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Article de méthode

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo

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DOI :

10.3791/59720

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11 juillet 2019

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1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole utilisant une approche génétique avancée au dépiste pour des mutants présentant la neurodégénérescence dans le melanogaster de Drosophila. Il intègre un test d'escalade, l'analyse histologique, la cartographie des gènes et le séquençage de l'ADN pour finalement identifier de nouveaux gènes liés au processus de neuroprotection.

Résumé

Il y a beaucoup à comprendre au sujet de l'commencement et de la progression des maladies neurodegenerative, y compris les gènes sous-jacents responsables. Le dépistage génétique à l'aide de mutagènes chimiques est une stratégie utile pour cartographier les phénotypes mutants aux gènes de Drosophila et d'autres organismes modèles qui partagent des voies cellulaires conservées avec les humains. Si le gène muté d'intérêt n'est pas mortel dans les premiers stades de développement des mouches, un test d'escalade peut être effectué pour dépister les indicateurs phénotypiques de la diminution du fonctionnement du cerveau, tels que de faibles taux d'escalade. Par la suite, l'analyse histologique secondaire du tissu cérébral peut être exécutée afin de vérifier la fonction neuroprotective du gène en marquant des phénotypes de neurodégénérescence. Les stratégies de cartographie génique comprennent la cartographie méiotique et la carence qui s'appuient sur ces mêmes essais peuvent être suivies d'un séquençage de l'ADN pour identifier les changements possibles des nucléotides dans le gène d'intérêt.

Introduction

Les neurones sont pour la plupart post-mitotiques et incapables de diviser1,2. Chez la plupart des animaux, des mécanismes neuroprotecteurs existent pour maintenir ces cellules tout au long de la vie de l'organisme, en particulier à la vieillesse lorsque les neurones sont les plus vulnérables aux dommages. Les gènes sous-jacents à ces mécanismes peuvent être identifiés chez les mutants présentant une neurodégénérescence, un indicateur phénotypique de la perte de neuroprotection, à l'aide d'un protocole génétique avancé. Les écrans génétiques avancés utilisant des mutagènes chimiques tels que le méthane sulfonate éthylique (EMS) ou le N-éthyl-N-nitrosourea (ENU) sont particulièrement utiles en raison des mutations ponctuelles aléatoires qu'ils induisent, résultant en une approche intrinsèquement impartiale qui a mis en lumière de nombreuses fonctions génétiques dans les organismes modèles eucaryotes3,4,5 (en revanche, la mutagénèse des rayons X crée des ruptures d'ADN et peut entraîner un réarrangement plutôt que des mutations ponctuelles6).

La mouche commune des fruits Drosophila melanogaster est un sujet idéal pour ces écrans en raison de sa haute qualité, séquence du génome bien annoté, sa longue histoire en tant qu'organisme modèle avec des outils génétiques très développés, et surtout, son partagé histoire évolutive avec les humains7,8. Un facteur limitant dans l'applicabilité de ce protocole est la létalité précoce causée par les gènes mutés, ce qui empêcherait les tests à l'âge de9ans . Cependant, pour les mutations non létales, un test d'escalade, qui tire parti de la géotaxie négative, est une méthode simple, bien que vaste, de quantifier le fonctionnement moteur altéré10. Pour montrer une réactivité locomotrice suffisante, les mouches dépendent des fonctions neuronales pour déterminer la direction, sentir sa position et coordonner le mouvement. L'incapacité des mouches à grimper suffisamment en réponse à des stimuli peut donc indiquer des anomalies neurologiques11. Une fois qu'un phénotype d'escalade défectueux particulier est identifié, d'autres essais utilisant un écran secondaire tel que l'analyse histologique du tissu cérébral, peuvent être employés pour identifier la neurodégénérescence dans les mouches grimpantes-défectueuses. La cartographie génétique ultérieure peut ensuite être utilisée pour révéler la région génomique sur le chromosome porteur du gène neuroprotecteur défectueux d'intérêt. Pour réduire la région chromosomique d'intérêt, la cartographie méiotique utilisant des lignées de mouches mutantes portant des gènes marqueurs dominants avec des emplacements connus sur le chromosome peut être effectuée. Les gènes marqueurs servent de point de référence pour la mutation car la fréquence de la recombinaison entre deux loci fournit une distance mesurable qui peut être utilisée pour cartographier l'emplacement approximatif d'un gène. Enfin, le franchissement des lignes mutantes avec des lignes portant des déficiences équilibrées sur la région chromosomique méiotatiquement cartographiée d'intérêt crée un test de complémentaration dans lequel le gène d'intérêt peut être vérifié si son phénotype connu est exprimé5. Les séquences de nucléotides polymorphes dans le gène identifié, ce qui pourrait entraîner une modification des séquences d'acides aminés, peuvent être évaluées en séquençant le gène et en le comparant à la séquence du génome de Drosophila. La caractérisation ultérieure du gène d'intérêt peut inclure l'essai d'allèles mutants supplémentaires, des expériences de sauvetage de mutation et l'examen de phénotypes additionnels.

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Protocole

1. Préparation et vieillissement des mouches

  1. Obtenir ou générer6 une collection de mutants Drosophila qui seront utilisés pour l'écran génétique. Ici, des lignes ENU-mutagénisées cartographiées au deuxième chromosome et équilibrées au-dessus de CyO sont employées.
  2. Amplifiez les lignées expérimentales de génotype dans un incubateur réglé à 25 oC, cycle de 12 h de lumière/obscurité sur le milieu de la mélasse de maïs.
  3. Recueillir environ 20 progéniture homozygotes entre 0-2 jours d'eclosion adulte de chaque génotype expérimental. Éliminez les préjugés sexuels en recueillant systématiquement des mouches mâles ou femelles.
  4. Age les mouches sur la semoule de maïs-molasses milieu comme désiré à 29 oC, en retournant les flacons tous les 2-3 jours afin de maintenir les mouches sur les aliments frais comme ils vieillissent. Dans l'écran présenté ici, les mouches ont été vieillis pendant 10-12 jours.
  5. Assembler une chambre d'essai d'analyse d'escalade à l'aide de deux flacons et du ruban adhésif comme décrit précédemment10. Les flacons doivent être connectés aux deux extrémités ouvertes. Utilisez une règle pour marquer une ligne de 5 cm à une extrémité de la chambre.

2. Protocole 1: Escalade D'Assay (Adapté d'Ali et al.10)

  1. Valider l'assay d'escalade. Dans cette étude, tester l'analyse d'escalade basée sur la méthodologie précédemment décrite par Ali et al.10, en utilisant ElavC155-gt;UAS-TauR406W (présentant des taux de réussite d'escalade plus bas) et ElavC155-gt;UAS-GFP ( contrôle) et ElavC155et Elav C155 et Elav C155 .
  2. Retourner les mouches dans une chambre d'essai, une ligne à la fois (ne pas utiliser d'anesthésie CO 2) et leur permettre de récupérer pendant 5 min. Si les tests sont effectués à des jours différents, effectuez l'analyse à la même heure de la journée. Dans cette étude, tous les essais d'escalade ont été effectués dans l'après-midi pour contrôler les effets circadiens sur la locomotion12.
    REMARQUE: Évitez d'exposer les mouches à la lumière directe du soleil lors des essais; cela interfèrera avec leur capacité à grimper.
  3. Appuyez de force sur la chambre (côté marqué vers le bas) sur un tapis de souris placé sur une surface solide 3 fois afin que toutes les mouches commencent l'assay au fond. Observez la locomotion de mouche sur une période de 10 s.
  4. Enregistrez le nombre de mouches qui atteignent ou passent la ligne de 5 cm dans ce délai, ainsi que le nombre total de mouches testées. Répétez le protocole, en attendant 1 min entre chaque essai, pour un minimum de 3 répétitions d'essai par ligne.
    REMARQUE: Dans la présente étude, chaque flacon contenait entre 2 et 19 mouches pour le dépistage initial (mouches mâles) et entre 6 et 21 mouches pour l'analyse de carence mutante des lignées femelles croisées (section 5.3.).

3. Protocole 2 : Sélection des souches de drosophile pour une analyse plus approfondie

  1. Entrez les données d'analyse d'escalade dans Microsoft Excel ou un logiciel similaire et calculez le taux de réussite d'escalade pour chaque ligne sur toutes les répliques en pourcentage.
  2. Effectuez une analyse statistique pour détecter les lignées mutantes qui s'écartent considérablement de la valeur moyenne en pourcentage de toutes les lignes à l'aide du logiciel R13.
    1. Lire dans les fichiers de données organisés pour R (.csv ou .txt fichiers avec une colonne pour chaque variable ou facteur, et les lignes représentant les valeurs spécifiques).
      REMARQUE: Ici, les données pour les mâles (analyse initiale) et les femelles (ligne 867 ont traversé aux lignes de carence) ont été saisies dans des feuilles séparées .xlsx sous forme de deux colonnes, l'une où les lignes de la colonne identifient la ligne mutante et combien de fois l'analyse a été reproduite et l'autre où les lignes représentent le succès moyen de l'escalade (en pourcentage) pour chaque flacon de repli des mouches.
    2. Lisez les données en R en utilisant le code suivant :
      mali-lt;-read.csv(". /male-init.csv")
      femdef-lt;-read.csv(". /fem-def-cross.csv")
      REMARQUE: Les répertoires ".." dans le chemin sont des chemins absolus de l'annuaire racine de l'ordinateur de l'utilisateur et devrait être spécifié par l'utilisateur individuel pour les chemins d'annuaire de leur ordinateur.
    3. Effectuer la modélisation linéaire
      1. Effectuer une régression variable factice avec la fonction lm en R. Pour l'analyse initiale des lignées mutantes, évaluer l'importance des effets de niveau de facteur (lignes mutantes) sur le pourcentage de succès d'escalade contre la grande moyenne pour une variable de réponse centrée sur la moyenne zéro (pourcentage de réussite).
        REMARQUE: Le "-1" à la fin de l'appel de fonction lm dans la section 3.2.3.2. supprime l'interception et nous permet de tester tous les niveaux de facteur par rapport à la moyenne zéro moyen centré de pourcentage de taux de réussite d'escalade.
      2. Imprimez les résultats sur l'écran à l'aide de la fonction de résumé R :
        mali-anova-lt;-lm(scale(mali$P-Success)-mali$Mutant-line -1)
        résumé (mali-anova)
      3. Utilisez les lignes de contrôle (si présent) comme référence pour tester les effets de niveau des facteurs par rapport à l'utilisation du code R suivant : x-lt;-relevel (femdef$Mutant-line, ref'"a867-plus")
        femdef-anova-lt;-lm (femdef$P-successx)
        résumé (femdef-anova)
        REMARQUE: La première ligne de code réorganise les niveaux de facteur de sorte que la ligne de contrôle négative devienne l'interception de base à laquelle tous les autres niveaux de facteur (lignes mutantes) sont testés contre avec les t-tests intégrés dans la fonction lm.
  3. Choisissez un seuil pour les lignes de candidats en fonction de l'âge au moment du test. Pour déterminer le seuil, effectuer un test préliminaire à l'âge désiré à l'aide de mutants connus qui présentent une neurodégénérescence et de faibles taux de réussite d'escalade par rapport au type sauvage, les mouches de contrôle10.
    REMARQUE: Un taux de passage inférieur à 50% peut être approprié pour les mouches de 10 jours comme précédemment rapporté pour les lignées de Drosophila surexprimant le gène humain lié à la neurodégénérescence Tau dans le système nerveux10. Les mouches plus âgées devraient avoir un seuil de taux de passage plus élevé puisqu'on s'attend à ce qu'elles montrent la locomotion diminuée, donc, la neurodégénérescence accrue.

4. Protocole 3 : Analyse histologique

  1. Portant des gants, couper les têtes de mouche avec une lame chirurgicale après l'analyse d'escalade et utiliser un pinceau pour les placer doucement dans 1 ml de fixatif de Carnoy (6:3:1 de 100% EtOH: chloroforme: acide acétique glaciaire) dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 ml O/N à 4 oC. Assurez-vous que les têtes coulent dans la solution fixative.
  2. Remplacez la solution fixative le lendemain par 1 ml de 70 % EtOH et maintenez les échantillons à 4 oC pour une analyse future.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause à cette étape.
  3. Placez les têtes de l'étape 4.2. à un maximum de cinq par cassette microbiopsie. Placez immédiatement les cassettes dans un récipient rempli de 70% EtOH. Entreposez le conteneur à 4 oC avant d'être expédié à une installation d'histologie pour le traitement et l'incorporation de paraffine des têtes. Si de l'équipement pour le traitement et l'intégration des tissus est disponible, suivez l'étape 4.4.
  4. Intégrez les têtes dans la paraffine pour la section du microtome :
    1. Suivez les paramètres du programme d'une machine automatisée de traitement des tissus dans l'ordre présenté dans le tableau 1 pour déshydrater, nettoyer et infiltrer avec la paraffine les têtes.
    2. Transférer les échantillons dans des moules de base métalliques qui s'adaptent à la cassette à l'aide de la paraffine chauffée à 60 oC à l'aide d'une station d'incorporation de paraffine.
    3. Orientez les têtes (orientation antéro-postérieure face au dessus) dans le moule de base utilisant les forceps fins pour permettre la visualisation appropriée du tissu cérébral après sectionnement. Cela peut être fait en réchauffant la paraffine à 60 oC et en repositionnant les têtes si nécessaire.
      REMARQUE: Les moules métalliques peuvent être remplacés par des moules de base jetables.
    4. Placez la cassette sur le dessus du moule de base correspondant et déplacez-les doucement vers le côté réfrigéré de la station d'incorporation de paraffine (4 oC). Attendez que le bloc durcisse avant de le retirer de la station.
    5. Retirez le bloc forme le moule en dissociant doucement le moule de la cassette.
  5. Couper chaque bloc de paraffine avant la section pour minimiser la surface qui sera sectionnée.
  6. Définir le microtome pour couper des sections de 5 m de chaque bloc.
  7. Placer le ruban de paraffine sectionné contenant le tissu dans un bain d'eau chauffé (35 oC) pendant un maximum de 5 min.
  8. Immerger une lame enduite de polylysine (aide à conserver le tissu) dans le bain d'eau chauffé, en plaçant le ruban sectionné sur la glissière à l'aide d'applicateurs en bois. Laissez les glissières sécher à l'air O/N à température ambiante.
  9. Chauffer les toboggans pendant 15 min à 63 oC à l'aide d'un chauffe-lasseurs.
  10. Placez les glissières sur une grille de coloration et tachez avec de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) sous une hotte de fumée en respectant les étapes suivantes.
    1. Placer la grille dans Histochoice (remplacement non toxique du xylène, qui aide à enlever la paraffine de l'échantillon) pendant 5 min.
    2. Transférer le rack dans un récipient rempli d'Histochoice pendant 5 min.
    3. Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH 1 pour 5 min.
    4. Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH 2 pendant 5 min.
    5. Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH pendant 3 min.
    6. Transférer le rack dans un récipient rempli de 70% EtOH pendant 3 min.
    7. Transférer le rack dans un récipient rempli de H2O distillé pendant 5 min.
    8. Transférer le rack dans un récipient rempli d'hematoxylin Harris pendant 2-5 min.
    9. Sortez le support de la solution Hematoxylin et placez-le sous l'eau courante du robinet pendant 10 min.
    10. Transférer le rack dans un récipient rempli d'eau distillée en faisant un dunk court.
    11. Transférer le rack dans un récipient rempli d'Eosin pendant 1-2 min.
    12. Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH en faisant un dunk court.
    13. Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH pendant 5 min.
    14. Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH pendant 5 min.
    15. Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH pendant 5 min.
    16. Transférer le rack dans un récipient rempli d'Histochoice (ou Xylène) pendant 5-10 min jusqu'à ce que toutes les diapositives soient montées.
    17. Montez la glissière et la glissière (24 mm x 60 mm de taille). À l'aide de forceps, retirez la diapositive de la solution Histochoice ou Xylène et faites une mince bande de support de montage sur le dessus de celui-ci. Placez délicatement la couverture sur le dessus, en essayant d'éviter la formation de bulles.
    18. Laissez le support de montage sur les glissières montées durcir O / N sous le capot de fumée avant l'analyse.
    19. Conserver les diapositives tachées dans une boîte à température ambiante.
  11. Quantifier la neurodégénérescence en regardant toutes les sections de série sur la diapositive à un grossissement 20x sous un microscope léger. Examiner l'ensemble du cerveau, en prenant note qualitative de la taille et le nombre de vacuoles qui apparaissent dans trois sections consécutives.
  12. Obtenir des images de sections cérébrales représentatives à environ mi-cerveau à l'aide d'un microscope léger équipé d'un logiciel d'imagerie.

5. Protocole 4 : Cartographie génique du phénotype mmutant récessif

  1. Détraversez la ligne de candidat à un type sauvage CantonS (BL 9517) ou à une autre souche sauvage ou isogéenisée (p. ex., OregonR (BLMD 2376), w1118 (BL-5905) ou yw (BL- 6599) pour déterminer si le phénotype est dominant ou récessif.
    REMARQUE :     Les résultats de cette étape guideront les prochaines étapes de la cartographie. Si le phénotype est récessif, la cartographie des carences peut être effectuée.
    1. À l'aide d'un pinceau, faire une croix en plaçant dans une fiole contenant des aliments CO2-anesthetized mouches de la ligne mutante d'intérêt (5 mâles) et la ligne CantonS (10-15 femelles vierges). Placer le flacon à 25 oC.
    2. Recueillir la progéniture de F1 hétérozygote et répéter l'escalade et les expériences d'histologie.
    3. Comparez les résultats obtenus à la seule ligne de contrôle et aux mutants homozygotes. Une bonne indication du phénotype récessif sera si les mutants hétérozygotes présentent des phénotypes semblables à ceux des mouches de type sauvage.
  2. Effectuer une cartographie méiotique pour estimer grossièrement l'emplacement de la mutation sur le deuxième chromosome à l'aide du wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL-3227) ou d'une souche équivalente avec des marqueurs dominants associés à connu l'emplacement cytologique. Dans ce cas-ci, la mutation était précédemment connue pour être située sur le deuxième chromosome.
    1. À l'aide d'un pinceau, faire une croix en plaçant dans une fiole contenant des aliments CO2-anesthetized mouches de la ligne d'intérêt mutante (5 mâles) et le wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO ligne (10 femelles). Placer le flacon à 25 oC.
      REMARQUE: Le but de cette croix est de générer des femelles hétérozygotes portant le chromosome avec la nouvelle mutation et le chromosome marqueur, qui se recombinera pendant la méiose6,14. La progéniture féminine DeF1 est choisie plutôt que les mâles puisque la recombinaison ne se produit pas chez les mâles.
    2. Recueillir au moins 15 descendants féminins vierges portant le chromosome avec la nouvelle mutation et le chromosome marqueur et les traverser à 5 mâles à partir d'une ligne équilibrée qui porte un autre marqueur dominant visible (par exemple, CyO/snaSco (BL-2555) ou l'équivalent).
    3. Recueillir la progéniture mâle hétérozygote portant Sco ou CyO et le chromosome potentiellement recombiné de la croix dans l'étape 5.2.2. et les accoupler individuellement aux femelles vierges du stock portant le chromosome muté.
    4. Recueillir la progéniture de la croix finale décrite à l'étape 5.2.3. et l'âge des mouches à 29 oC (dans cette étude, les mouches étaient âgées de 10 à 14 jours).
    5. Recueillir des têtes, effectuer une analyse histologique telle que décrite dans le protocole 3 et regarder les diapositives avec des sections du cerveau pour déterminer le degré de neuropathologie tel que décrit à l'étape 4.11. L'analyse histologique est effectuée plutôt que l'analyse de locomotion due aux phénotypes qui peuvent affecter le jeu d'escalade, tels que Jammed (J), qui provoque l'accumulation de liquide dans les ailes15.
  3. Effectuer la cartographie de l'insuffisance sur la région rétrécie du chromosome pour affiner l'emplacement de la mutation récessive à l'aide de l'assay d'escalade. Chaque ligne de carence a une suppression de la région différente des chromosomes, ce qui leur permet d'être utilisés pour des tests de complémentarité.
    1. Commencez par de grandes lacunes qui s'étendent sur la région identifiée dans la cartographie méiotique, qui peut ensuite être encore réduite par l'utilisation de plus petites lacunes. Si l'analyse de carence donne lieu à plus d'un gène candidat, l'utilisation de stocks d'interférences d'ARN (ARNi) est recommandée pour les cibler.
    2. Les lignes transversales du kit de carence de Drosophila 16 pour le deuxième chromosome (DK2L dans cette étude) et recherchent la non-complémentation du phénotype d'intérêt (dans cette étude : taux de réussite de 8,5 % qui correspond au taux de réussite de homozygous vole à partir de la ligne 867 utilisée comme contrôle positif).
    3. Confirmer le phénotype de neurodégénérescence à l'aide de la vérification de l'histologie telle que décrite dans la section 4 (Protocole 3).

6. Protocole 5 : Séquençage et analyse de l'ADN

REMARQUE: Gardez à l'esprit que la mutagénèse ENU introduit des mutations ponctuelles11.

  1. Concevoir des séquences d'amorces avant et inversées flanquant la région exon-codage du gène de gosse pour l'amplification par la réaction de chaîne de polymère (PCR) de la région d'intérêt (dans le cas de la ligne 867 un fragment d'ADN de la taille de 3.247 bp est amplifié pour séquençage17).
  2. Extraire l'ADN d'une seule mouche18 :
    1. Échasser doucement la mouche dans un tube de micro centrifugeuse de 0,5 ml contenant 50 l de tampon Squishing (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, et 200 'g/mL Proteinase K; l'enzyme doit être diluée fraîchement à partir d'un stock congelé avant chaque utilisation) à l'aide d'un p100 ou P200 tipet.
    2. Incuber pendant 30 min à 37 oC
    3. Désactiver la Proteinase K en plaçant le tube à 95 oC pendant 2 min.
      REMARQUE: L'ADN extrait peut être stocké à 4 oC pendant plusieurs mois.
  3. Effectuer la réaction PCR à l'aide d'un Taq Polymériase d'ADN haute fidélité (les réactifs et les conditions de cycle thermique utilisés dans cette étude sont indiqués dans le tableau 2 et le tableau3, respectivement) en respectant les instructions du fabricant et en faisant fonctionner le produit PCR sur un 1 % gel d'agarose contenant invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, qui est une alternative non toxique du bromure d'éhidium.
  4. Acciser la bande de la bonne taille du gel avec un scalpel et purifier le produit PCR en utilisant le Wizard SV Gel et PCR Clean-Up System (Promega) ou kit équivalent, en respectant les instructions du fabricant.
  5. Concevoir des amorces avant et inversées qui seront utilisées pour le séquençage de l'ADN afin de couvrir toute la région d'intérêt, si possible. Séquencez l'ADN purifié de gel de l'étape précédente pour identifier des mutations ponctuelles. Une grande précision dans le séquençage fluorescent automatisé Sanger pourrait être atteint pour un maximum de 700 bp.
    REMARQUE: La polymérase Ex Taq (TaKaRa) peut être utilisée pour amplifier les produits PCR à partir de modèles d'ADN génomique jusqu'à 20 kb de taille.
  6. Analyser les séquences d'ADN obtenues à l'aide de l'éditeur de plasmide A (ApE, par M. Wayne Davis) ou d'un logiciel similaire en les alignant et en les comparant aux séquences obtenues après le séquençage de la même région génomique d'une souche de référence (p. ex., mutagénaire à l'origine ligne).
    1. Ouvrez les fichiers de séquençage avec ApE. À titre de référence, utilisez un fichier ApE contenant la séquence de consensus génomique du gène brat téléchargé dans un format FASTA de Flybase, ou un fichier contenant des résultats pour la séquence de contrôle génétique des antécédents (p. ex., Drosophila mutagéné à l'origine ligne).
    2. Aller à Outils, puis aligner les séquences. À l'aide de la souris de l'ordinateur, sélectionnez toutes les séquences à comparer. N'oubliez pas d'indiquer la séquence de référence utilisée pour cet alignement dans le menu drop.
    3. Inspecter la région séquentée pour les changements de nucléotide par rapport à la séquence de référence. Si vous le souhaitez, enregistrer l'alignement sur l'ordinateur en format .rtf en cliquant sur le texte, puis enregistrer.
      REMARQUE: Si aucune mutation n'était identifiée, le protocole de séquençage et d'analyse de l'ADN serait répété avec des amorces conçues pour inclure des régions non codantes du gène.

7. Protocole 6 : Analyse plus approfondie de la fonction du gène candidat

  1. Effectuer des expériences de sauvetage dans les neuroblastes pour déterminer si le gène est responsable du phénotype de neurodégénérescence.
    1. Double équilibre d'un UAS-brat19 et d'un usiu-Gal4 spécifique au neuroblaste (wor-G4) stocks portant les constructions sur le troisième chromosome, ainsi que la ligne 867, qui est mutante pour le gène brat situé sur le deuxième chromosome.
      1. Faire trois croisements distincts en plaçant dans trois flacons alimentaires différents 5 mâles de UAS-Brat, wor-G4 et 867 lignes et ajouter à chaque ensemble de mâles 10-15 femelles vierges à partir d'une ligne portant des marqueurs et des équilibristes pour la seconde et troisièmechromosomes(Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL-59967).
      2. Recueillir 10-15 femelles vierges de la F1 de chaque croix avec les génotypes suivants: '/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, '/CyO; wor-G4/Tm3,sb et 867/CyO;/Tm3,sb et 5 mâles de chacun des génotypes suivants: '/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, '/Sp; wor-G4/Tm3,sb et 867/CyO;
      3. Croix collégiale /CyO; UAS-brat/Tm3,sb femelles vierges à '/Sp; UAS-brat/Tm3, mâles sb; dans une fiole séparée faire une deuxième croix avec '/CyO; wor-G4 /Tm3,sb femelles vierges à '/Sp; wor-G4/Tm3,sb mâles, puis dans une troisième croix de flacon 867/CyO; '/Tm3,sb femelles vierges et 867/CyO; '/Dr mâles.
      4. À partir de la F1 de chacune de ces croix, recueillir les mâles et les femelles des génotypes suivants: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb de la première croix, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb de la deuxième croix et 867/CyO; Dr/Tm3,sb de la deuxième croix.
      5. Effectuer un dernier croisement entre frères et sœurs recueillis auprès de chaque progéniture de F1 afin d'établir des stocks permanents à double équilibre pour les trois lignes.
    2. Combinez UAS-brat et wor-G4 avec la mutation 867.
      1. Recueillir un nombre suffisant (20-30 mouches) de femelles vierges du 867/CyO; Dr/Tm3,sb double-équilibré stock pour effectuer deux croix.
      2. Placer 10-15 femelles vierges avec 5 mâles du Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (cross #1) et dans une deuxième fiole 10-15 femelles vierges avec 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb mâles.
      3. Recueillir les frères et sœurs de la F1 de chaque croix avec les génotypes suivants: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb de cross #1 et 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb de cross #2. Utiliser la progéniture F1 collectée de chaque croix pour établir des stocks permanents en croisant frères et sœurs entre eux.
        REMARQUE: Après cette dernière étape, les stocks pour 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb et 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb devrait être généré.
    3. Effectuez l'expérience de sauvetage.
      1. Recueillir 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb stock et les traverser à 5-10 mâles à partir du stock 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Comme contrôle, croisez 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb et 15-20 femelles vierges du 867/CyO; Ligne UAS-brat/Tm3,sb à la seule ligne 867/CyO.
        REMARQUE: 867 mouches portent un allèle sensible à la température de brat et la croix de sauvetage doit être effectuée à 29 oC.
      2. Recueillir la progéniture F1 suivante de chaque croix en sélectionnant soigneusement les équilibristes marqués : 867/867; wor-G4/UAS-brat (sauvetage), 867/867; wor-G4/MD (contrôle) et 867/867; UAS-brat/ (contrôle).
      3. Vieillir les mouches comme désiré à 29 oC et effectuer une analyse histologique sur le cerveau pour rechercher la neurodégénérescence en utilisant le protocole décrit dans la section 4 (Protocole 3).
  2. Effectuer l'analyse dépendante de l'âge de la neurodégénérescence chez 867 mutants.
    1. Recueillir 867;pcna-GFP et les mouches témoins de la tifère, qui portent un gène journaliste (pcna-GFP) et sont viables à 25 oC et présentent à la fois une pénétrance plus élevée et une plus grande expressivité du phénotype de neurodégénérescence que 867 seul à ce température17.
    2. L'âge des mouches jusqu'à 5, 15 et 25 comme décrit dans la section 1.4 et effectuer l'analyse histologique ultérieure en suivant le protocole dans la section 4 (Protocole 3).

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Résultats

Dans cet aerticle, nous présentons les étapes utilisées pour identifier la tumeur du cerveau gène (brat) comme jouant un rôle dans le maintien de l'intégrité neuronale (par exemple, la neuroprotection) chez les mouches adultes17; une méthodologie qui peut être utilisée pour identifier les gènes impliqués dans la neuroprotection. Nous avons utilisé une approche génétique avancée (la stratégie est décrite dans la figure 1A

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Discussion

Les écrans génétiques avancés dans Drosophila ont été une approche efficace pour identifier les gènes impliqués dans différents processus biologiques, y compris la neuroprotection dépendante de l'âge5,23,24, 25. En utilisant cette stratégie, nous avons réussi à identifier brat comme un nouveau gène neuroprotecteur17.

Une étap...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous sommes particulièrement reconnaissants au Dr Barry Ganetzky, dans qui est le laboratoire de l'écran génétique a été effectué, permettant l'identification et la caractérisation de l'enfant comme un gène neuroprotecteur. Nous remercions le Dr Steven Robinow d'avoir gentiment fourni la collection de mouches mutagénaires ENU utilisées dans l'écran génétique présenté dans cet article. Nous remercions les membres du laboratoire Ganetzky, les Drs Grace Boekhoff-Falk et David Wassarman pour les discussions utiles pendant toute la durée de ce projet, Ling Ling Ho et Bob Kreber pour l'assistance technique, le Dr Aki Ikeda pour l'utilisation de son installation de microtome à la L'Université du Wisconsin et le Dr Kim Lackey et le Centre d'analyse optique de l'Université de l'Alabama.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement majeur
Hotte pour histologie
Microscope optiqueNikonEclipe E100L’objectif préféré pour l’imagerie est 20x
Logiciel d’imagerie Appareil
Eppendorf
Essai de poussée et de montée des mouches
VWR® ; Flacon de drosophile,VWRétroit 75813-160
VWR® ; Ruban d’étiquetage de laboratoire à usage généralVWR89097-912
Tapis
StéréoscopeModèle MoticSMZ-168
CO2 station d’anesthésie (sarbacane, clapet de pied, tapis anti-mouches ultime)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172 Réservoir de CO2
Brosses à pointe fineSOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila IncubateurVWR89510-750
Gene Mapping
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw  ;Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila ligne utilisée pour la cartographie de recombinaisonBloomington Drosophila Stock Center3227Génotype : wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  ;Bloomington Drosophila Stock Center2555La lignée d’équilibrage de la drosophile utilisée pour la cartographie de la recombinaison
Kit de déficience pour le chromosome 2LBloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Analyse histologique
Ethanol, (100 %)Thermo Fischer ScientificA4094
ChloroformeThermo Fischer ScientificC298-500
Acide acétique glacialThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand&trade ;   ; Tubes de microcentrifugation haut de gamme : 1,5 mLThermo Fischer Scientific05-408-129
Agent nettoyant Histochoice 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HematoxylinVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific&trade ;   ; Richard-Allan Scientific&commerce ; ThermoScientific&négoce ; 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine lames de microscope, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand&trade ;   ; Lunettes de couverture : RectanglesFisherbrand12-545MDimensions : 24 mm x 60 mm
Minuterie traçableVWR
Chauffe-diapositivesBarnstead Internationalmodèle n° 26025
Plateau et supports de diapositivesDWK Life SciencesRack pour contenir 20 diapositives
Fisherbrand&trade ;   ; Pince à usage général extra-longueFisherbrand10-316A
Kimwipes&trade ;Kimberly-Clark et le commerce ; Professionnel  ;
Applicateurs puritains de 6 poucesHardwood Products Company, Guilford, Maine807-12
VWR® ; Lames de rasoirVWR55411-050
Tupperware ou récipients en verre pour liquides d’histologie16 + 1 pour l’eau courante
Lames de microtome à revêtement à profil élevéVWR95057-834
Corning&trade ;   ; Seau à glace rond avec couvercle, 4 LCorning&trade ;
BécherOu autre récipient pour eau glacée et cassettes
Bain de tissuPrecision Scientific Company66630
MicrotomeLeica Biosystems
Analyse moléculaire
Wizard® ; SV Gel et PCR Système de nettoyagePromegaA9282
Ex Taq ADN polyméraseTaKaRa5 U/&mu ; l
Invitrogen&trade ;   ; SYBR&commerce ; Safe&trade ; Coloration de gel d’ADN  ;  ; Invitrogen&trade ;
UltraPure&commerce ; Agarose  ; Invitrogen&trade ;
Échelle d’ADN de 1 Ko Plus  ; Invitrogen&trade ;
ApE-A Plasmid EditorDisponible en téléchargement gratuit
Statistical analysis
R progiciel<
strong>Further analysis
y[1] w[*] ; wg[Sp-1]/CyO ; Dr[1]/TM3, Sb[1]Centre de stock de drosophile de Bloomington59967
photo microscope Nikon Thermocycleur Nikon de souris standardLogiciel

Références

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21(2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816(2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).

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