Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

Résumé

Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique. les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.

Résumé

L'utilisation des tissus et des cellules humaines primaires est idéale pour l'étude des processus biologiques et physiologiques tels que le processus de régénération de muscle squelettique. Il y a des défis reconnus à travailler avec les cellules souches adultes primaires humaines, en particulier les cellules progénitrices de muscle humain (HMPC) dérivées des biopsies squelettiques de muscle, y compris le faible rendement de cellules des tissus rassemblés et un grand degré d'hétérogénéité de distributeur de paramètres de croissance et de mort entre les cultures. Bien que l'intégration de l'hétérogénéité dans la conception expérimentale nécessite une plus grande taille d'échantillon pour détecter des effets significatifs, il nous permet également d'identifier les mécanismes qui sous-tendent la variabilité de la capacité d'expansion hMPC, et nous permet ainsi de mieux comprendre hétérogénéité dans la régénération des muscles squelettiques. De nouveaux mécanismes qui distinguent la capacité d'expansion des cultures ont le potentiel de conduire au développement de thérapies pour améliorer la régénération des muscles squelettiques.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand système d'organes dans le corps humain, représentant 30-40% de la masse corporelle entière¹. En plus de son rôle bien reconnu dans la locomotion, le muscle squelettique maintient la température et la posture du corps, et joue un rôle central dans l'homéostasie nutritive du corps entier. La recherche impliquant des participants humains, des animaux et des modèles de culture cellulaire est précieuse pour répondre aux questions relatives à la biologie et à la régénération des muscles squelettiques. L'isolement et la culture des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (HMPC) fournit un modèle robuste qui permet d'appliquer des techniques de culture cellulaire et des manipulations sur des échantillons humains. Un avantage de l'utilisation de HMPCest est qu'ils conservent le phénotype génétique et métabolique de chaque donneur^2,3. Le maintien du phénotype du donneur permet aux chercheurs d'examiner la variation interindividuelle du processus myogénique. Par exemple, nous avons utilisé notre méthode de caractérisation du HMPC pour identifier les différences liées à l'âge et au sexe dans la capacité d'expansion de la population du CPMH⁴.

Le but de ce protocole est de détailler des techniques pour isoler, culture, caractériser, et différencier hMPCs du tissu de biopsie de muscle squelettique. S'appuyant sur des travaux antérieurs qui décrivicomment les HMPC et identifient les fabricants potentiels de surface cellulaire pour l'isolement du HMPC^5,6, ce protocole comble une lacune critique dans la connaissance en liant l'isolement à la caractérisation des HMPC. De plus, les instructions détaillées étape par étape incluses dans ce protocole rendent l'isolement et la caractérisation du HMPC accessibles à un large public scientifique, y compris ceux qui ont une expérience antérieure limitée avec les HMPC. Notre protocole est parmi les premiers à décrire l'utilisation d'un cytomètre d'imagerie pour suivre les populations cellulaires. Les cytomètres d'imagerie nouvellement conçus sont à la fine pointe de la technologie, à haut débit et à base de microplaques, ce qui permet l'imagerie cellulaire vivante, le comptage cellulaire et l'analyse de la fluorescence multicanal de toutes les cellules dans chaque puits d'un vaisseau culturel en quelques minutes. Ce système permet une quantification rapide des changements dynamiques dans la prolifération et la viabilité de toute une population cellulaire avec seulement une perturbation minimale de la culture. Par exemple, nous sommes en mesure d'effectuer des mesures objectives de la confluence sur les jours successifs in vitro pour déterminer la cinétique de croissance de chaque culture dérivée de différents donneurs. De nombreux protocoles dans la littérature, en particulier ceux impliquant la différenciation des MPC, exigent que les cellules atteignent un niveau défini de confluence avant d'initier la différenciation ou le traitement⁷. Notre méthode permet une détermination objective de la confluence de chaque puits dans un récipient de culture permettant aux chercheurs d'initier le traitement d'une manière impartiale et non subjective.

Dans le passé, une limitation majeure de l'utilisation des HMPC primaires était de faibles rendements qui limitent le nombre de cellules disponibles pour les expériences. Nous et d'autres avons montré que le rendement des MPC à partir du tissu de biopsie des muscles squelettiques est de 1 à 15 MPC par milligramme de tissu (Figure 1)⁸. Parce que notre protocole permet quatre passages des cellules avant la purification avec fluorescence activée tri des cellules (FACS), nos rendements de hMPC cryoconservés, dérivés de petites quantités de tissu de biopsie (50-100 mg), sont suffisants pour répondre aux objectifs de recherche où plusieurs expériences sont nécessaires. Notre protocole FACS produit une population MPC pure (Pax7 positive) de 80 %, de cette façon, notre protocole est optimisé pour le rendement et la pureté.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par la Commission d'examen institutionnel de l'Université Cornell. Tous les participants ont subi un dépistage des problèmes de santé sous-jacents et ont donné leur consentement éclairé.

1. Obtenir le tissu de muscle humain par l'intermédiaire de la biopsie squelettique de muscle

1. Identifiez le muscle vastus lateralis par l'intermédiaire de la palpation, des repères anatomiques, et de la contraction active du muscle.
2. Palpate le vastus lateralis en ayant le participant serrer leur muscle quadriceps et de trouver le ventre du muscle, environ 1/3 du chemin de la rotule à la hanche, et juste ventrolatéral au fémur.
3. Utilisez un ruban à mesurer du papier pour marquer une zone avec un marqueur chirurgical à environ 4 à 6 pouces du haut de la rotule représentant le ventre du muscle.
4. Raser tous les cheveux près de la zone marquée, puis nettoyer avec un antiseptique de qualité chirurgicale qui est utilisé avant les procédures médicales (Par exemple: 2% chlorhexidine gluconate (CHG)/ 70% isopropyl alcool (IPA)) .
5. Anesthésiez le site de biopsie avec 1% de lidocaïne.
   REMARQUE: Évitez d'injecter la lidocaïne dans le muscle squelettique.
6. Faire une voie d'incision de 4 à 5 mm sur le site marqué.
7. Une fois la zone anesthésiée, poussez une aiguille Bergstrom avec du trocart à travers le fascia dans le ventre du muscle (environ 2 à 3 cm).
8. Dessiner le tissu musculaire dans l'aiguille Bergstrom en retirant le trocart de coupe de 2 à 3 cm pendant qu'un assistant applique l'aspiration en retirant un piston de seringue de 60 ml attaché.
9. Fermez la chambre de coupe.
10. Faites pivoter la base de l'aiguille de biopsie un quart de tour et répétez la séquence d'ouverture de l'aiguille, d'aspiration en appliquant et de fermeture de l'aiguille.
    REMARQUE: Chaque fois que l'aiguille est fermée, une coupe de tissu musculaire doit être obtenue à l'intérieur de l'aiguille Bergstrom. Pendant la collecte de l'échantillon, l'aiguille restera dans la cuisse dans la même position verticale pendant qu'elle est tournée longitudinalement à 360 degrés pour obtenir chaque échantillon. Cette séquence peut être répétée 3 à 4 fois.
11. Expulsez le tissu de biopsie recueilli de l'aiguille dans un panacle stérile non adhérent.
12. Examinez le tissu et enlevez tous les tissus adipeux et fibrotiques visibles à l'aide de lames de scalpel stériles ou de pinces à épiler.
13. Placer une portion (50 à 100 mg) de tissu dans un tube stérile contenant du CO₂- milieu nutritif indépendant (p. ex., Hibernate A).
    REMARQUE: Le poids du tissu est déterminé comme suit. D'abord placer le tube plafonné contenant le milieu nutritif sur une échelle et tare. Ensuite, placez le tissu dans le tube, récapitulez le tube, puis pesez le tube contenant le tissu dans le milieu nutritif.
14. Conserver le tube contenant le tissu et le milieu nutritif à 4 oC jusqu'au traitement.
    REMARQUE: Les tissus de biopsie doivent être traités dans les 48 h suivant la collecte.

2. Isoler les cellules de l'ancêtre musculaire humain du tissu de biopsie

1. Tissu de biopsie de mince.
   1. Transférer le tissu musculaire du milieu nutritif dans un plat stérile Petri dans un coffret de sécurité biologique ou un lieu de travail stérile similaire.
   2. Utilisez des lames de scalpel stériles pour hacher les tissus en morceaux de¹ mm 3.
2. Laver les tissus de biopsie hachés pour enlever les débris résiduels.
   1. Transférer le tissu musculaire dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS) et permettre au tissu de se déposer par gravité.
   2. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
   3. Ajouter 10 ml de PBS au tissu lavé et permettre au tissu musculaire de se réinstaller par gravité.
   4. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
   5. Ajouter 10 ml de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco à faible teneur en glucose et permettre au tissu de se réinstaller par gravité.
   6. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
3. Incuber le tissu dans les médias digesteurs.
   1. Resuspendre le tissu musculaire dans 3 ml de digest e (2 mg/mL de collagène D dans un faible taux de glucose DMEM).
      REMARQUE : Les solutions de stock de collagène D peuvent être préparées à 20 mg/mL dans le DMEM à faible teneur en glucose et stockées à -80 oC, puis diluées 1:10 dans le DMEM à faible teneur en glucose au moment de l'utilisation.
   2. Incuber le tube contenant le tissu musculaire dans un bain d'eau à 37 oC pendant 30 min.
   3. Triturate la suspension des tissus musculaires toutes les 10 min à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml ou d'une large pipette de forage.
   4. Ajouter 83 l de micromètre digestadditionnel et 24 l de solution de dispase (0,76 mM d'acétate de calcium, 1,39 mm d'acétate de sodium, 13,91 mg/mL de dispase II en faible teneur en glucose DMEM). Remettre la suspension dans le bain d'eau de 37 oC.
   5. Triturate la suspension des tissus musculaires toutes les 5 à 10 min avec une large pointe de tuyauterie.
   6. Poursuivre la trituration jusqu'à ce qu'une boue uniforme soit atteinte, et pour pas plus de 1,5 h pour empêcher la digestion excessive.
      REMARQUE: Le frilage suffisant du tissu et l'activité enzymatique de la collagène et de la dispase peuvent avoir un impact sur la digestion de l'échantillon. Une boue uniforme devrait pouvoir passer à travers une pointe normale de pipette avec l'occlusion minimale après 1.5 h. Si une boue uniforme n'est pas atteinte après 1,5 h, vérifiez que le hachis tissulaire est suffisant et que le tissu est haché à la taille appropriée (étape 2.1.2). En outre, l'activité des enzymes doit être testée comme beaucoup à beaucoup de variation dans l'activité enzymatique se produit.
4. Pellet cellules et geler dans les médias de récupération.
   1. Ajouter 6 mL de milieux de croissance (GM; 79% De Jambon F12, 20% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine, 5 ng/mL de facteur de croissance de base du fibroblaste [bFGF], pH 7,4, passé par un filtre de 0,22 m) à la boue musculaire.
   2. Pipette la suspension à travers une passoire à cellules de 70 m dans un tube conique de 50 ml. Rincer la passoire avec 4 ml supplémentaires de GM.
      REMARQUE: L'échantillon peut être transféré de nouveau dans un tube conique de 15 ml pour faciliter la visualisation de la pastille. Un plus grand volume de lavage peut être utilisé si les rendements cellulaires suivants sont faibles.
   3. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
   4. Aspirez le supernatant en étant sûr de ne pas perturber la pastille. Faites glisser le tube pour suspendre à nouveau la pastille dans le support restant. Si les cellules ne vont pas être cultivées immédiatement procéder à l'étape 2.4.5 pour les instructions sur le stockage à long terme, sinon procéder à l'étape 3.1.6.
      REMARQUE: Si la culture immédiate est souhaitée, les OGM dans les plaques de culture cellulaire doivent être pré-incubés (étapes 3.1.1 et 3.1.2) avant le début du traitement de la biopsie.
   5. Ajouter 1,5 ml de support de congélation de culture cellulaire de récupération (tableaudes matériaux)à la pastille récupérée.
   6. Transférer la boue dans un cryovial. Placer le cryovial dans un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol pendant la nuit à -80 oC. Conserver le cryovial à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la culture.
      REMARQUE: Les cryoviales contenant de la boue peuvent être conservés dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme (plus d'un mois). L'utilisation d'un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol permet aux cellules d'être congelées de façon reproductible à un taux de 1 oC/min, ce qui entraîne des taux optimaux de récupération cellulaire, comme en témoigne la viabilité après le gel et une probabilité accrue d'attachement aux vaisseaux de culture cellulaire⁹. Alternativement, un bécher contenant de l'isopropanol DE RT, placé dans un congélateur de -80 oC peut être utilisé.

3. Cultiver des cellules de progéniteur de muscle humain

1. Décongeler la boue musculaire.
   1. Avant la décongélation et l'ensemencement des HMPC, les plaques de culture cellulaire pré-équilibrifdans GM. Ajouter 250 L de GM à 4 puits d'une plaque de culture cellulaire enduite de collagène (collagène I). Remplissez les puits restants de 500 l de supports de base stériles (c.-à-d. F12) pour prévenir l'évaporation pendant la culture à long terme.
      REMARQUE: Pour les biopsies entre 50 g et 100 g, quatre puits d'une plaque de 24 puits sont appropriés. Si le tissu de biopsie est inférieur à 50 g, deux puits peuvent être plus appropriés. Les débris résiduels et le faible nombre de cellules empêchent l'utilisation d'une technique de comptage cellulaire à cette étape; par conséquent, la densité exacte de l'ensemencement n'est pas déterminée et varie légèrement d'une biopsie à une biopsie.
   2. Incuber les récipients de culture cellulaire avec GM à 37 oC dans 5 % de CO₂ pour 1 h avant l'ensemencement.
   3. Retirer les cryovials du congélateur de -80 oC et les placer dans un bain d'eau de 37 oC; le liquide dans le tube doit être complètement immergé dans l'eau.
   4. Lorsque la décongélation est presque terminée (5 min), transférer le cryovial dans une hotte stérile à débit laminaire. Transférer la boue musculaire hors du tube cryovial et ajouter à un tube conique de 15 ml contenant 6 ml de GM pré-chauffé à un taux de 1 ml/min.
   5. Centrifugeuse la boue musculaire à 300 x g pendant 5 min à RT.
      REMARQUE: Une centrifugeuse à godets oscillant peut faciliter la visualisation de petites pastilles à cette étape, mais n'est pas essentielle.
   6. Aspirez le supernatant en étant sûr de ne pas perturber la pastille. Feuilleter le tube pour resuspendre la pastille dans le support restant et le suspendre à 1 ml de GM.
   7. Transférer 250 ll de la pastille resuspension (maintenant considérée comme une suspension hMPC) à chacun des 4 puits de la plaque de culture cellulaire pré-incubée de 24 puits.
2. Culture et passage hMPCs.
   1. Maintenir les cultures de hMPC chez GMà 37 oC dans 5 % de CO 2.
      REMARQUE: Les stocks de GM sans le bFGF (c.-à-d., F12, antibiotiques, FBS) sont préparés en lots et conservés à 4 oC pendant jusqu'à 2 semaines. bFGF est ajouté à GM le jour de l'utilisation. Les supports contenant du bFGF peuvent être stockés pendant 48 h à 4 oC.
   2. Vingt-quatre heures après l'isolement, aspirez le GM, lavez doucement le récipient de culture 2x avec GM pré-chauffé, et ajoutez GM frais.
      REMARQUE : 24 h devraient fournir aux HMPC suffisamment de temps pour attacher ; aucun HMPC ne doit être enlevé après le lavage. Cette étape permettra également d'éliminer les débris restants qui ont été générés pendant la récolte cellulaire, ce qui rendra le navire plus propice à un balayage précis de la confluence à l'aide d'un cytomètre d'imagerie (section 5 ci-dessous). Après ce premier changement de média, GM est changé tous les 48 h.
   3. Passage hMPCs lorsque 70% confluence est atteint ou quand ils sont restés sur le même plat de culture pendant 10 jours, selon le premier se produit.
      REMARQUE : 70 % de confluence est d'environ 55 000 cellules/cm².
   4. Pour le passage, ajouter 250 l de trypsine pré-chauffée à chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant 5 min.
   5. Appuyez sur le récipient de culture cellulaire sur une surface ferme pour détacher les HMPC. Un microscope léger peut être utilisé pour vérifier que les HMPC se sont détachés.
   6. Transférer les suspensions trypsine/hMPC à 5 ml de GM dans un tube conique de 15 ml.
   7. Centrifugelant la suspension hMPC à 300 x g pendant 5 min à RT.
   8. Retirer les suspensions hMPC de la centrifugeuse et les placer sur la glace dans le capot stérile à débit laminaire.
      REMARQUE: Le fait de garder les HMPC sur la glace pendant le passage entraîne moins d'agrégation cellulaire.
   9. Aspirez le supernatant des hMPC et resuspendez doucement le granule dans 1 ml de GM.
   10. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé.
       REMARQUE: Une dilution de 1:5 de la suspension cellulaire à la mémoire tampon de comptage cellulaire est généralement appropriée.
   11. Les HMPC de semences sur des plats de culture recouverts de collagène contenant des OGM préréchauffés à une densité de 3 500 cellules par cm². Une combinaison de plaques de 10 cm et de plaques de 24 puits est idéale. Les plaques de 24 puits peuvent être numérisées quotidiennement sur un cytomètre d'imagerie pour surveiller la croissance.
   12. Suivez la même procédure (à partir de l'étape 3.2.4.) pour les passages suivants.
       REMARQUE: La santé et la pureté cellulaires peuvent être surveillées à travers les passages à l'aide d'un marqueur de sénescence cellulaire (p. ex., 'galactosidase) et d'immunostaining pour Pax7.
3. Cryopreserve les HMPC.
   1. Cryopreserve cellules excédentaires pour une utilisation ultérieure pour rendre le volume de culture plus gérable.
   2. Pour la cryoconservation, suivez la procédure de trypsinisation décrite dans les étapes 3.2.4.-3.2.9.
   3. Pendant que la suspension de la cellule est centrifuge, préparez un mélange de 20 % (p. ex., 200 l) de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et de 80 % (p. ex. 800 l) GM. Pipette de haut en bas 20x pour assurer un mélange adéquat. Laisser reposer le mélange sur la glace.
   4. Selon le nombre de cellules, diluer la suspension hMPC à 2 x 10⁶/mL en GM.
   5. Combinez la suspension hMPC et le mélange DMSO/80% GM stérile à 20%. Le dernier support cryopréservation est une combinaison de DMSO (10%) et GM (90%) contenant 1 x 10⁶ hMPCs/mL.
   6. Placez 1 mL de la suspension hMPC préparée à l'étape 3.3.5 en autant de cryovials que le nombre cellulaire initial le permet. Placez ensuite les HMPC aliquoted dans un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol dans un congélateur de -80 oC pendant la nuit.
      REMARQUE: À cette étape, généralement entre 5 et 15 millions de cellules sont obtenues, dont 30 à 60 % sont identifiées comme hMPC par les FACS.

4. Isoler Pax7^- Cellules de progéniteur de muscle humain par l'intermédiaire de la cytométrie de flux

1. Pour préparer les HMPC à partir de cultures vivantes (étape 3.2.11), trypsinize assez de vaisseaux de culture pour 1 x 10⁶-2 x 10⁶ cellules totales. Préparer les suspensions cellulaires décrites dans les étapes 3.2.4-3.2.9.
2. Préparer les HMPC à partir de cultures cryoconservées (étape 2.4.6 ou 3.3.6).
   1. Sélectionnez 1/2 tubes contenant 1 x 10⁶ passages quatre HMPC pour chaque donneur.
      REMARQUE: L'utilisation du passage de quatre HMPC permet un rendement cellulaire adéquat tout en maintenant un potentiel proliférant jusqu'au passage 6 (figure 2).
   2. Décongeler rapidement les cellules en les retirant du congélateur de -80 oC et en les plaçant dans un bain d'eau de 37 oC avec le liquide dans le tube complètement immergé.
   3. Lorsque la décongélation est presque terminée (5 min), transférez les HMPC sur une hotte stérile à débit lamineux et transférez le contenu de la suspension cellulaire en 6 ml de GM pré-chauffé dans un tube conique de 15 ml à une vitesse de 1 ml/min.
   4. Préparer les suspensions cellulaires décrites dans les étapes 3.2.7-3.2.9.
   5. Resuspendre chaque granule dans 3 ml de tampon FACS (500 mL de PBS, 12,5 ml de sérum de chèvre normal, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passé à travers un filtre de 0,22 m).
   6. Centrifugelant la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à RT.
   7. Aspirate supernatant des hMPC et resuspend doucement les granulés dans 250 'L de tampon FACS; place sur la glace.
   8. Placer 100 l de cellules dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml et laisser sur la glace pour être utilisé comme témoins vivants/morts (étape 4.5.1).
      REMARQUE : Les 100 ul de cellules à utiliser pour les contrôles vivants/morts peuvent provenir de la prise d'un petit volume (20 ul) de cellules suspendues de chaque donneur à trier ou à partir de cellules en banque.
      REMARQUE: Il est important de ne pas prendre plus de 20 ul de cellules suspendues d'un seul donneur. Apportez du volume jusqu'à 100 ul avec le tampon FACS si 100 ul de cellules sont disponibles.
3. Tainer les HMPC pour les marqueurs de surface cellulaire.
   1. Préparer le cocktail d'anticorps suivant (les quantités indiquées sont pour chaque culture, mise à l'échelle de manière appropriée) : 5 L CD56 (molécule d'adhérence cellulaire neurale [NCAM]; PE-Cy7-conjugué) et 5 CD29 de ll (1-integrin; AlexFluor488-conjugué). La dilution finale des anticorps est de 1:50.
   2. Ajouter 10 l de cocktail d'anticorps à chaque suspension hMPC et incuber sur la glace pendant 30 min dans l'obscurité.
   3. Ajouter 10 mL de tampon FACS à chaque mélange de suspension/cocktail anticorps.
   4. Centrifuger chaque tube à 300 x g pendant 5 min à RT.
   5. Resuspendre la pastille dans 300 oL de tampon FACS et transférer dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
   6. Gardez la suspension sur glace et protégez-la de la lumière.
4. Préparer les perles de compensation.
   REMARQUE : Des contrôles positifs pour chaque anticorps et un contrôle négatif (perles non tachées) doivent être préparés à l'aide de perles de compensation. Les contrôles de perles de compensation doivent être exécutés sur le cytomètre de débit avant que les échantillons soient triés. Ces contrôles permettent de déterminer combien le fluorochrome de chaque anticorps peut être détecté dans le canal de l'autre afin que la compensation puisse être appliquée.
   1. Perles de compensation Vortex.
   2. Dans trois tubes microcentrifugeurs de 1,7 ml, ajouter une goutte (50 l) de perles de compensation.
   3. Ajouter 1 l de chaque anticorps au tube approprié, ou aucun au contrôle négatif.
   4. Incuber dans l'obscurité pendant 15 min.
   5. Ajouter 1,5 mL de tampon FACS à chaque tube et vortex.
   6. Centrifuger chaque tube à 300 x g dans une centrifugeuse de banc pendant 5 min à RT.
   7. Aspirez supernatant et resuspendez la pastille dans 200 L de tampon FACS.
      REMARQUE: Le granule peut être très difficile à visualiser; il faut prendre soin d'aspirater le supernatant.
   8. Placez la suspension dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml, puis gardez le tube sur la glace et protégé de la lumière.
5. Préparer les contrôles vivants et morts.
   1. Divisez les 100 l de HMPC de l'étape 4.2.8 en deux tubes microcentrifugeurs de 1,7 mL (un pour le contrôle en direct et un pour le contrôle mort).
   2. Placez le tube de commande mort dans un bloc de chauffage pré-chauffé à 70 oC pour 10 min. Pendant ce temps, gardez le contrôle en direct sur la glace.
   3. Centrifuger chaque tube à 300 x g dans une centrifugeuse de banc pendant 5 min à RT.
   4. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans 150 L de tampon FACS.
   5. Combinez les commandes vivantes/mortes dans un seul tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
6. Effectuer la coloration de viabilité.
   1. Ajouter 1 l de 7-aminoactinomycine D (7-AAD) à tous les tubes contenant des cellules à trier et le contrôle vivant/mort.
   2. Ajouter des plaques GM aux plaques de 24 puits enduits de collagène (250 l/puits) et de 10 cm (8 ml/puits) et permettre d'équilibrer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC dans 5 % de CO₂.
7. Trier les HMPC par cytométrie de flux.
   1. Trier les hMPC sur un cytomètre d'écoulement avec une buse de 100 m à une pression de 20 psi. Déterminer les HMPCS vivants en fonction de la diffusion latérale et vers l'avant ainsi que de la négativité 7-AAD (paramètres de tri et une sorte représentative peut être vu dans la figure 3).
   2. Les cellules positives pour les^cellules PE-Cy7 (780/60 nm) et AlexFluor488 (530/30 nm) représentent les cellules CD56^etCD29 et sont donc des cellules positives Pax7 (HMPC). Triez les cellules doubles positives dans des tubes de collecte contenant un coussin de 300 l de tampon FACS.
      REMARQUE: La pureté des cultures triées peut être déterminée par l'immunostaining pour Pax7 suivie de l'analyse de cytométrie de flux en aval (Figure 4).
   3. Jeter toutes les autres cellules.
   4. Transférer les cellules triées dans un tube conique de 15 ml.
   5. Faites tourner la suspension hMPC à 300 x g pendant 5 min à RT.
   6. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspend dans 1 ml de GM.
   7. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé.
      REMARQUE: Bien que le nombre de cellules puisse être déduit comme le nombre d'événements qui sont triés positivement, ce nombre s'est avéré pour surestimer le nombre de cellules de 10-40% par rapport aux méthodes traditionnelles de comptage cellulaire.
   8. Ensemencez les HMPC tels qu'ils sont décrits à l'étape 3.2.11.
      REMARQUE: La vérification de la pureté de la population de hMPC peut être déterminée par immunostaining pour Pax7 et analyse par l'intermédiaire de la cytométrie de flux.

5. Caractériser les cultures de cellules de progéniture de muscle humain (hMPC) utilisant un cytomètre d'imagerie

1. Utilisez le cytomètre d'imagerie (Tableau des matériaux) pour effectuer des balayages de confluence.
   1. Sélectionnez Créer un nouvel balayage, puis entrez/sélectionnez la catégorie deplaque, le profil de plaque et l'ID deplaque. Le cytomètre d'imagerie peut accueillir 96, 24 et 6 plaques de puits.
   2. Sous application, sélectionnez Confluence 'gt; Confluence 1.
   3. Sélectionnez un puits à afficher à l'aide du navigateur à droite de l'écran.
   4. Trouver un plan de mise au point où les cellules semblent blanches par rapport à l'arrière-plan et sélectionnez le manuel d'enregistrement ou permettre au cytomètre d'imagerie de sélectionner le plan de mise au point en sélectionnant enregistrer auto.
      REMARQUE: Pour les 96 plaques depuits suggérées dans la Table des Matériaux, une position approximative est de 4,3 unités.
   5. Utilisez la souris pour mettre en évidence tous les puits qui doivent être numérisés. Toute la zone du puits sera automatiquement numérisée. Sélectionnez Start Scan.
   6. Sélectionnez les paramètres d'analyse optimaux pour le type de plaque et de cellule.
      REMARQUE: Pour les HMPC, les réglages suivants sont optimaux : intensité 6, intensité saturée 0, diamètre, 8, épaisseur minimale 3, min taille de cluster 500, et précision et haute.
   7. Sélectionnez L'analyse de démarrage.
      REMARQUE: Inspecter visuellement les images pour s'assurer que l'utilisateur et le cytomètre d'imagerie s'entendent sur le périmètre des cellules. S'il existe un écart important, rescanner la plaque à l'aide d'un plan de mise au point différent ou de différents paramètres d'analyse. Le balayage de confluence peut être employé pour comparer la croissance entre les cultures, le temps l'administration d'un traitement, ou pour surveiller des cellules et pour décider quand initier la différenciation. Si la différenciation est souhaitée, les détails sont fournis à la section 6.
2. Utilisez le cytomètre d'imagerie pour compter les cellules.
   1. Préparer une solution de coloration contenant 12 ml de F12 de Ham, 6 l de Hoechst 33342 et 24 l d'iodure de propidium.
   2. Aspirez les supports et remplacez-les par une solution de coloration, incubez à 37 oC pendant 15 min.
   3. Aspirate solution de coloration et de remplacer par La F12 de Ham.
      REMARQUE: Il est important d'utiliser un média avec de faibles niveaux de phenol rouge pour obtenir des images claires. Alternativement, PBS peut être utilisé.
   4. Chargez la plaque sur le cytomètre d'imagerie et sous application, sélectionnez Cell Viability 'gt; Live ' Dead ' Total. Le canal en direct sera une image de champ lumineux, le canal mort sera le propidium Iodide, et le canal total sera le Hoechst 33342.
   5. Définir le canal Live sur le champ lumineux et cliquez sur Enregistrer auto sous Focus Setup.
   6. Sous le canal Total, mettre le canal en bleu. Utilisez la mise au point Trouver pour mettre les noyaux au point ou utilisez les flèches de haut en bas pour définir manuellement la mise au point. Cliquez sur Le décalage de l'ensemble pour sélectionner la mise au point.
   7. Sous le canal Dead, mettre le canal au rouge. Utilisez la mise au point Trouver pour mettre les cellules mortes au point ou utiliser les flèches de haut en bas pour définir manuellement la mise au point. Cliquez sur Le décalage de l'ensemble pour sélectionner la mise au point.
   8. Sélectionnez L'analyse Démarrer pour démarrer l'analyse.
   9. Sélectionnez les paramètres d'analyse qui conviennent à la plaque et au type de cellule. Sélectionnez L'analyse de démarrage pour commencer l'analyse. Une fois l'analyse terminée, vérifiez visuellement que l'analyse compte de façon appropriée les cellules (p. ex., pour la vérification totale du canal, chaque noyau est reconnu comme un noyau et que le cytomètre d'imagerie ne compte aucune des taches en arrière-plan comme noyaux). Si l'analyse et l'analyse sont satisfaisantes, retournez la plaque à l'incubateur, sinon rescannez ou modifiez les paramètres d'analyse.

6. Différencier les cellules de l'ancêtre musculaire humain (HMPC) en myotubes

1. Déterminer la confluence hMPC à l'aide du protocole à la section 5.1. Pour différencier les hMPC en myotubes, il est idéal pour les cellules d'être 80-85% confluents comme déterminé par la fonction de confluence sur le cytomètre d'imagerie (voir la section 5). Si l'on utilise des HMPC de plus d'un donneur unique, la parmodenagéson permet aux cellules de différents donneurs de commencer à se différencier au moment où elles atteignent la confluence.
   REMARQUE: À 80 % de confluence, il y aenviron 66 000 cellules/cm 2.
2. Laver les cellules 2x avec des supports de différenciation (97% De F12 de Ham, 2% de sérum équin, 1% de pénicilline/streptomycine, pH 7.4, passé par un filtre de 0,22 m).
3. Maintenir les cellules dans les médias de différenciation aussi longtemps que l'expérience le dicte tout en changeant de média tous les jours.
4. Évaluer directement la formation de myotube par immunostaining pour la chaîne lourde embryonnaire de myosine, qui est typiquement détectable après 7-10 jours de différenciation.
   REMARQUE: Le temps nécessaire pour former des myotubes peut différer légèrement selon le donneur et le nombre de cellules lorsque la différenciation a été initiée; par conséquent, il est recommandé que les cultures de chaque donneur soient surveillées individuellement.

Résultats

Les résultats représentatifs de cytométrie de flux de l'isolement de hMPC du tissu de muscle humain peuvent être vus dans la figure 1. les hMPC peuvent être identifiés par les premiers événements de gating basés sur la diffusion latérale et la diffusion vers l'avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivis par la sélection des cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables. La sélection des cellules positives pour les marqueurs de ...

Discussion

Les HMPC primaires sont un modèle de recherche important utilisé pour comprendre la biologie des muscles squelettiques et le processus régénérateur. En outre, les HMPC ont le potentiel d'être utilisés pour la thérapie. Cependant, il y a des défis reconnus en utilisant les HMPC primaires pour la recherche et la thérapie, y compris la compréhension limitée des cellules dérivées des humains¹⁰. Il existe également une grande variation de la capacité d'expansion entre les cultures de donneurs, ce qui l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % Trypsine, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsine utilisée pour éliminer les hMPC adhérents des récipients de culture cellulaire
Plaque de culture cellulaire de 10 cm	VWR	664160	Plaques utilisées pour la culture de hMPC
Tube Falcon Falcon		352196	15 mL Tubes coniques utilisés tout au long des protocoles d’isolement et de culture hMPC
Plaque de culture cellulaire 24 puits	Grenier Bio-One	662 160	Plaques utilisées pour la culture hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Coloration de viabilité pour l’identification des cellules vivantes lors du tri FACS
Alexa Fluor 488 anti-humain CD29, Clone : TS2/16	BioLegend	303016	Anticorps conjugué pour FACS  ;
Plaque de culture cellulaire noire 96 puits	Grenier Bio-One	655079	plaque de culture cellulaire 96 puits idéale pour l’imagerie fluorescente à l’aide du Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Cytomètre d’imagerie utilisé pour suivre les cultures hMPC
Passoire	VWR	352350	Passoire cellulaire pour éliminer les gros débris lors du traitement de la biopsie musculaire
Collagène de type I (Rat Queue)	Corning	354236	Collagène pour l’enrobage des plaques de culture cellulaire  ;
Collagénase D	Roche	11 088 882 001	Utilisée pour la dégradation du collagène et d’autres tissus conjonctifs dans le tissu de biopsie des muscles squelettiques
Diméthyl Sulfoxyde	VWR	WN182	Utilisée pour la cryoconservation des hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	Une protéase utilisée pour la digestion enzymatique du tissu
de biopsie des muscles squelettiquesDulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose en poudre	Gibco	31600-034	DMEM à faible teneur en glucose pour le traitement de la biopsie musculaire
Saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s	Gibco	21600-010	PBS pour le traitement de la biopsie musculaire
EDTA Sel disodique dihydraté	J.T. Baker	4040-01  ;	Requis pour le tampon FACS
Sérum fœtal bovin	VWR	89510-186  ;	Sérum fœtal bovin utilisé pour les milieux de croissance hMPC
Ham’s F12	Gibco	21700-026	Milieu de base pour hMPCs
Sérum équin inactivé par la chaleur	Gibco	26-050-070	Sérum de cheval utilisé pour fabriquer des milieux de différenciation hMPC
Hémocytomètre	iNCyto	DHC-N0105	Utilisé pour compter les cellules
hibernation A	Gibco	A1247501	Milieu pour préserver la biopsie des muscles squelettiques tissu
Hoechst 33342, chlorhydrate de trichlorhydrate	Life Technologies	H21492	Coloration de l’ADN pour l’identification de toutes les cellules à l’aide de l’isopropanol Celigo S
	Fisher Scientific	A416P-4	Utilisé pour la congélation à débit contrôlé de hMPCs
Tampon Moxi	Orflo	MXA006	Tampon pour compteur de cellules automatisé
Cassettes Moxi Orflo		MXC002	Cassesttes pour compteur de cellules automatisé
Moxi z Mini Compteur de cellules automatisé	Orflo		Compteur de cellules automatisé Conteneur de
congélation Mr. Frosty Thermo	Fisher Scientific	5100-0001	Récipient de congélation cellulaire à débit contrôlé disponible dans le commerce
Sérum de chèvre normal (10 %)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Sérum de chèvre utilisé dans le tampon
FACSPE-Cy7 Souris anti-humaine CD56, Clone : B159	BD Pharmingen	557747	Anticorps conjugué pour FACS  ;
Pénicilline/Streptomycine 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotiques ajoutés aux milieux de culture
Iodure de propidium	Thermo Fisher Scientific	P3566	Coloration de l’ADN pour l’identification des cellules mortes à l’aide du
facteur de croissance des fibroblastes humains de base	Promega	G5071	Supplément dans les milieux de croissance hMPC pour prévenir la différenciation spontanée
Milieu de congélation de culture cellulaire de récupération  ;	Gibco	12648-010	Milieux utilisés pour la cryoperseve de boues de biopsie musculaire
Bicarbonate de sodium	Fisher Scientific	S233-3	Ajouté aux tubes stériles à fond rond F12
Ham	VWR	60818-565	Tubes utilisés pour FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Perles de compensation pour l’étalonnage du débit Paramètres FACS