Ici, nous présentons un protocole pour modifier génétiquement les cellules CAR-T via un système CRISPR/Cas9.
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Article de méthode
Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T
Dans cet article
Résumé
Résumé
La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est une nouvelle option de traitement de pointe et potentiellement révolutionnaire pour le cancer. Cependant, il y a des limites significatives à son utilisation répandue dans le traitement du cancer. Ces limitations incluent le développement des toxicités uniques telles que le syndrome de dégagement de cytokine (CRS) et la neurotoxicité (NT) et l'expansion limitée, les fonctions d'effecteur, et l'activité antitumorale dans les tumeurs pleines. Une stratégie visant à améliorer l'efficacité du CAR-T et/ou à contrôler les toxicités des cellules CAR-T consiste à modifier le génome des cellules CAR-T elles-mêmes lors de la fabrication des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons l'utilisation de l'édition de gène CRISPR/Cas9 dans les cellules DE CAR-T par transduction avec une construction lentivirale contenant un ARN de guide au facteur de stimulation de colonie de macrophage de granulocyte (GM-CSF) et cas9. À titre d'exemple, nous décrivons CRISPR/Cas9 pare-t-il de GM-CSF. Nous avons montré que ces cellules GM-CSFk/o CAR-T produisent effectivement moins de GM-CSF tout en maintenant la fonction critique des lymphocytes T et entraînent une activité antitumorale accrue in vivo par rapport aux cellules carturiennes de type sauvage.
Introduction
La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est très prometteuse dans le traitement du cancer. 1 Fois , 2 Deux thérapies cellulaires CAR-T ciblant le CD19 (CART19) ont récemment été approuvées aux États-Unis et en Europe pour l'utilisation dans les malignités des cellules B après avoir démontré des résultats frappants dans des essais cliniques multicentriques. 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Les obstacles à une utilisation plus répandue des cellules CAR-T sont une activité limitée dans les tumeurs so....
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Protocole
Ce protocole suit les lignes directrices du Conseil d'examen institutionnel (CISR) de la clinique Mayo et du Comité de biosécurité institutionnelle (BAC).
1. Production de cellules CART19
- Isolement cellulaire, stimulation et culture ex-vivo
- Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une hotte de culture cellulaire en utilisant l'équipement de protection individuelle approprié. Récoltez les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) des cônes normaux de sang de donneur de de--identifié recueillis pendant l'apheresis car ceux-ci sont connus pour être une source viable de PBMCs.13 ....
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Résultats
La figure 1 montre la réduction de GM-CSF dans les cellules GM-CSFk/o CART19. Pour vérifier que le génome des lymphocytes T a été modifié pour koiller GM-CSF, le séquençage TIDE a été utilisé dans les cellules GM-CSFk/o CART19 (figure 1A). La coloration de la surface des cellules CAR-T vérifie que les lymphocytes T expriment avec succès le récepteur de surface de la RCA in vitro en gating sur des cellules CD.......
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour employer la technologie DE CRISPR/Cas9 pour induire des modifications secondaires dans les cellules de CAR-T. Plus précisément, cela est démontré à l'aide de la transduction lentivirale avec un vecteur viral qui contient du gRNA ciblant le gène d'intérêt et Cas9 pour générer des cellules GM-CSFk/o CART19. Nous avions précédemment montré que la neutralisation de GM-CSF améliore CRS et NT dans un modèle de xénogreffe. 12 Comme nous l'a.......
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Déclarations de divulgation
SSK est un inventeur de brevets dans le domaine de la thérapie à cellule T CAR qui sont sous licence à Novartis (en vertu d'un accord entre Mayo Clinic, Université de Pennsylvanie, et Novartis). Ces études ont été financées en partie par une subvention de Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS et SSK sont des inventeurs de brevets liés à ce travail. Le laboratoire (SSK) reçoit des fonds de Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys et Actinium.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de K12CA090628 (SSK), du National Comprehensive Cancer Network (SSK), du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), de la Predolin Foundation (SSK), du Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) et le Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticorps monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | cytomètre |
| en flux diméthylsulfoxyde | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 ; | |
| Dynabeads MPC-S (concentrateur de particules magnétiques) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit d’isolement de cellules T humaines ; | STEMCELL Technologies | 17951 | sélection négative billes magnétiques ; 17951RF comprend pointes et tampon |
| Sérum fœtal bovin | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Souris Anti-Humain CD107a ; | BD Pharmingen | 555800 | |
| Milieu de fixation (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construction : Nom : CSF2 CRISPR guide RNA 1 ; Espèce : Humain, Vecteur : pLentiCRISPR v2 ; Résistance : Ampicilline ; Numéro d’exemplaire : High ; Préparation du plasmide : Livraison standard : 4 &mu ; g (Gratuit de frais) | GenScript | N/A | commande personnalisée |
| Chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| ; Donneurs masculins ; type AB ; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Anticorps monoclonal (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Réactif de transfection | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes Aqua fixable, pour excitation 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Solution Monensin, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Souris Anti-Humain CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Souris Anti-Humain CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Souris Anti-Humain MIP-1&beta ; PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Conteneur de congélation | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 ; | ATCC | CRL-3273 | lignée cellulaire de leucémie lymphoblastique aiguë |
| Eau libre Nucléase | Promega | P119C | |
| Systèmes de filtration sous vide Olympus, 500 mL, membrane PES, 0,22 uM, stérile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Unités de filtre stériles jetables à débit rapide Nalgene avec membrane CN 0,45 uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Sérum réduit Milieu (1X), Liquide | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Souris Anti-Humain IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100X), Liquide | Gibco | 10378-016 | |
| Milieu de perméabilisation (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| Mini Kit d’ADN génomique PureLink | Invitrogen | K182001 | |
| Chlorhydrate de puromycine | MP Biomedicals, Inc. | ||
| QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN | 28704 | ||
| Rat Anti-Humain GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Séparateur de cellules entièrement automatisé |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Azoture de sodium, 5 % (p/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum | Lonza | 04-418Q |
Références
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
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Réimpressions et autorisations
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