécutés dans l’obscurité.
  13. Anticorps secondaire d’aspirate.
  14. Lavez les tranches pour 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
  15. Laver les tranches pendant 5 min dans de l’eau désionisée.
  16. Les tranches de contre-tache avec DAPI (1μg/mL) pendant 20 min à RT.
  17. Lavez les tranches (une fois) pendant 5 min dans de l’eau désionisée.
  18. Monter les tranches avec une goutte (~ 40 μL) de support de montage. Pour éviter les excès de bulles, placer lentement la bavette sur le support de montage sur la glissière, en commençant par un angle de 45 °.
    1. Pour éviter d’écraser les sections épaisses avec la lamelle, montez chaque tranche avec une entretoise. Une entretoise peut être créée en plaçant une jante de graisse sous vide dans un carré autour de la section tissulaire.
    2. Lors de la pose de la lamelle, les bords de la lamelle peuvent être scellés avec de la graisse sous vide. Appuyez sur les bords de la lèvre avec votre pouce pour l’adhérer fermement sur la glissière. Vous pouvez également sceller la bavette sur la glissière du microscope à l’aide d’un vernis à ongles transparent.

7. sections de vibratome d’imagerie

  1. Image les diapositives colorées dans les 5 jours de coloration.
  2. Obtenir des sections optiques des tranches vibratomes colorées à l’aide d’un microscope confocale. Avec un microscope confocale, obtenir une pile z à une taille de pas définie ou prendre des images individuelles en fonction de la conception expérimentale de l’utilisateur. Les images peuvent être examinées sur n’importe quel écran d’ordinateur après la collecte confocale.
    NOTE: en raison de l’épaisseur des tranches de vibratome, il est recommandé qu’un microscope confocale ou une portée avec la capacité z-Stack soit utilisé pour visualiser les détails dans les échantillons. Pour les images utilisées dans ce manuscrit, un objectif d’huile de 63X a été utilisé; Toutefois, cela peut être adapté et modifié par l’utilisateur individuel et la portée spécifique utilisée. La résolution de pixel recommandée pour chaque objectif et facteur de zoom avec l’échantillonnage présumé de Nyquist de 2,5 pixels en X et Y pour la plus petite structure optiquement résolvable a été utilisée. Cependant, certains commentateurs suggèrent 2,3 pixels, tandis que d’autres suggèrent 2,8 pixels. Veuillez consulter le manuel de microscopie confocale biologique22 pour plus de détails sur la façon de faire ces calculs.

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Résultats

Les cultures primaires 2D sont cultivées dans des milieux additionnés de sérum bovin (FBS), tandis que la culture des salisphères 3-D primaires est généralement cultivée dans des conditions exemptes de sérum10,11. En outre, les deux études antérieures utilisant des cultures de vibratome des glandes salivaires ont cultivé leurs sections dans 0% ou 10% FBS additionnés de medias19,...

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Discussion

La recherche sur les glandes salivaires a utilisé un certain nombre de modèles de culture, y compris des cultures 2-D immortalisées, des cultures 2-D primaires, des cultures de salisphères 3-d et des cultures d’organes 3-D issues d’explants embryonnaires pour déterminer les questions sur la biologie et la physiologie sous-jacentes. Ces modèles de culture ont donné des informations perspicaces dans un éventail varié de questions de recherche et continueront d’être des outils importants dans la recherche salivaire. Les lim...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été appuyé en partie par le financement pilote fourni par l’Université de l’Arizona Bureau de la recherche et de la découverte et instituts nationaux de la santé (R01 DE023534) à Kirsten Limesand. La bourse de formation en biologie du cancer, T32CA009213, a fourni un soutien à l’allocation pour Wen Yu Wong. Les auteurs aimeraient remercier M. Rice pour sa précieuse contribution technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vibratome VT1000SLeica BiosystemsN/AVibratome pour le sectionnement Lames de
rasoir en acier inoxydable à double tranchantMicroscopie électronique Sciences72000
AgaroseFisher ScientificBP165-25Parafilm à bas point de fusion
Sigma-AldrichP6543
Pénicilline-Streptomycine-Amphotéricine BLonza17-745HPSA
24 puitsPlaque CellTreat229124
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SuperglueLoctiteN/AAcheté à la quincaillerie
Natural Red Sable Round PaintbrushPrinceton Art & Brush Co7400R-2
Sulfate de gentamicineFisher ScientificICN1676045
TransferrineSigma-AldrichT-8158-100mg
L-glutatmineGibco25030-081
MP BiomedicalsICN1676549
InsulineFisher Scientific12585014
Facteur de croissance épidermiqueCorning354001
HydrocortisoneSigma-AldrichH0888
Acide rétinoïqueFisher ScientificR2625-50MG
Sérum de bovin fœtalGibcoA3160602
DMEM/F12 MilieuCorning150-90-CV
Insert de culture cellulaire MilliporeSigmaPICM0125012 mm, taille de pores de 0,4 μm pour plaque à 24 puits
0,4 % Trypan BlueSigma-AldrichT8154
Kit d’imagerie cellulaire LIVE/DEAD (488/570)Thermo-FisherR37601Composant de colorant LIVE uniquement utilisé
de signalisation cellulaire d’anticorpsAnti-Ki-679129S
signalisation cellulaire d’anticorpsanti-E-cadhérine3195S
Anticorps anti-clivage Caspase-3Technologie de signalisation cellulaire9661L
Anticorps anti-SMASigma-AldrichC6198
Anticorps anti-amylaseSigma-AldrichA8273
Anticorps anti-CD31Abcamab28364
Anti-TUBB3Technologie de signalisation cellulaire5568S
Alexa Fluor 594 Anticorps Kit d’étiquetageThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 PhalloïdineThermo-FisherA12381
Albumine sérique bovineFisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldéhyde PrillsFisher Scientific5027632
New England Agent bloquant nucléairePerkin Elmer2346249 n’estplus vendu
DAPICell Signaling Technology4083S
Prolong Gold Antifade Support de montageInvitrogenP36934
Leica SPSII Spectral ConfocalLeica BiosystemsN/APour l’imagerie confocale
Leica DMIL Microscope à contraste de phase inverséeLeica BiosystemsN/A
Instrument de téléthérapie au cobalt-60Énergie atomique du Canada Ltée Theratron-80N/A
Amac Box, ClearThe Container Store60140Moule de bloc d’agarose
Oligo-éléments Technologie Technologie de

Références

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