Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Résumé

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Résumé

L’utilisation de l’alpha-synucléine in vivo du modèle préformé de fibrilles (α-syn PFF) de la synucléinopathie gagne en popularité parmi les chercheurs visant à modéliser la synucléinopathie de la maladie de Parkinson et la dégénérescence nigrostriatale. La normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin d’assurer une pathologie α-syn cohérente et robuste. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la génération de fibrilles à partir des étapes monomères α-syn, post-fibrilisation de contrôle de qualité, et suggéré des paramètres pour l’injection neurochirurgicale réussie de PFFs α-syn dans des rats ou des souris. En commençant par l’α-syn monomérique, la fibrilisation se produit sur une période d’incubation de 7 jours tout en secouant à des conditions de tampon optimales, la concentration et la température. Le contrôle de la qualité post-fibrilisation est évalué par la présence de fibrilles partir par dosage de sédimentation, la formation de conformation amyloïde dans les fibrilles avec un dosage de thioflavine T, et la visualisation microscopique des fibrilles par microscopie électronique. Alors que la validation réussie à l’aide de ces essais est nécessaire pour le succès, ils ne sont pas suffisants pour garantir que les PFFs ensemencer des inclusions α-syn dans les neurones, car cette activité d’agrégation de chaque lot de PFF doit être testée dans la culture cellulaire ou dans les cohortes animales pilotes. Avant l’utilisation, les PFFs doivent être sonicés dans des conditions parfaitement normalisées, suivies d’un examen à l’aide de la microscopie électronique ou de la diffusion dynamique de la lumière pour confirmer que les longueurs de fibrilles sont dans une plage de taille optimale, avec une longueur moyenne de 50 nm. Les PFFs peuvent ensuite être ajoutés aux milieux de culture cellulaire ou utilisés chez les animaux. La pathologie détectable par immunocoloration pour l’α-syn phosphorylée (pSYN; sérine 129) est apparente jours ou semaines plus tard dans la culture cellulaire et les modèles de rongeurs, respectivement.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est principalement caractérisée post-mortem par deux caractéristiques pathologiques majeures: la pathologie généralisée et progressive de l’alpha-synucléine (α-SYN), et la dégénérescence nigrostriatale. Après l’injection dans des souris ou des rats sauvages, les fibrilles α-syn préformées (PFFs) induisent une accumulation progressive de α-syn pathologique, ce qui peut entraîner une dégénérescence prolongée des neurones de la dopamine de substantia nigra pars compacta (SNpc) au cours de plusieurs mois, ainsi que les déficits sensorimoteurs^1,2,3,4,5,6. Les neurones sont exposés à des fibrilles α-syn, soit par injection intracérébrale directe, soit ajoutées aux milieux des neurones cultivés. Lorsque les PFFS sont pris dans les neurones, les PFFS agissent pour «semer» la formation d’inclusions par le biais de modèles, et l’accumulation d’α-syn endogène dans les inclusions phosphorylées^1,7,8, le ⁹. Les inclusions partagent des propriétés similaires aux corps de Lewy: contenant de l’α-syn phosphorylée à la sérine 129 (pSYN), à l’ubiquitine et à la p62; posséder des structures quaternaires amyloïdes, comme le montre la coloration positive de la thioflavine; et résistent à la digestion de la protéinase K^{1,3,5,7,8,9,10},^11, le ¹². L’exposition au PFF conduit à la formation de l’inclusion α-syn dans les neurones primaires et certains neuronaux immortalisés dans la culture, ainsi que chez les souris, les rats et les primates non humains in vivo^{1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13}. Il est important de noter que les PFFs ne mèneront pas à la formation d’inclusion α-syn dans tous les modèles de culture cellulaire et que certains neurones cultivés seront mieux semences que d’autres.

Une autre caractéristique importante du modèle in vivo α-syn PFF est les phases pathologiques séquentielles distinctes qui émergent sur plusieurs mois. Chez les rongeurs, après l’injection intrastriatale, la formation d’inclusion α-syn atteint généralement des pics dans le SNpc et dans de nombreuses régions corticales dans les 1-2 mois. Ce pic d’agrégation est suivi de la dégénérescence nigrostriatale ≈ 2-4 mois plus tard^1,3,5. Ces stades pathologiques distincts fournissent aux chercheurs la plate-forme pour étudier et développer des stratégies qui 1) diminuent l’agrégation α-syn, 2) des inclusions α-syn déjà formées et/ou 3) empêchent la neurodégénérescence subséquente. Le modèle PFF offre des avantages et des inconvénients distincts par rapport aux modèles de surexpression α-syn à médiation virale, transgénique et neurotoxicant, tels que examinés précédemment⁶. Le choix du modèle ou de l’approche à adopter devrait être déterminé par le modèle qui convient le mieux à la question que les enquêteurs demandent.

Bien que le modèle de PFF ait été utilisé avec succès par de nombreux laboratoires, il existe encore des groupes qui ont connu des incohérences avec la production de fibrilles et la production d’une pathologie α-syn cohérente¹⁴. Des exemples d’incohérences vont des PFFs qui produisent peu ou pas de pathologie α-syn, l’efficacité de l’ensemencement par lots, et même l’échec des fibrilles à se former. Ainsi, la normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin de permettre des interprétations exactes de l’impact des nouvelles interventions thérapeutiques. Le protocole suivant décrit les étapes requises pour la génération de PFFs à partir de monomères α-syn, le contrôle de qualité in vitro des PFFs une fois formés, la sonication et la mesure des PFFs avant l’utilisation, et des suggestions pour faciliter l’injection in vivo réussie de PFFs en rats ou en souris.

Protocole

Toutes les méthodes impliquant des animaux ont été approuvées par le Michigan State University institution institutionnelle de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. formation de fibrilles préformées α-synucléine à partir de monomères (figure 1)

1. Décongeler les monomères α-synucléine sur la glace, les resuspendre doucement en effliant le tube et centrifuger à 15 000 x g pendant 10 min à 4 ° c.
   NOTE: le monomère α-syn doit être spécifiquement formulé pour la fibrilisation. Les monomères recombinants peuvent être achetés auprès de sources commerciales ou générés par des protocoles sur le site^4,9,14,15. S’il est acheté auprès de sources commerciales, le produit doit indiquer que le monomère α-syn est spécifiquement destiné à la production de fibrilles. Peu importe si les monomères sont achetés ou générés sur le site, les étapes de contrôle de la qualité décrites ci-dessous doivent être effectuées avec chaque lot pour s’assurer que les fibrilles se sont formées et semences efficacement avant l’utilisation dans les expériences.
2. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL propre et enregistrer la quantité transférée.
   Remarque: Veillez à éviter le granule qui, s’il est présent, sera petit.
3. Mesurer la concentration protéique du surnageant transféré soit par un dosage standard de l’acide bicinchoninique (BCA), soit en mesurant l’absorbance à 280 nm avec un spectrophotomètre à microvolume.
   Remarque: le dosage BCA n’est pas aussi précis pour la mesure spécifique de α-syn et peut donner des résultats surestimation de la concentration protéique. Par conséquent, la mesure de l’absorbance à 280 nm est la méthode recommandée pour déterminer la concentration en protéines.
   1. Pour mesurer avec le dosage BCA, suivre les protocoles standard de BCA et effectuer avec trois dilutions différentes de α-syn monomère. Les dilutions suggérées sont 1:25, 1:50 et 1:100.
   2. Pour mesurer avec la méthode A280, désaler le lecteur avec une solution saline (dPBS) tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium et magnésium, avec une concentration de sel d’environ 100 mM de NaCl, et une plage de pH 7,0-7,3 (tableau des matériaux).
   3. Ajouter 2 μL d’échantillon au lecteur et lire l’absorbance à 280 nm.
   4. Utilisez la loi Beer-Lambert pour déterminer la concentration des monomères.
      
      NOTE: le coefficient d’extinction ε pour l’α-syn humain est 5 960 M^-1cm^-1 et pour la souris α-syn est 7 450 m¹cm^-1. La longueur du chemin est mesurée en cm. le poids moléculaire de l’α-SYN (14 kDa) est estimé en supposant 1 da = 1 g/mol.
4. Diluer les monomères avec 1x dPBS à une concentration finale de 5 mg/mL. Utilisez l’équation ci-dessous pour calculer la quantité de 1x dPBS ajoutée pour diluer les monomères.
   
   NOTE: toutes les concentrations sont en mg/mL, et les volumes en μL. les dilutions monomères doivent être effectuées avec 1x dPBS. Le volume total utilisé pour générer des fibrilles doit être compris entre 100 et 500 μL pour obtenir des résultats de fibrilisation reproductibles.
5. Agiter brièvement pour mélanger, et centrifuger pour collecter tout le liquide au fond du tube. Monomères aliquot pour la comparaison de contrôle de qualité avec des fibrilles comme indiqué dans les étapes 1.8.1-1.8.4.
6. Utiliser une serrure à tube ou une pellicule de cire/plastique (table des matières) pour fixer le couvercle du tube de microcentrifugation fermé.
7. Placer le tube dans un Thermomixer orbital avec un couvercle pendant 7 jours à 37 ° c, en secouant à 1 000 tr/min (table des matières).
   Remarque: à la fin des 7 jours, le contenu du tube doit apparaître trouble. Le Thermomixer doit avoir un couvercle pour empêcher la formation de condensation sur les couvercles du tube.
8. Feuilletez doucement le tube pour Resuspendre les fibrilles α-syn. Les fibrilles aliquot pour les étapes de contrôle de qualité suivantes, comme indiqué dans les étapes 1.8.1-1.8.4.
   Remarque: les fibrilles pour les étapes de contrôle de qualité peuvent être stockées à RT pendant la nuit.
   1. Aliquote 6 μL pour le dosage de la sédimentation.
   2. Aliquote 5 μL pour l’essai de liaison de la thioflavine T.
   3. Aliquote 2 μL pour la microscopie électronique à transmission pour la visualisation des fibrilles.
   4. Aliquote au moins 10 μL pour le dosage de l’endotoxine.
      Remarque: pour l’essai d’endotoxine, un lysat de Limulus Amebocyte (LAL) commercial est utilisé, suivant les instructions du fabricant (tableau des matériaux). Les taux d’endotoxine doivent être ≤ 0,5 unités d’endotoxine/mL pour les fibrilles. Un kit d’enlèvement d’endotoxine peut être utilisé si ce critère n’est pas respecté.
9. Aliquot les fibrilles restantes et stocker. Pour un entreposage à long terme (12-18 mois), congeler rapidement sur de la glace carbonique et conserver à-80 ° c.
   Remarque: le montant à aliquote dépend de l’application souhaitée en aval. L’utilisation in vivo nécessite généralement plus de fibrilles à des concentrations plus élevées que l’utilisation in vitro, et les volumes aliquotes devraient être planifiés en conséquence. Les fibrilles doivent être entreposées vers l’arrière du congélateur pour éviter les dommages causés par le gel/dégel éventuel. Le protocole peut être suspendu ici.

2. dosage de la sédimentation

1. Dans un tube de microcentrifugation propre, ajouter 6 μL de PFF à 54 μL de dPBS pour diluer les fibrilles 1:10 et le pipetage à mélanger.
   1. Dans un tube distinct, ajouter 6 μL de monomère à 54 μL de dPBS en tant que contrôle supplémentaire.
2. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 30 min à RT et transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre.
3. Ajouter 60 μL de dPBS au Pellet restant et le vortex pour le resuspendre.
4. Ajouter 30 μL de tampon d’échantillon 3x (140 μL de 50% de glycérol/0,1% de bleu de bromophénol, 40 μL de SDS de 10% et 20 μL de β-mercaptoéthanol) dans chaque tube et Vortex à mélanger.
5. Incuber les échantillons à 100 ° c pendant 10 min et laisser refroidir pendant 5 min sur la glace.
6. Utiliser un protocole d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) standard de dodécyl sulfate de sodium pour séparer les protéines en masse. Utilisez une échelle protéique avec une fourchette qui comprend 14 kDa (la bande de taille attendue pour le monomère α-SYN).
7. Transférer le gel dans un plat de coloration et recouvrir le gel de taches bleues Coomassie (0,1% de Coomassie bleu brillant, 20% de méthanol en volume et 10% d’acide acétique en volume dans le ddH₂O). Incuber pendant 3 h à RT en secouant.
8. Verser la tache bleue de Coomassie et ajouter suffisamment de destain (50% de méthanol par volume et 10% d’acide acétique en volume dans le ddH₂O) pour recouvrir le gel. Incuber pendant 30 min à RT tout en secouant.
9. Déversez le destain et répétez l’étape de destain jusqu’à ce que le gel soit clair et que les bandes soient visibles.
10. Lavez le gel 3 fois pendant 5 min chacun en secouant le FD₂O et l’image le gel.

3. microscopie électronique à transmission pour visualisation des fibrilles

1. Peser 20 mg d’acétate d’uranyle dans un tube à microcentrifugation et ajouter 1 mL de ddH₂O pour faire une solution aqueuse à 2%. Vortex jusqu’à ce que l’acétate d’uranyle soit en solution, et laisser reposer pendant la nuit.
   NOTE: l’acétate d’uranyl doit être fait la veille de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique à transmission. L’exposition à la lumière ou à l’agitation peut provoquer la précipitation de l’acétate d’uranyle, en tant que tel, le tube contenant la solution d’acétate d’uranyle doit être recouvert de papier d’aluminium, conservé dans un endroit sombre et non secoué après que l’acétate d’uranyle est en solution.
2. Ajouter 2 μL de PFF à 98 μL de dPBS pour diluer les fibrilles 1:50, puis Pipettez pour mélanger.
3. Préparer un film de cire/plastique propre (table des matières) recouvert de surface (environ 50 mm x 50 mm) sur le dessus de banc. Sur la cire propre/film plastique (table des matières), ajouter ce qui suit (figure 2).
   1. Ajouter 4 x 10 μL de gouttes de FD₂O.
   2. Ajouter 1 x 10 μL de fibrilles diluées ou d’échantillon monomère.
   3. Ajouter 2 x 10 μL de gouttes d’acétate d’uranyle à 2%.
4. Utilisez des pinces à pointe fine pour ramasser une grille de microscopie électronique à transmission en cuivre à mailles formvar/revêtuesde carbone (tableau des matériaux).
   Remarque: Assurez-vous de ne ramasser la grille que par le bord, en évitant la partie maillée au Centre (figure 2A). Si la pince touche la maille, le film enduit de formvar/Carbon sera endommagé, rendant l’imagerie dans cette zone de la grille impossible.
5. Faire flotter la grille formvar/revêtement carbone (côté brillant) vers le bas sur la première goutte de FD₂o. Utilisez doucement les pinces pour maintenir la grille et poussez vers le bas pour s’assurer que toute la surface enduite est en contact avec le DDH₂o. Laisser flotter la grille pendant 1 min.
6. Décrochez la grille, et sans toucher la portion maillée de la grille, éloignez le FD₂O avec le papier filtre.
7. Flotter la grille comme ci-dessus sur la deuxième goutte de ddH₂o pendant 1 min et enlever le DDH₂o.
8. Flotter la grille sur la goutte de fibrilles diluées pendant 1 min et enlever l’excès comme ci-dessus.
9. Flotter la grille sur la première goutte d’acétate d’uranyle pendant 1 min et enlever l’excès.
10. Flotter la grille sur la deuxième goutte d’acétate d’uranyle pendant 1 min, enlever l’excès.
11. Flotter la grille comme ci-dessus sur la troisième goutte de ddH₂o brièvement et éloigner le DDH₂o.
12. Flotter la grille comme ci-dessus sur la quatrième goutte de ddH₂o brièvement et éloigner le DDH₂o, étant sûr d’enlever autant de DDH₂o que possible.
13. Transfert vers une zone de quadrillage pour le stockage jusqu’à l’imagerie.
    Remarque: les grilles doivent sécher pendant au moins 5 min avant l’imagerie. Les grilles peuvent être imagées pendant au moins un an après la préparation et doivent être conservées dans un environnement sec.

4. dosage de la thioflavine T

1. Dans un tube de microcentrifugation propre, ajouter 5 μL de PFF à 245 μL de dPBS pour diluer les fibrilles 1:50 et le pipetage à mélanger.
2. Ajouter 250 μL de dPBS à un tube de microcentrifugation distinct pour servir de contrôle négatif.
3. Ajouter 5 μL de monomère à 245 μL de dPBS pour servir de contrôle monomère.
4. Ajouter 250 μL de thioflavine T dans le tampon de glycine (25 μM de thioflavine T, 100 mM de glycine, 1% de Triton X-100, pH 8,5) à chaque échantillon et mélanger doucement.
5. Pipet 2 réplique, 200 μL chacun, dans une plaque de puits 96 noir. Garder la plaque dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment.
6. Incuber pendant 1 h à RT et lire la plaque à l’aide d’une excitation de 450 nm et d’une émission de 510 nm.
   Remarque: les lectures de thioflavine T fluctuent au fil du temps. Les échantillons doivent être lus à la même période d’incubation. Si désiré, plusieurs lectures peuvent être prises pendant l’incubation d’heure et tracées au fil du temps.

5. sonication des fibrilles préformées α-synucléine

ATTENTION: le sonicateur et toutes les étapes de sonication sont effectuées dans un capot de culture pour éviter l’exposition aux fibrilles qui peuvent aérosolize pendant la sonication. Le personnel effectuant les étapes de sonication devrait porter l’équipement de protection personnelle, y compris les gants, la protection de vêtement sous la forme d’une couche de laboratoire, et un bouclier facial pendant sonicating. Risque d’exposition de fibrille peut être réduit par sonication avec un Sonicator de corne de tasse, permettant le tube contenant des fibrilles pour rester fermé pendant la sonications.

Remarque: les paramètres de sonication optimaux des fibrilles dépendent du modèle de sonicateur utilisé. Pour cette raison, une certaine optimisation devra être effectuée pour s’assurer que les fibrilles sont de la bonne taille. Le sonicateur utilisé peut être trouvé dans le tableau des matériaux et les paramètres décrits sont basés sur les résultats précédents avec ce modèle de sonicateur. Les paramètres ci-dessous fonctionneront pour 2-4 μg/μL de PFFs dans 200-400 μL de solution. Test sonication avec l’instrument doit être effectuée et fibrilles analysés pour s’assurer que les résultats souhaités sont obtenus avant l’utilisation des PFFs dans les expériences.

1. Fixez une sonde de diamètre 3,2 mm (tableau des matériaux) au convertisseur, et réglez les paramètres de sonicateur comme indiqué ci-dessous à l’étape 5.1.1-5.1.3.
   1. Réglez l’amplitude à 30%.
   2. Réglez le pouls sur 01 01 (1 s allumé; 1 s éteint).
   3. Réglez l’heure sur 0:01:00.
      Note: 1 min de pulsation équivaut à 60 impulsions, et ce modèle de sonicateur (table des matières) s’arrêtera automatiquement. Avec d’autres modèles de sonicateur, le nombre d’impulsions devra être compté.
2. Décongeler les fibrilles à RT et diluer avec des dPBS stériles dans un capot de culture.
   Remarque: un tube de microcentrifugation de 0,6 mL clair fonctionne mieux pour sonication et la concentration finale de fibrilles dépend de l’utilisation prévue. Les résultats représentatifs présentés proviennent d’une concentration finale de fibrilles de 4 μg/μL.
3. Essuyez la sonde du sonicateur avec un tissu de laboratoire humidifié avec 70% d’éthanol pour nettoyer la sonde. Plongez la pointe de la sonde dans le ddH₂O et l’impulsion 10 fois pour nettoyer la sonde, puis essuyez-la avec un tissu de laboratoire.
4. Placer la pointe de la sonde dans le tube de fibrilles diluées et positionner l’embout au fond du tube.
5. Sonicate pour 60 impulsions (1 s sur; 1 s désactivé). Déplacez la sonde vers le haut et vers le bas pendant chaque impulsion pour s’assurer que tous les fibrilles dans le liquide sont sonicated. et propre.
6. Après 60 impulsions, retirer la sonde des PFFs et ajouter 2 μL de PFF à 98 μL de dPBS dans un tube de microcentrifugation propre pour diluer les fibrilles 1:50 pour la mesure de la fibrille sonicée par microscopie électronique.
   NOTE: Idéalement, un petit sous-ensemble de fibrilles doit être mesuré avant l’injection in vivo et une mesure plus complète des fibrilles effectuées lorsque le temps le permet.
7. Après sonication, brièvement centrifuger PFFs pour 1 s à 2 000 x g pour recueillir tout le liquide sur les côtés du tube.
   ATTENTION: si le tube devient chaud au toucher, arrêtez de sonication après 30 impulsions, attendez 1 min, et sonication pour les 30 dernières impulsions.
   Remarque: pendant la sonication, maintenez la pointe de la sonde vers le fond du liquide au début de chaque impulsion, trop près de la partie supérieure du liquide causera une perte d’échantillon.
8. Plonger la pointe de la sonde dans une SDS de 1% et l’impulsion 10 fois pour nettoyer la sonde. Retirez l’embout de la FDS, submerger dans ddH₂O et Pulse 10 fois.
9. Essuyez la sonde avec un tissu de laboratoire humidifié avec 70% d’éthanol, puis essuyez la sonde avec un tissu de laboratoire sec. Détachez la sonde du convertisseur et rangez-la.
10. Essuyez toutes les surfaces de la hotte avec 1% de SDS, suivies de 70% d’éthanol.
    Remarque: la solution SDS à 1% est utilisée pour dissocier les fibrilles et nettoyer les surfaces et l’équipement¹⁶.

6. microscopie électronique à transmission pour la mesure des fibrilles sonicées

Remarque: si la microscopie électronique n’est pas réalisable, un essai de cinétique de la thioflavine et une diffusion dynamique de la lumière peuvent être utilisés comme mesures indirectes de l’efficacité des semis et de la taille des fibrilles^4,14.

1. Préparez les échantillons en utilisant le protocole de la section «microscopie électronique pour la visualisation des fibrilles» ci-dessus.
2. Utiliser un microscope électronique à transmission pour prendre une image de fibrilles de 6 à 10 ouvertures de grilles différentes.
   Remarque: les images doivent être d’un grossissement suffisamment élevé pour mesurer les fibrilles, mais suffisamment basses pour visualiser simultanément plusieurs fibrilles. Un grossissement final d’environ 75 000x devrait suffire.
3. Mesurez la longueur d’un petit sous-ensemble d’au moins 25 fibrilles avant d’utiliser des fibrilles dans une expérience.
   Remarque: ces mesures peuvent généralement être effectuées à l’aide du logiciel d’imagerie associé au microscope. Pour la validation rapide, la personne qui mesure doit sélectionner des fibrilles représentatives et calculer la taille moyenne. La longueur des fibrilles devrait être moyenne autour de 50 nm ou moins, avec une mesure plus précise à suivre.
4. Mesurez les longueurs de 500 + fibrilles pour obtenir des résultats plus complets.
   Remarque: le logiciel d’imagerie associé au microscope peut être utilisé pour les mesures de fibrilles. Alternativement, les images peuvent être ouvertes et les fibrilles mesurées avec le logiciel de traitement d’image, en utilisant la barre d’échelle associée à chaque image comme une référence de taille pour comparer les longueurs de fibrille.

7. préparation des seringues à aiguilles en verre sur mesure pour les injections stéréotactiques (figure 3)

1. Ajouter environ 10 mL de réactif siliconant (table des matières) à un bécher de 50 ml propre.
2. Placer les tubes capillaires en verre (longueur 54 mm; diamètre extérieur: 0,86 mm; diamètre intérieur 0,59 mm) verticalement dans le bécher du réactif siliconant et permettre à l’action capillaire de tirer le réactif siliconant vers le haut du tube à travers l’ouverture du tube inférieur immergée dans le réactif de siliconisation.
3. Pipetage de réactif de siliconisation supplémentaire dans l’orifice supérieur du tube qui n’est pas immergé dans le réactif de siliconisation pour remplir complètement le tube capillaire en verre.
4. Retirer les tubes capillaires du réactif siliconant et éponger les extrémités ouvertes des tubes sur une serviette en papier pour enlever le réactif siliconant dans les tubes. Laisser sécher les tubes capillaires pendant au moins 8 heures.
5. Placer un tube capillaire en verre siliconé dans un extracteur d’aiguilles en verre (table des matières).
6. Allumez l’élément chauffant et laissez les masses attachées étirer le tube capillaire en verre chauffé.
7. Coupez le tube capillaire en verre tiré avec des ciseaux au point le plus fin au milieu et retirez l’aiguille en verre de l’extracteur de l’aiguille en verre.
   Remarque: le diamètre intérieur et extérieur de l’aiguille tirée doit être d’environ 80 et 100 μm respectivement. Plusieurs aiguilles en verre peuvent être fabriquées en une seule fois et conservées jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être fixées à une seringue en verre avec une aiguille en métal attachée (table des matières).
8. Coupez une longueur de tubulure thermorétractable (diamètre intérieur moyen 0,021 "et épaisseur moyenne de paroi 0,001") à environ 40 mm avec des ciseaux. Glissez le film rétractable sur l’aiguille métallique d’une seringue biseautée de 10 μL (tableau des matériaux).
9. Utilisez une flamme nue pour chauffer et collez l’enveloppe rétractable à l’aiguille tout en tournant l’aiguille pour appliquer la chaleur uniformément.
10. Glissez délicatement l’extrémité plus grande de l’aiguille en verre tirée sur l’aiguille métallique de la seringue.
11. Coupez une longueur de tubulure thermorétractable (diamètre intérieur moyen 0,036 "et épaisseur moyenne de paroi 0,005") à environ 40 mm avec des ciseaux et glissez délicatement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille en métal de la seringue (tableau des Matériaux). Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe rétractable pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal.
12. Ajouter une couche supplémentaire de rétrécissement-Wrap pour fixer l’aiguille en verre. Coupez une longueur de tubulure thermorétractable (diamètre intérieur moyen 0,044 "et épaisseur moyenne de paroi 0,005") à environ 40 mm avec des ciseaux et glissez délicatement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille en métal de la seringue (tableau des Matériaux). Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe rétractable pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal.
13. Coupez l’aiguille en verre avec des ciseaux pour que l’embout soit d’environ 8 mm de long.
    Remarque: l’aiguille doit être suffisamment longue pour cibler les régions cérébrales souhaitées (la longueur requise dépend des coordonnées dorsale/ventrale).
14. Utiliser les étapes 7.14.1-7.14.3 pour tester l’aiguille pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuites et qu’il y a un écoulement adéquat à la fois en retirant et en distribuant le liquide de l’aiguille en verre.
    1. Remplir une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 26 jointe avec dH₂O.
    2. Retirez le piston métallique de la seringue à aiguille en verre sur mesure et insérez l’aiguille de la seringue remplie de dH₂O dans la base de la seringue. Appliquez une pression pour distribuer dH₂O de l’aiguille en verre. Inspecter l’interface de l’aiguille en verre et l’aiguille en métal pour les fuites et confirmer un flux de dH₂O stable.
       Remarque: si nécessaire, l’aiguille en verre peut être ajustée pour augmenter la facilité d’écoulement et des couches supplémentaires de rétrécissement-Wrap ajouté pour corriger les fuites de la base de l’aiguille en verre.
    3. Remplir un tube de microcentrifugation avec dH₂o. Utilisez la seringue à aiguille en verre sur mesure pour dessiner dans le DH₂o. Inspectez l’aiguille pour confirmer que le liquide est pris dans la seringue et qu’il n’y a pas de bulles.
       Remarque: s’il y a des bulles ou₂O DH n’est pas aspiré dans l’aiguille, l’ajustement de l’aiguille peut aider à soulager la pression.
15. Conservez soigneusement la seringue avec les aiguilles en verre attachées dans les boîtes de seringues jusqu’à ce que nécessaire pour les chirurgies.
16. Utiliser des méthodes de chirurgie stéréotaxique standard pour la livraison intrastriatale de PFFs à des coordonnées optimisées chez les souris (un site: AP + 0,2 mm et ML + 2,0 mm de Bregma, DV-2,6 mm de Dura) ou chez le rat (deux sites: AP + 1,6 mm et ML + 2,0 mm de Bregma, DV-4,0 de Dura; AP + 0,1 mm et ml + 4,2 mm de Bregma, DV-5,0 de Dura)^1,14,17.
    Remarque: ces coordonnées ont été utilisées chez les souris C57BL6/C3H et les rats Fischer 344. Lors de l’utilisation d’autres souches, les coordonnées doivent être optimisées.

Résultats

La génération de fibrilles de monomères α-syn commence par la détermination de la concentration des monomères. Le dosage de la BCA et la mesure de l’absorbance à 280 nm (A280) peuvent être utilisés pour mesurer la teneur en protéines; les résultats de l’analyse BCA, cependant, suggèrent une concentration plus élevée que la méthode A280. Les PFFs dérivés du monomère α-syn de la souris ont une valeur de BCA de 14,05 ± 0,22 et un A280 de 8,05 ± 0,03 μg/μL (figure 1). De même, les PFFs dérivés du monomère α-syn humain semblaient également être à une concentration plus élevée, avec une valeur de BCA de 12,95 ± 0,38 et un A280 de 7,83 ± 0,05 μg/μL (figure 1). Les mesures A280 sont spécifiques à α-SYN en fonction de l’inclusion des coefficients d’extinction et ces résultats ont été utilisés pour diluer les monomères avant l’incubation de 7 jours.

Avant l’incubation, le liquide contenant les monomères α-syn était clair, mais il devrait apparaître trouble après la formation de fibrilles. L’examen par microscopie électronique à transmission confirme la présence de fibrilles longues mesurant 10-20 nm de large (figure 4). En comparaison, les monomères α-syn étaient à peine visibles, sans forme apparente (figure 4). Avec la confirmation visuelle des structures fibrillaires, la conformation amyloïde des fibrilles est la prochaine caractéristique des PFFs qui devrait être confirmée à l’aide d’un dosage de thioflavine T. La thioflavine T présente une fluorescence accrue lorsqu’elle se lie à l’amyloïde; ainsi, l’augmentation du signal fluorescent des échantillons indique la présence d’amyloïde. À titre d’exemple, la thioflavine dans les dPBS a produit un signal de 3 287 ± 580 unités fluorescentes relatives (RFU), le monomère α-syn de souris a produit un signal de 4 174 ± 158 RFU, et les PFFs de souris ont produit un signal de 59 754 ± 6 224 RFU (figure 5). En comparaison, le monomère α-syn humain a produit un signal similaire de 4 158 ± 105 RFU au monomère de souris, et les PFFs humains ont produit un signal plus élevé de 1 235 967 ± 113 747 RFU par rapport aux PFFs de souris (figure 5). Pour évaluer la présence de fibrilles partir, un dosage de sédimentation a été effectué. Les fibrilles vont granule avec centrifugation. Dans les échantillons de la souris et du PFF humain, la fraction surnageante devrait avoir plus de protéines dans le culot que le surnageant (figure 6). En revanche, la majorité de la protéine de la souris et des monomères humains était présente dans le surnageant, avec peu de présent dans la granule (figure 6). Avec les PFFs visiblement présents par microscopie électronique, les structures amyloïdes présentes et les fibrilles pelletable, les PFFs ont passé toutes les étapes de contrôle de la qualité in vitro.

La souris et les PFFS humains ont été soniqué pour produire des PFFS de longueurs appropriées pour ensemencer des inclusions α-syn^4,18. Les PFFs ont été dilués à la concentration désirée de 4 μg/μL et sonication. Immédiatement avant la chirurgie, 25 fibrilles représentatives ont été imagées par microscopie électronique et mesurées pour vérifier la taille du fibrille. Les PFFS de souris soniqué ont mesuré 48,8 ± 3,1 nm, alors que les PFFS humains ont mesuré 52,1 ± 4,4 nm de longueur; Les PFFs des deux espèces étaient donc la longueur appropriée (50 nm ou moins) pour induire l’activité d’ensemencement. Un examen plus approfondi d’environ 500 fibrilles a révélé la longueur moyenne et la longueur de la distribution des fibrilles de souris soniqué. La longueur moyenne était de 44,4 ± 0,6 nm, avec 86,6% des PFFs mesurant 60 nm ou moins (figure 4). En comparaison, les PFFs humains se sont établis en moyenne à 55,9 ± 1,1 nm avec 69,6% des PFFs mesurant 60 nm ou moins (figure 4).

Après l’injection intrastriatale de PFFS de souris soniqué dans des rats comme décrit précédemment^3,5, une série de sections tissulaires ont été traitées à 2 mois après la chirurgie, lorsque le nombre d’inclusion contenant des neurones est connu pour culminé dans le SNpc, pour la confirmation des inclusions α-syn phosphorylées⁵. Les neurones porteurs d’inclusion, comme indiqué par la coloration immunohistochimique pour le pSyn (anticorps dans la table des matières), sont présents dans le SNPC (figure 7), ainsi que dans d’autres régions du cerveau qui innervent le striatum (antérieur noyau olfactif, moteur, cingulate, piriforme, prélimbique, somatosensoriel, entorhinal et cortices insulaires, amygdala, striatum)^1,3,4,5,19. Ces inclusions partagent des propriétés similaires avec des corps Lewy, tels que la liaison de la thioflavine S, et la résistance de l’α-syn total à la protéinase K (figure 7), comme le montre la coloration immunohistochimique (anticorps et protéinase k dans la table des matières) . La confirmation de l’ensemencement dans le cerveau indique que le contrôle de qualité in vivo a été passé, et les aliquotes des PFFs précédemment congelés et sauvés du même lot peuvent être sonicés sous des paramètres identiques, avec des longueurs validées, dans des expériences plus larges.

Figure 1 . Méthodes pour la génération de fibrilles α-syn. Aperçu des étapes requises pour produire des fibrilles à partir de monomères α-syn. Les monomères sont centrifugés pendant 10 min (15 000 x g, à 4 ° c). Le surnageant est transféré dans un tube propre et la concentration protéique est déterminée soit par l’absorbance à 280 nm, soit par un dosage BCA. Le graphique montre les concentrations des monomères α-syn humains et de souris. Les colonnes indiquent les moyennes de groupe, les barres d’erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Après avoir déterminé la concentration en protéine, les monomères α-SYN sont dilués, brièvement vortexés et incubés pendant 7 jours pour 37 ° c, tout en secouant sur un mélangeur orbital réglé à 1 000 rpm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 2 . Méthodes de coloration pour la microscopie électronique par transmission. Diagramme de coloration négative pour la microscopie électronique. A) images illustrant des grilles d’échantillons de microscopie électronique. La grille a un côté terne ou léger et un côté brillant ou sombre. Le côté brillant/sombre est recouvert d’un film de support formvar/Carbon. B) illustration de la procédure de coloration. La grille est flottée côté brillant/sombre vers le bas sur la première goutte de FD₂O pendant 1 min et l’excès est méchant loin avec du papier filtre. Le processus est répété avec la deuxième goutte de FD₂o, les PFFS dilués ou les monomères, deux gouttes d’acétate d’uranyle et deux gouttes supplémentaires de DDH₂o. les grilles peuvent être stockées dans une boîte de grille jusqu’à ce qu’elles soient imagées. Barre d’échelle = 3 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 . Assemblage de seringues à aiguilles en verre sur mesure. Schéma des étapes requises pour assembler les seringues attachées à l’aiguille en verre. Les tubes capillaires en verre siliconisé sont tirés et coupés au milieu pour produire des aiguilles en verre. Le tube rétractable est utilisé pour préparer l’aiguille en métal et former un joint intérieur lorsque l’aiguille en verre est glissade sur l’aiguille en métal. Deux couches additionnelles de tubes rétractables qui chevauchent la base de l’aiguille en verre et l’aiguille en métal sont ajoutées consécutivement et la chaleur appliquée pour fixer l’aiguille en verre et former un joint étanche à l’eau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 . Visualisation des monomères α-syn et des fibrilles α-syn par microscopie électronique à transmission. Micrographies représentatives des monomères α-syn et des fibrilles. Panneaux supérieurs: souris et humain α-syn monomère. Panneaux du milieu: souris pleine longueur et PFFs α-syn humains. panneaux inférieurs: souris et humains α-syn PFFs après sonication. Graphique du bas: distribution de la souris soniqué et des longueurs de PFF α-syn humaines. Barre d’échelle = 500 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 . Confirmation des structures amyloïdes par dosage de thioflavine T. Mesure du signal fluorescent à partir d’échantillons de souris et de monomère α-syn humain et de PFF. Gauche: résultats des monomères α-syn de souris et des PFFs α-syn. Droite: résultats des monomères α-syn humains et des PFFs α-syn. Un contrôle négatif dPBS est affiché dans chaque graphe. Toutes les mesures sont exprimées en unités fluorescentes relatives (RFU). Les colonnes indiquent les moyennes de groupe, les barres d’erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 . Dosage de la sédimentation pour la partir α-syn. images de gels colorés de Coomassie. Les bandes montrées sont à environ 14 kDa en fonction de l’échelle protéique. Gauche: souris monomère et PFFs. A droite: monomères et PFFs humains. Pour tous les échantillons de monomère et de PFF, on montre le culot (P) et le surnageant (S) resuspendus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 . Caractéristiques des inclusions dans le modèle de rat confirmant la pathologie α-syn. Micrographies représentatives de la substantia nigra pars compacta à 2 mois après l’injection. Gauche: neurones contenant pSyn et contre-teinté avec le violet de cresyle. Milieu: neurones positifs de la thioflavine S. Droite: inclusions contenant de l’α-syn résistantes à la protéinase K. barre d’échelle = 50 μM. veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La production de PFFs α-syn capables d’ensemencer des neurones et conduisant à des inclusions de corps-like Lewy dépend de plusieurs facteurs et étapes. Un facteur essentiel est que les monomères utilisés pour produire des fibrilles doivent être formulés spécifiquement pour la fibrilisation^4,9,14,15. Si les monomères ne sont pas formulés pour la fibrilisation, les fibrilles ne peuvent pas se former ou les fibrilles qui ne forment pas peuvent produire une pathologie α-syn. De même, le tampon que les monomères influencent également la fibrilisation. À ce titre, pour obtenir les meilleurs résultats, la concentration de sel doit être d’environ 100 mM de NaCl et de pH entre 7,0 et 7,3. Une première étape qui introduit la variabilité est la méthode par laquelle la teneur initiale en protéines est déterminée, avec une mesure à A280 susceptibles de produire des résultats plus précis et est donc la méthode préférée. L’écart dans la concentration de protéines peut diminuer l’efficacité du processus de fibrilisation, ainsi que modifier la concentration supposée de PFF utilisée dans les expériences. Les deux pourraient entraîner une diminution de l’efficacité des semis et de la variation des lots entre les expériences.

Les mesures initiales de contrôle de la qualité confirmeront les caractéristiques critiques des PFFS, en particulier qu’elles ont une conformation fibrillaire (microscopie électronique), contiennent des structures amyloïdes (dosage de la thioflavine T) et sont partir (dosage de la sédimentation). Il est important de noter que les résultats du dosage de la thioflavine T fluctueront avec le temps et ne sont pas une mesure directe de la quantité de structures amyloïdes présentes, plutôt, le dosage de la thioflavine T ne doit être utilisé que comme un indicateur de la présence de structures amyloïdes dans l’échantillon. La thioflavine T est généralement utilisée dans les essais in vitro, tels que le dosage susmentionné pour montrer que les fibrilles contiennent des structures amyloïdes. Alternativement, la thioflavine S est utilisée dans le tissu pour détecter les structures amyloïdes, comme le montre la figure 7. En ce qui concerne le dosage de la sédimentation, les résultats montrent seulement que les PFFS se trouvent principalement dans la fraction partir. Comme les échantillons sont exécutés dans des conditions de dénaturation, une seule bande proéminente d’environ 14 kDa, la taille des monomères α-syn, est présente sur les gels. C’est à la différence des bandes multiples présentes à des poids moléculaires plus élevés qui seraient attendus avec des PFFs si un gel natif ou non dénaturant a été utilisé. Enfin, la réussite de toutes ces étapes initiales de contrôle de la qualité ne garantit pas l’activité d’ensemencement de l’inclusion α-syn. Pour cette raison, des expériences de culture cellulaire ou une petite cohorte d’animaux injectés chirurgicalement devraient être utilisées pour tester l’efficacité des PFFs avant utilisation dans des expériences plus larges.

Sonication est une étape cruciale dans le processus et les paramètres différeront selon le modèle de sonicateur utilisé. Les paramètres de sonication doivent être appliqués et vérifiés pour montrer que des fragments de PFF courts ont été produits. La taille des fibrilles a un rapport avec l’ensemencement, avec des semis plus courts plus efficacement. Bien que les semences plus courtes fibrilles plus efficacement, cet effet plateaux et la longueur optimale PFF est d’environ 50 nm^4,18. Il est également important de ne pas sur-sonicate les échantillons et exposer les PFFs à la chaleur excessive, car cela peut diminuer l’efficacité des semis. Ces PFFS soniqué doivent être testés pour l’efficacité dans la culture de petites cellules ou des expériences in vivo avant d’utiliser dans des expériences à plus grande échelle. Comme différentes séances de sonication ont le potentiel d’introduire la variabilité, les groupes de traitement expérimental devraient être planifiés en conséquence.

Lors de la livraison de PFFS in vivo, la localisation du ou des sites d’injection et la quantité totale de PFFS utilisés peuvent affecter le nombre de neurones qui développeront des inclusions ainsi que l’étendue de la neurodégénérescence^7,14. Les coordonnées dans le protocole fournissent un endroit pour commencer, mais doivent être testées dans le laboratoire pour s’assurer que la région cible souhaitée développe la pathologie α-syn avant d’utiliser dans des expériences à grande échelle. Si désiré, le suivi de colorant ou de billes fluorescentes peut être utilisé comme un moyen de tester le ciblage régional avant d’utiliser des PFFs. La quantité de PFFS utilisé in vivo varie entre les groupes, la plupart des groupes utilisant un total compris entre 5 et 20 μg de PFFS à un ou divisé entre deux sites d’injection^{1,2,3,4,5 ,} le ^{6 ,} le ^{7 , 14}. comme le nombre de sites d’injection, l’emplacement des sites d’injection, et la quantité de PFFS injectés peuvent affecter les résultats et la progression de la synucléinopathie, les résultats en aval des paramètres utilisés doivent être caractérisés avant d’utiliser le modèle pour tester les interventions potentielles ou examiner les caractéristiques temporelles du modèle.

Lors de la sélection d’un modèle à utiliser pour tester des thérapies ou étudier la progression de la maladie, le modèle utilisé doit être sélectionné pour répondre au mieux à la question posée. Tous les modèles ne posséderont pas certaines caractéristiques pathodynamiques de la maladie ou offriront le délai nécessaire pour tester les interventions potentielles. Le modèle de PFF récapitule les principales caractéristiques de la DP, telles que la pathologie α-syn et la neurodégénérescence, et peut conduire à des déficiences motrices modestes. Le modèle offre un temps-cours prévisible et prolongé, où les inclusions forment des mois avant la neurodégénérescence. Cela permet aux chercheurs d’examiner et d’exploiter les différentes phases tout au long de la progression prolongée de la synucléinopathie. L’utilisation actuelle et future du modèle global devrait être bénéfique dans l’étude de la progression de la maladie et du développement de nouvelles thérapies.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
Anticorps anti-alpha-synucléine (phosphorylée à la sérine 129)	Abcam	AB184674
Anticorps anti-alpha-synucléine	Abcam	AB15530
Acide bicchonique	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Tube rétractable médical transparent (0,036" de diamètre intérieur)	Nordson Medical	103-0143
Tube rétractable médical transparent (diamètre intérieur de 0,044 po)	Nordson Medical	103-0296
Sulfate de cuivre	Thermo Fisher (Pierce PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Couvercle chauffant Eppendorf ThermoTop	Eppendorf	5308000003
Formvar/Revêtement carbone grilles de microscopie électronique	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Tube capillaire en verre (0,53 mm de diamètre extérieur ; 0,09 mm de diamètre intérieur ; 54 mm de longueur)	Drummond	22-326223
Extracteur d’aiguille en verre	Narishige	PC-10
Seringue Hamilton		80000
Monomère alpha-synucléine humaine pour générer des fibrilles préformées	Proteos	RP-003
Monomère d’alpha-synucléine de souris pour générer des fibrilles préformées	Proteos	RP-009
Orange Medical Shrink Tubing (0,021" de diamètre intérieur)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Protéinase K	Invitrogen	25530015
pointe	Qsonica 3,2 mmQsonica	4422
Qsonica Q125 Sonicateur	Qsonica	Q125
Thioflavin S	Sigma-Aldrich	T1892
Thioflavin T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Kit de dosage d’endotoxines LAL chromogènes	Genscript	L00350C
Acétate d’uranyle	Microscopie électrique Sciences	22400