Article de méthode
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Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d'un IS. La première, implique la quantification du recrutement d'organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.
La reconnaissance des antigènes attachés de surface par le récepteur des cellules B (BCR) déclenche la formation d'une synapse immunitaire (IS), où la signalisation et l'apport d'antigènes sont coordonnés. La formation d'IS implique le remodelage dynamique d'actine accompagné du recrutement polarisé à la membrane synaptique des organites intracellulaires centrosomes et associés tels que des lysosomes et l'appareil de Golgi. Les premières étapes du remodelage de l'actine permettent aux cellules B d'augmenter leur surface cellulaire et de maximiser la quantité de complexes antigènes-BCR recueillis à la synapse. Dans certaines conditions, lorsque les cellules B reconnaissent les antigènes associés aux surfaces rigides, ce processus est couplé au recrutement local et à la sécrétion de lysosomes, ce qui peut faciliter l'extraction d'antigènes. Les antigènes pris sont intériorisés dans des compartiments endo-lysosome spécialisés pour le traitement en peptides, qui sont chargés sur des molécules majeures du complexe d'histocompatibilité II (MHC-II) pour une présentation ultérieure aux cellules d'aide T. Par conséquent, l'étude de la dynamique des organites associée à la formation d'un SI est cruciale pour comprendre comment les cellules B sont activées. Dans le présent article, nous discuterons à la fois de l'imagerie et d'une technique biochimique utilisée pour étudier les changements dans le positionnement intracellulaire des organites et les réarrangements cytosquelettes qui sont associés à la formation d'un IS dans les cellules B.
Les lymphocytes B sont une partie essentielle du système immunitaire adaptatif responsable de la production d'anticorps contre différentes menaces et d'envahissement des agents pathogènes. L'efficacité de la production d'anticorps est déterminée par la capacité des cellules B à acquérir, traiter et présenter les antigènes rencontrés sous une forme soluble ou en surface1,2. La reconnaissance des antigènes attachés à la surface d'une cellule de présentation, par le BCR, conduit à la formation d'un contact intercellulaire étroit appelé IS3,4. Dans cette p....
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REMARQUE : Les étapes suivantes ont été exécutées utilisant des cellules IIA1.6 B.
1. Activation des cellules B avec perles enduites d'antigène
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Le présent article montre comment les cellules B peuvent être activées à l'aide d'antigène immobilisé sur des perles ou des couvertures pour induire la formation d'un IS. Nous fournissons des informations sur la façon d'identifier et de quantifier la polarisation des différents organites par immunofluorescence et comment caractériser les protéines qui subissent des changements dynamiques dans leur association au centrosome, qui polarise à l'IS, en utilisant un l'approche biochimique.
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Nous décrivons une méthode complète pour étudier comment les lymphocytes B réorganisent leur architecture intracellulaire pour favoriser la formation d'un IS. Cette étude comprend l'utilisation de techniques d'imagerie pour quantifier la distribution intracellulaire des organites, tels que le centrosome, l'appareil Golgi et les lysosomes pendant l'activation des cellules B, et comment ils se polarisent vers l'IS. En outre, nous décrivons une approche biochimique pour étudier des changements dans la composition de centros.......
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Les auteurs n'ont rien à révéler.
M.-I.Y. bénéficie d'une subvention de recherche de FONDECYT #1180900. J.I., D.F. et J.L. ont été soutenus par des bourses de la Comision Nacional de Ciencia y Tecnologa. Nous remercions David Osorio de Pontificia Universidad Cataliica de Chile pour l'enregistrement et le montage vidéo.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| IIA1.6 (variante A20) cellules de lymphome B de souris | ATCC | TIB-208 | Lymphome B murin d'origine Balb/c qui exprime un BCR contenant des IgG à sa surface sans FcγIIR |
| Méthanol à 100% | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Verres de couverture de 10 mm de diamètre d'épaisseur n° 1 circulaire | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoéthanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Kit Amaxa Nucleofection V | Lonza | VCA-1003 | Suivez les instructions du fabricant pour mélanger les réactifs de transfection avec l'ADN |
| Modèle Amaxa Nucleofector 2b | Lonza | AAB-1001 | Programme L-013 utilisé |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Plaques de culture T25 | BD | 353014 | |
| Logiciel Fiji | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldéhyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Anticorps anti-souris IgG de chèvre | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | Ligand IIA1.6 positif |
| Anticorps anti-souris IgM de chèvre | Thermo Fisher Scientific | 31186 | Ligand IIA1.6 négatif |
| Sérum bovin fœtal HyClone | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Inactivation thermique à 56 oC pendant 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Microscope TCS Leica SP8 | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Microscope d'épifluorescence Nikon Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldéhyde | Merck | 30525-89-4 | Diluer à 4% avec PBS dans un cabinet de sécurité, utiliser au moment |
| Pénicilline-Stréptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquide |
| Microsphères amino Polybead 3,00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Diluer avec de l'eau stérile |
| Anticorps anti-alpha tubuline de lapin | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Anticorps anti-lamp1 de lapin | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Anticorps anti-cep55 de lapin | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recommandée mais devrait être optimisée |
| Anticorps anti-gamma Tubuline de lapin | Abcam | ab16504 | 1:1000 pour Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Pyruvate de sodium | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
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