Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Katherine Chan; Amy  Hin Yan Tong; Kevin  R Brown; Patricia Mero; Jason Moffat

doi:10.3791/59780

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Article de méthode

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

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DOI :

10.3791/59780

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4 septembre 2019

Katherine Chan^*¹ , Amy Hin Yan Tong^*¹ , Kevin R Brown¹ , Patricia Mero¹ , Jason Moffat¹^,²^,³

¹Donnelly Centre, University of Toronto, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Résumé

L'édition du génome à l'aide du système CRISPR-Cas a considérablement avancé la capacité d'éditer avec précision les génomes de divers organismes. Dans le contexte des cellules de mammifères, cette technologie représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome pour des études de génomique fonctionnelle. Les bibliothèques d'ARN guides (sgRNA) ciblant tous les cadres de lecture ouverts permettent la génération facile de milliers de perturbations génétiques dans un seul pool de cellules qui peuvent être dépistés pour des phénotypes spécifiques pour impliquer la fonction génique et les processus cellulaires dans un impartiale et systématique. Les écrans CRISPR-Cas fournissent aux chercheurs une méthode simple, efficace et peu coûteuse pour découvrir les plans génétiques des phénotypes cellulaires. En outre, l'analyse différentielle des écrans exécutés dans diverses lignées cellulaires et de différents types de cancer peut identifier des gènes qui sont contextuellement essentiels dans les cellules tumorales, révélant des cibles potentielles pour des thérapies anticancéreuses spécifiques. L'exécution d'écrans à l'échelle du génome dans les cellules humaines peut être intimidante, car cela implique la manipulation de dizaines de millions de cellules et nécessite l'analyse de grands ensembles de données. Les détails de ces écrans, tels que la caractérisation des lignées cellulaires, les considérations de bibliothèque CRISPR, et la compréhension des limites et des capacités de la technologie CRISPR au cours de l'analyse, sont souvent négligés. Fourni ici est un protocole détaillé pour la performance réussie des écrans à base de génome regroupés À l'échelle du génome CRISPR-Cas9.

Introduction

CRISPR-Cas, abrégé pour les répétitions palindromic courtes régulièrement interspatiales et les nucléases associées au CRISPR, se compose d'une seule protéine nucléase (p. ex. Cas9) en complexe avec un ARN guide synthétique (sgRNA). Ce complexe de ribonucléoprotéines cible l'enzyme Cas9 pour induire des ruptures d'ADN à double brin à un locus génomique spécifique¹. Les pauses à double brin peuvent être réparées par l'intermédiaire d'une réparation dirigée par homologie (HDR) ou, plus généralement, par l'assemblage de fin non homologue (NHEJ), un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne une insertion et/ou des suppressions (INDELS)....