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Article de méthode

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

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DOI :

10.3791/59780

⸱

4 septembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Résumé

L'édition du génome à l'aide du système CRISPR-Cas a considérablement avancé la capacité d'éditer avec précision les génomes de divers organismes. Dans le contexte des cellules de mammifères, cette technologie représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome pour des études de génomique fonctionnelle. Les bibliothèques d'ARN guides (sgRNA) ciblant tous les cadres de lecture ouverts permettent la génération facile de milliers de perturbations génétiques dans un seul pool de cellules qui peuvent être dépistés pour des phénotypes spécifiques pour impliquer la fonction génique et les processus cellulaires dans un impartiale et systématique. Les écrans CRISPR-Cas fournissent aux chercheurs une méthode simple, efficace et peu coûteuse pour découvrir les plans génétiques des phénotypes cellulaires. En outre, l'analyse différentielle des écrans exécutés dans diverses lignées cellulaires et de différents types de cancer peut identifier des gènes qui sont contextuellement essentiels dans les cellules tumorales, révélant des cibles potentielles pour des thérapies anticancéreuses spécifiques. L'exécution d'écrans à l'échelle du génome dans les cellules humaines peut être intimidante, car cela implique la manipulation de dizaines de millions de cellules et nécessite l'analyse de grands ensembles de données. Les détails de ces écrans, tels que la caractérisation des lignées cellulaires, les considérations de bibliothèque CRISPR, et la compréhension des limites et des capacités de la technologie CRISPR au cours de l'analyse, sont souvent négligés. Fourni ici est un protocole détaillé pour la performance réussie des écrans à base de génome regroupés À l'échelle du génome CRISPR-Cas9.

Introduction

CRISPR-Cas, abrégé pour les répétitions palindromic courtes régulièrement interspatiales et les nucléases associées au CRISPR, se compose d'une seule protéine nucléase (p. ex. Cas9) en complexe avec un ARN guide synthétique (sgRNA). Ce complexe de ribonucléoprotéines cible l'enzyme Cas9 pour induire des ruptures d'ADN à double brin à un locus génomique spécifique1. Les pauses à double brin peuvent être réparées par l'intermédiaire d'une réparation dirigée par homologie (HDR) ou, plus généralement, par l'assemblage de fin non homologue (NHEJ), un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne une insertion et/ou des suppressions (INDELS) qui perturbent fréquemment la fonction génique. 1. L'efficacité et la simplicité de CRISPR permettent un niveau de ciblage génomique jusque-là inaccessible qui dépasse de loin les technologies précédentes d'édition du génome [c.-à-d. les nucléases de doigts de zinc (ZNF) ou les nucléases effectrices de type activateur de transcription ( TALENS), qui souffrent tous deux d'une complexité de conception accrue, d'une efficacité de transfection plus faible et de limitations dans l'édition de gènes multiplex2].

L'application de recherche fondamentale de l'édition du génome à base d'ARN à guide unique CRISPR a permis aux scientifiques d'interroger efficacement et à peu de frais les fonctions des gènes individuels et la topologie des réseaux d'interaction génétique. La capacité d'effectuer des écrans fonctionnels à l'échelle du génome a été grandement améliorée par l'utilisation du système CRISPR-Cas, en particulier par rapport aux technologies de perturbation génétique antérieures telles que l'interférence de l'ARN (ARNi) et la mutagénèse piège à gènes. En particulier, l'ARNi souffre d'effets hors cible élevés et d'un renversement incomplet, ce qui entraîne une sensibilité et une spécificité plus faibles par rapport à CRISPR3,4,5, tandis que les méthodes de piège à gènes ne sont réalisables que dans les haploïdes cellules pour les écrans de perte de fonction, limitant la portée des modèles cellulaires qui peuvent être interrogés6. La capacité de CRISPR à générer des éliminations génétiques complètes fournit un système plus biologiquement robuste pour interroger les phénotypes mutants, avec un faible bruit, des effets minimes hors cible et une activité constante entre les réactifs5. CrispR-Cas9 sgRNA bibliothèques qui ciblent l'ensemble du génome humain sont maintenant largement disponibles, permettant la génération simultanée de milliers de gènes knock-outs dans une seule expérience3,7,8,9 .

Nous avons mis au point des bibliothèques de lentilles sgRNA à l'échelle du génome CRISPR-Cas9 uniques appelées bibliothèques Toronto Knock-out (TKO) (disponibles par l'entremise d'Addgene) qui sont compactes et optimisées pour faciliter les écrans de génomique fonctionnelle à haute résolution. La dernière bibliothèque, TKOv3, cible 18 000 gènes de codage des protéines humaines avec 71 090 guides optimisés pour l'efficacité de l'édition à l'aide de données empiriques10. En outre, TKOv3 est disponible en tant que bibliothèque à un composant (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) exprimant Cas9 et sgRNAs sur un seul vecteur, allégeant la nécessité de générer des cellules stables exprimant Cas9, permettant à l'échelle du génome knock-out à travers un large éventail de types de cellules de mammifères. TKOv3 est également disponible dans un vecteur sans Cas9 (pLCKO2:TKOv3, Addgene ID 125517) et peut être utilisé dans les cellules qui expriment Cas911.

Une population cellulaire éditée par LE CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome peut être exposée à différentes conditions de croissance, l'abondance de sgARN au fil du temps étant quantifiée par le séquençage de la prochaine génération, fournissant une lecture pour évaluer le décrochage ou l'enrichissement des cellules ayant une génétique traçable perturbations. Les bibliothèques KNOCK-out CRISPR peuvent être exploitées pour identifier les gènes qui, lors d'une perturbation, causent des défauts de forme physique cellulaire, une sensibilité modérée aux médicaments (p. ex., des gènes sensibles ou résistants), régulent l'expression des protéines (p. ex., journaliste) ou sont nécessaires pour un certain fonction de voie et état cellulaire12,13,14. Par exemple, les écrans différentiels de forme physique dans une ligne de cellules cancéreuses peuvent identifier l'épuisement ou la réduction des oncogènes et de l'enrichissement ou une augmentation des gènes de suppresseurs de tumeur3,14,15. De même, l'utilisation de doses intermédiaires de médicaments thérapeutiques peut révéler à la fois la résistance aux médicaments et les gènes de sensibilisation16,17.

Il s'agit ici d'un protocole de dépistage détaillé pour le dépistage de la perte de fonction CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome à l'aide des bibliothèques Knock-out de Toronto (TKOv1 ou v3) dans les cellules des mammifères, de la génération de bibliothèques, du rendement du dépistage à l'analyse des données. Bien que ce protocole ait été optimisé pour le dépistage à l'aide des bibliothèques Knock-out de Toronto, il peut être appliqué et devenir évolutif dans toutes les bibliothèques regroupées CRISPR sgRNA.

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Protocole

Les expériences décrites ci-dessous devraient suivre les lignes directrices du Bureau de la santé et de la sécurité environnementales de l'Institut.

1. Amplification plasmique de plasmide de la bibliothèque lentimique DE CRISPR

  1. Diluer la bibliothèque d'ADN plasmique de CRISPR prête à l'emploi à 50 ng/L en TE (p. ex. TKOv3).
  2. Électropoler la bibliothèque à l'aide de cellules électrocompétentes. Mettre en place un total de quatre réactions d'électroporation comme décrit ci-dessous.
    1. Ajouter 2 'L de 50 ng/L bibliothèque TKO à 25 'L de cellules électrocompétentes décongelées aux cuvettes pré-réfrigérées (1,0 mm) sur la glace.
    2. Électroporate en utilisant des réglages optimaux suggérés par le protocole du fabricant. Dans un rayon de 10 s de l'impulsion, ajouter 975 l de moyen de récupération (ou soC moyen) à la cuvette.
    3. Transférer les cellules électroporated dans un tube de culture et ajouter 1 ml de milieu de récupération. Incuber les tubes dans un incubateur secouant à 250 tr/min pour 1 h à 37 oC.
  3. Installez une plaque de dilution pour titer la bibliothèque et estimez l'efficacité de la transformation.
    1. Mettre en commun les 8 ml de cellules récupérées et bien mélanger. Transférer 10 l des cellules mises en commun à 990 oL de milieu de récupération pour une dilution de 800 fois et bien mélanger.
    2. Plaque de 20 l de la dilution sur une plaque d'agar préréchauffée de 10 cm LB et carbenicilline (100 g/L). Il en résulte une dilution de 40 000 fois des transformateurs qui seront utilisés pour calculer l'efficacité de la transformation.
    3. Plaque de 400 l de cellules récupérées sur chaque plaque sur un total de 20 plaques d'agar de 15 cm de LB pré-chauffées. Incuber les assiettes de 14 à 16 h à 30 oC.
      REMARQUE : La croissance à cette température plus basse minimise la recombinaison entre les répétitions à long terminal (LTR)18.
    4. Pour calculer l'efficacité de la transformation, comptez le nombre de colonies sur la plaque de dilution de 40 000 fois (étape 1.3.2). Multipliez le nombre de colonies comptées par 40 000 pour obtenir le nombre total de colonies sur toutes les plaques. Procéder si le nombre total de colonies représente une couverture de bibliothèque équivalente à un minimum de 200x colonies par sgRNA (le plus optimal est 500-1000x).
      1. Par exemple, le nombre minimal de colonies pour la bibliothèque TKOv3 (71 090 sgRNA) est de 1,4 x 107, ce qui équivaut à 200 x colonies par sgRNA. Si la représentation des colonies est insuffisante, augmenter le nombre d'électroporations à l'étape 1.2 en fonction du nombre de colonies sur la plaque de dilution afin d'atteindre la couverture minimale de la bibliothèque.
  4. Récolte des colonies telles que décrites ci-dessous
    1. À chaque plaque de 15 cm, ajouter 7 ml de lb et de carbenicilline (100 g/L) moyen, puis gratter les colonies avec un épandeur de cellules. À l'' abri d'une pipette de 10 ml, transférer les cellules grattées dans un flacon ou une bouteille stérile de 1 L.
    2. Rincer une fois de plus la plaque avec 5 ml de LB et de carbenicilline moyen et transférer la solution à la bouteille.
    3. Répétez l'opération pour toutes les assiettes pour mettre en commun les cellules de 20 assiettes dans une bouteille stérile.
  5. Mélanger les cellules collectées avec une barre d'agitation pendant 1 h à température ambiante (RT) pour briser les amas cellulaires. Transférer les cellules dans des bouteilles de centrifugeuses pré-pesées et une centrifugeuse à 7 000 x g de bactéries à granulés, puis jeter les supports.
  6. Peser la pastille de cellules humides et soustraire le poids de la bouteille de centrifugeuse pour déterminer le poids final de la pastille humide. Purifie l'ADN plasmide à l'aide d'un kit de purification du plasmide à l'échelle maxi ou méga-échelle en fonction de la quantité de granule bactérienne que chaque colonne peut traiter.

2. Production de lentivirus de bibliothèque de SgRNA à grande échelle

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section du protocole sont effectuées dans une installation BSL2MD dans un cabinet de biosécurité de classe II de type A2.

  1. Calculez le nombre de plaques de 15 cm nécessaires à la production de virus en fonction de l'estimation selon laquelle 18 ml de virus sont généralement récoltés à partir d'une plaque de 15 cm.
  2. Préparer les cellules à la transfection en ensemenceant les cellules d'emballage HEK-293T dans des supports de croissance à faible teneur en antibiotiques (DMEM - 10 % FBS - optionnel : 0,1x stylo/strep) à 8 x 106 cellules par plaque de 15 cm dans 20 ml de support. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Assurez-vous que les cellules plaquées sont des confluents de 70 % à 80 % et qu'elles sont réparties uniformément au moment de la transfection.
  3. Le lendemain, préparer trois plasmides de transfection comme indiqué dans le tableau 1 pour les plaques de 15 cm. Calculez la quantité de plasmide nécessaire pour une transfection et faites un mélange de plasmides pour le nombre de plaques, plus un à transfecter.
  4. Préparer un réactif de transfection à base de lipides pour chaque transfection tel qu'indiqué dans le tableau 2. Aliquot a réduit le support sérique en tubes individuels de microcentrifuge de 1,5 ml pour le nombre de plaques à transpercer. Ajouter le réactif transfection, mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à RT.
  5. Après 5 min d'incubation, ajouter la quantité d'ADN requise pour une transfection au réactif de transfection pour un rapport de 3:1 de réactif de transfection-à-g de complexe d'ADN. Mélanger délicatement et incuber pendant 30 min à RT.
    REMARQUE : Les transfections ultérieures peuvent être préparées en cinq ensembles ou moins, avec des intervalles de 5 minutes pour optimiser le temps et éviter la surincubation.
  6. Après 30 min d'incubation, transférer soigneusement chaque mélange de transfection dans chaque assiette de cellules d'emballage. Ajouter le mélange entier à l'aide d'une pointe de pipette de 1 ml dans le sens de la chute dans un mouvement circulaire en zigzag sans déranger la monocouche cellulaire. Incuber les cellules à 37 oC pendant 18 h à 5 % CO2.
  7. Préparer les supports de récolte virales : 500 ml de milieu DMEM , 32 ml de bouillon BSA (20 g/100 ml, dissous dans le DMEM, filtre stérilisé avec un filtre de 0,22 m) et 5 ml de stylo/streptocoque 100x.
  8. Après 18 h, retirer les supports (utiliser la manipulation appropriée des déchets de lentivirus comme l'incubation dans 1 % d'hypochlorite de sodium pendant 30 min avant l'élimination). Remplacer délicatement par 18 ml de média de récolte virale à chaque assiette. Incuber les cellules à 37 oC pendant 18 h à 5 % CO2.
  9. Après 24 h, vérifiez les cellules d'emballage pour la morphologie anormale et fusionnée comme indication de la bonne production de virus. Puis, récolter le lentivirus en recueillant tous les supernatants et en le transférant dans un tube conique stérile de centrifugeuse.
  10. Faites tourner le support contenant le virus à 300 x g pendant 5 min et pelletent les cellules d'emballage. Aliquot le supernatant dans un tube stérile de polypropylène sans déranger la boulette.
  11. Conserver le virus à 4 oC pendant de courtes périodes (moins d'une semaine) ou immédiatement à -80 oC pour un stockage à long terme. Aliquot se prépare à utiliser des volumes à usage unique pour le stockage à long terme afin d'éviter le gel/dégel.

3. Caractérisation de la ligne cellulaire pour le dépistage

  1. Sélectionnez la ligne cellulaire désirée.
    1. Mesurer et enregistrer le temps de doublement approximatif des cellules.
    2. Déterminer la densité optimale de placage cellulaire pour la culture des cellules chaque doublement de cellules de 3 à 4 dans un vaisseau de culture tissulaire de choix (p. ex., plaques de culture tissulaire de 15 cm).
  2. Déterminer la concentration de puromycine à utiliser dans la ligne cellulaire souhaitée pour la sélection des bibliothèques TKO contenant le marqueur de résistance à la puromycine comme suit :
    1. Cellules de graines dans une plaque de 12 puits à la densité requise pour atteindre la confluence après 72 h, puis incuber pendant la nuit (37 oC, 5 % CO2).
    2. Le lendemain, passer à un support contenant une plage de dilution des concentrations de puromycine de 0 g/mL à 10 g/mL, par incréments de 0,5 g/mL. Incuber les cellules pendant 48 h.
    3. Après 48 h, mesurez la viabilité cellulaire par comptage cellulaire ou coloration alamarBlue.
    4. Déterminer la plus faible concentration qui tue 100 % des cellules en 48 h. Utilisez cette concentration pour sélectionner pour la bibliothèque CRISPR des populations de cellules transdulées dans les étapes 4.6 et 5.2.6.
      REMARQUE : Pour les lignées cellulaires avec des temps de doublement plus longs, des incubations plus longues avec de la puromycine peuvent être tolérées. Dans ces situations, déterminez la courbe de mise à mort pour le temps d'incubation requis pour les doubles de cellules de l'ilt;3. Réduire au minimum le temps de sélection afin d'éviter le décrochage des gènes essentiels avant le début du dépistage.
  3. Vérifier la sensibilité des cellules au bromure d'hexadimethrine (jusqu'à 8 g/mL) en appliquant une courbe de réponse à la dose selon la même méthode que celle utilisée pour mesurer la sensibilité à la puromycine (étape 3.2). Si l'on observe une toxicité avec 8 g/mL de bromure d'hexadimethrine, ne l'utilisez pas.

4. Titration fonctionnelle de la bibliothèque de lentivirus CRISPR mise en commun pour la détermination de MOI

  1. Décongeler un nouvel aliquot de lentivirus de bibliothèque DEGRNA mis en commun (p. ex., LCV2::TKOv3) et rester sur la glace.
  2. Concevoir une série de volumes de virus à tester entre la plage de 0 à 2 ml (c.-à-d. 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 1 ml et 2 ml).
  3. Récoltez les cellules cibles et les cellules de semences dans des plaques de 15 cm à la densité requise pour atteindre la confluence en 72 h.
  4. Pour que chaque volume de virus soit testé, préparez des plaques en double. Ajouter les cellules, le virus, le bromure d'hexadimethrine (8 g/mL) et les médias à un volume final de 20 ml. Mélanger les assiettes à fond, asseoir le niveau des plaques dans un incubateur et incuber pendant 24 h (37 oC, 5 % CO2).
  5. Après 24 h, retirer le virus contenant des médias et éliminer (utiliser des précautions de biosécurité pour la manipulation des déchets de lentivirus). Optionnellement, lavez doucement la plaque avec du PBS chaud pour éliminer le virus extraterrestre.
  6. Pour chaque condition virale, remplacer par 20 ml de support contenant de la puromycine en utilisant la concentration déterminée à tuer les cellules dans la section 3, à une plaque de répétition. Dans l'autre assiette, ajouter 20 ml de média frais sans puromycine. Incuber pendant 48 h (37 oC, 5 % CO2).
  7. Après 48 h, vérifiez que toutes les cellules non infectées (0 mL d'affection virale) traitées à la puromycine sont mortes. Récoltez toutes les plaques individuellement et dispersez les cellules par pipetage doux répété.
  8. Comptez les cellules de toutes les plaques et calculez le MOI pour chaque volume de virus en comparant les numérations cellulaires avec la sélection de la puromycine aux numérations cellulaires sans puromycine (c.-à-d. la puromycine).
  9. Graphique des résultats pour déterminer le volume du virus qui mène à 30%-40% de survie cellulaire avec la sélection de la puromycine par rapport à sans puromycine. Utilisez ce volume de virus pour atteindre un MOI de 0,3 à 0,4 pendant l'écran dans les mêmes conditions de culture tissulaire.

5. Infection primaire d'écran, sélection, et passaging de cellules

  1. Sélectionnez la couverture de la bibliothèque SgRNA DE CRISPR à maintenir tout au long de l'écran (minimum recommandé de 200 fois).
    1. En fonction de la couverture de la bibliothèque, déterminer le nombre de cellules nécessaires pour maintenir cette couverture par ardendan et le nombre de cellules requises pour l'infection au MOI 0.3 (tableau 3).
    2. Déterminer le nombre de plaques nécessaires à la mise en place de l'infection (tableau 4).
  2. Infecter les cellules avec la bibliothèque CRISPR
    1. Récoltez les cellules et ensemencez le numéro de cellule requis à chaque plaque de 15 cm.
    2. Ajouter le bromure d'hexadimethrine (8 g/mL) dans toutes les assiettes.
    3. Ajoutez le virus au volume requis pour MOI 0.3 au criblage et aux plaques de contrôle 2. Pour le contrôle 1, n'ajoutez pas de virus et remplacez ce volume par des supports.
    4. Mélanger les assiettes à fond en inclinant. Placez les assiettes dans un incubateur, en vous assurant qu'elles sont de niveau.
      REMARQUE : Les infections par lots peuvent être causées en combinant un mélange maître de virus, de médias et de bromure d'hexadimethrine aux cellules en suspension avant le placage.
    5. Retirez les médias et remplacez-les par des supports frais contenant de la puromycine à la concentration déterminée à l'étape 3.2.4 au criblage et contrôlez 1 plaques 24 h après l'infection virale. Ajouter le support frais sans puromycine à la plaque de commande 2. Incuber les cellules pendant 48 h (37 oC, 5 % CO2).
    6. 48 h après l'addition de puromycine, s'assurer que toutes les cellules non infectées sont mortes (contrôle 1) pour confirmer l'activité de puromycine, puis moissonner les cellules infectées.
  3. Récolte de la population cellulaire infectée et de la passaging cellulaire
    1. Récoltez les cellules sélectionnées par la puromycine de toutes les plaques de criblage dans un récipient stérile. Recueillir les cellules de chaque plaque de contrôle séparément. Disperser les cellules par un tuyauterie à répétition douce.
    2. Compter les cellules à partir des cellules de criblage regroupées, contrôler 1, et contrôler 2 séparément et calculer le nombre de cellules par 1 ml.
    3. Calculer la couverture MOI et plier réalisée comme suit :
      Équation : MOI = nombre total de cellules par criblage ÷ nombre total de cellules dans la plaque de contrôle ; calcul expérimental.
      Formule de couverture du pli : (cellules infectées × MOI final) ÷ taille de la banque d’ARNsg ; calcul scientifique.
    4. Recueillir trois répliques de granulés cellulaires à partir des cellules mises en commun à la couverture de la bibliothèque sélectionnée pour l'extraction de l'ADN génomique. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min. Laver avec du PBS. Étiqueter les tubes et lyophiliser les granulés cellulaires à -80 oC (ce sont des échantillons de référence T0).
    5. Divisez le pool de cellules infectées en trois groupes de repli (p. ex., répliquer A, reproduire B, reproduire C), tout en maintenant la couverture de la bibliothèque dans chaque réplique. Les cellules de semence à la même densité d'ensemencement que ce qui serait normalement utilisé lors de leur expansion. Utilisez le même nombre de cellules pour chaque plaque répliquée use et le même nombre total de cellules entre les répliques.
    6. Continuer à passer les cellules et récolter trois répliques de granulés cellulaires de chaque réplique de cellules infectées mises en commun comme ci-dessus, tous les 3 à 8 jours selon la lignée cellulaire, pour un nombre allant jusqu'à 15 à 20 doubles cellulaires. À chaque passage, récoltez les cellules de toutes les plaques de chaque groupe de repli (c.-à-d. que toutes les cellules des plaques De repli A sont remélangées, toutes les cellules des plaques De repli B sont remélangées, etc.).
    7. Étiquetez chaque granule avec un temps (T) et reproduisez la désignation. Cela correspond au nombre de jours après T0 que la pastille est collectée (par exemple, T3-A, T3-B, T3-C, etc.).
  4. Pour les tests de sélection négative, permettre aux cellules de récupérer pendant au moins un passage après T0 avant le traitement. À T3 ou T6, divisez les cellules de chaque groupe répliqué (A, B, C) en populations de traitement et de contrôle de la drogue, en utilisant la même densité d'ensemencement utilisée à l'étape 5.3.5.
    1. Mettre en commun séparément le nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque pour chaque réplique dans le groupe de traitement de la drogue. Ajouter le médicament à des concentrations intermédiaires (IC20-IC50). Ensemencer les cellules et incuber (37 oC, 5 % CO2) jusqu'au prochain passage.
    2. Mettre en commun séparément le nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque pour chaque réplique dans le groupe témoin du véhicule. Ajoutez le contrôle du véhicule en utilisant le même volume que le médicament (0,5 % v/v). Ensemencer les cellules et incuber (37 oC, 5 % CO2) jusqu'au passage suivant.
    3. Continuer à passer les cellules et récolter les granulés cellulaires pour l'ADN génomique tous les 3 jours comme décrit à l'étape 5.3.5, tout en rafraîchissant le médicament ou le véhicule à chaque passage.
  5. Pour les écrans de sélection positive ou de résistance aux médicaments, divisez chaque groupe de repli en fonction du nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque. Ajoutez des concentrations de médicaments IC90 à chaque réplique. À IC90, une majorité de cellules seront tuées. Permettre aux populations résistantes de croître et de recueillir des granulés cellulaires (1/2 x 107 cellules) pour l'extraction de l'ADN génomique.

6. Préparation et séquençage de l'échantillon CRISPR

  1. Purification de l'ADN génomique
    1. Incuber les granulés de cellules congelés pendant 5 à 10 min à RT pour la décongélation.
    2. Ajouter 1,4 ml de PBS à un tube de centrifugeuse de 50 ml contenant une pastille cellulaire. Vortex pendant 20 s pour resuspendre les cellules et se reposer pendant 1 min. Si nécessaire, pipette 15x avec P1000 pour briser les amas de cellules restants. Si vous transférez les cellules d'un tube de 15 ml ou de 1,5 ml, resuspendles les cellules avec 1 ml de PBS, puis transférez les cellules dans un tube de 50 ml et rincez le tube d'origine avec 400 l de PBS.
    3. Ajouter 5 ml de solution de lyse nucléée aux cellules suspendues. À l'aide d'une pipette de 10 ml, mélanger l'échantillon en faisant monter et descendre 5 fois.
    4. Ajouter 32 oL de RNase A (20 mg/mL; pour obtenir une concentration finale de 100 g/mL) au lysate nucléaire et mélanger l'échantillon en inversant le tube 5x. Incuber le mélange à 37 oC pendant 15 min et laisser refroidir l'échantillon pendant 10 min à RT.
    5. Ajouter 1,67 ml de solution de précipitation protéique au lysate et le vortex vigoureusement pendant 20 s. De petits amas de protéines peuvent être visibles après le mélange.
    6. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 10 min à RT.
    7. À l'aide d'une pipette de 10 ml, transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse de 50 ml contenant 5 ml d'isopropanol. Mélanger délicatement la solution 10x par inversion jusqu'à ce que l'ADN soit observé.
      REMARQUE : L'ADN peut être observé sous forme de brins blancs ressemblant à des fils qui forment une masse visible.
    8. Centrifugeuse à 4500 x g pendant 5 min à RT pour granuler l'ADN.
    9. À l'aide d'une pipette de 10 ml, retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger la pastille d'ADN. Ajouter 5 ml d'éthanol à 70 % à RT à l'ADN. Faites pivoter doucement le tube pour laver la pastille d'ADN et les côtés du tube de centrifugeuse.
    10. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 5 min à RT.
    11. À l'aide d'une pipette de 10 ml, retirer soigneusement l'éthanol à 70 % et éviter de déloger le granule d'ADN. ADN génomique séché à l'air pendant 10 min à RT.
    12. Ajouter 400 L de solution TE au tube et laisser l'ADN se dissoudre en couve à 65 oC pendant 1 h. Mélanger l'ADN en faisant glisser doucement le tube toutes les 15 minutes. Si l'ADN ne se dissout pas complètement, incubez le tube à 65 oC pendant 1 h de plus tout en faisant glisser doucement le tube toutes les 15 minutes, et laissez-le à 4 oC pendant la nuit.
    13. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 1 min à RT et transfert de l'ADN génomique dans un tube à faible liaison de 1,5 ml.
    14. Quantifier et mesurer la pureté de l'ADN génomique sur le spectrophotomètre (pour la teneur totale en acide nucléique) et le fluoromètre (pour la teneur en ADN à double brin).
  2. Optionnellement, précipitez l'ADN génomique s'il y a des problèmes avec l'amplification en aval de PCR de l'ARScomme suit.
    1. Transférer l'ADN génomique de 400 L dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
    2. Ajouter 18 oL de 5 M NaCl (concentration finale de 0,2 M) et 900 l d'éthanol à 95 %.
    3. Inverser le tube 10x jusqu'à ce qu'il soit bien mélangé, puis centrifugeà 16 000 x g pendant 10 min à RT.
    4. Retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger la pastille d'ADN. Laver le granule d'ADN avec 500 l d'éthanol à 70 %. Faites pivoter doucement le tube pour laver la pastille d'ADN.
    5. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min à RT.
    6. Retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger les granules d'ADN. ADN génomique séché à l'air pendant 10 min à RT.
    7. Ajouter 300 L de TE pour dissoudre l'ADN tel que décrit dans les étapes 6.1.12.
    8. Quantifier et mesurer la pureté de l'ADN génomique tel que décrit à l'étape 6.1.14.
  3. Préparation de la bibliothèque de séquençage CRISPR
    1. Configurez le PCR 1 tel qu'il est décrit dans le tableau 5 à l'aide d'un total de 100 g d'ADN génomique. Ajouter 3,5 g d'ADN génomique par réaction de 50 L et configurer des réactions identiques de 50 L pour atteindre la couverture souhaitée. Le tableau 6 énumère des exemples de séquences d'apprêt pour l'amplification des bibliothèques de séquençage LCV2::TKOv3. Le tableau 7 énumère des exemples de séquences d'apprêt pour l'amplification des bibliothèques de séquençage pLCKO2::TKOv3.
    2. Amplifiez les réactions PCR 1 dans un thermocycleur à l'aide du programme décrit dans le tableau 8.
    3. Vérifier l'amplification de PCR 1 en exécutant 2 'L du produit PCR sur un gel d'agarose de 1%. PCR 1 produit un produit de 600 pb.
    4. Regroupez toutes les réactions individuelles de 50 L pour chaque échantillon d'ADN génomique et mélangez par vortex.
    5. Configurez une réaction PCR 2 (50 l) pour chaque échantillon tel qu'indiqué dans le tableau 9 à l'aide de 5 L du produit PCR 1 mis en commun comme modèle. Utilisez des combinaisons d'apprêt d'index uniques pour chaque échantillon individuel afin de permettre la mise en commun d'échantillons de bibliothèque de séquençage.
    6. Amplifiez la réaction PCR 2 dans un thermocycleur à l'aide du programme décrit dans le tableau 10.
    7. Nettoyer l'équipement de gel d'agarose pour purifier les produits amplifiés avec 0.1 N HCl pendant 10 min avant de jeter un gel. Préparer un gel d'agarose de 2% contenant de la tache d'ADN pour purifier les produits amplifiés PCR 2.
    8. Exécutez le produit PCR 2 sur le gel agarose de 2% à basse tension (1,0 à 1,5 h d'exécution). PCR 2 produit un produit de 200 pb.
    9. Visualisez les produits PCR sur un transilluminateur de lumière bleue. Accise la bande de 200 pb et purifier l'ADN de la tranche de gel d'agarose à l'aide d'un kit d'extraction de gel. Quantifier et mesurer la pureté de la bibliothèque de séquençage sur le spectrophotomètre et le fluoromètre.
      REMARQUE : La concentration typique d'une bibliothèque de séquençage purifiée par le gel varie de 5 à 10 ng/L et un rendement total de 150 à 300 ng.
  4. Séquençage à haut débit
    1. Séquencez les bibliothèques de séquençage CRISPR sur les séquenceurs de nouvelle génération.
    2. Séquence de référence T0 échantillons à une profondeur de lecture plus élevée de 400 à 500 fois la couverture de la bibliothèque. Séquencer des échantillons de temps expérimentaux pour les écrans de décrochage à une profondeur de lecture minimale de 200 fois. Pour les écrans de sélection positifs forts, un minimum de profondeur de lecture de 50 fois la couverture est suffisant pour l'identification des sgRNAs enrichis.
      REMARQUE : Il est essentiel de séquencer l'échantillon T0 pour déterminer la représentation de la bibliothèque pour un écran particulier et servir de référence pour les changements de pli sgRNA déterminants au fil du temps.

7. Analyse des données

  1. Aligner la séquence à l'aide de programmes tels que Bowtie pour cartographier les lectures de séquence s'alument à la bibliothèque de référence en utilisant les paramètres suivants : -v2 (permettant deux décalages) et -m1 (en rejetant toute lecture qui a cartographié à plus d'une séquence dans la bibliothèque).
  2. Normalisez le nombre de lectures cartographiées de façon unique pour chaque sgRNA pour un échantillon donné à 10 millions de lectures par échantillon comme suit :
    Lectures normalisées par formule d’ARNsg pour l’analyse des données génétiques, illustrant la méthode de calcul.107 Annonces
  3. Calculez le changement de pli log2 de chaque sgRNA pour chaque réplique à chaque point de temps (Tn) par rapport à l'échantillon T0 (Tn/T0). Ajoutez un pseudo nombre de 0,5 lecture à tous les comptes de lecture pour éviter les discontinuités des zéros. Exclure les sgRNAs avec des lectures brutes de l'échantillon T0 du calcul des changements de pliage et de l'analyse en aval.
  4. Analyser les changements de pli avec l'algorithme Bayesian Analysis of Gene Essentiality (BAGEL) 'lt;https://github.com/hart-lab/bagel'gt;, en utilisant les ensembles de formation essentiels et non essentiels définis précédemment19 pour les écrans d'essentialité génique ( Tableau supplémentaire S1) ou DrugZ 'lt;https://github.com/hart-lab/drugZ'gt; pour les écrans de drogue20.
  5. Calculez la précision et le rappel pour l'évaluation des performances de l'écran à l'aide des scores BF. Utilisez l'ensemble essentiel de l'étape 7.4 comme véritable liste positive pour la fonction de précision-rappel-courbe de la bibliothèque Scikit-learn pour Python, ainsi que le sous-ensemble de score BF ci-dessus. Alternativement, effectuez la même chose en utilisant le paquet PRROC en R.
  6. Calculez le changement moyen de pli de tous les guides pour chaque gène. Générer des parcelles de densité pour les gènes essentiels et non essentiels (voir l'étape 7.4) dans un logiciel R ou équivalent. Dans R, si x.ess est un vecteur contenant les valeurs de changement de pli de journal des gènes essentiels et x.nonEss contiennent des gènes non essentiels, tracez en utilisant la commande suivante :
    plot( densité ( x.ess ), xlabMD"mean logFC",col"rouge", lwd-2 )
    lignes ( densité ( x.nonEss ), col'"bleu",lwd '2 )
    REMARQUE: Pour les détails de la version Python et les paquets utilisés, voir scikit-learn v0.19.1: (publié par Pedregosa et al.21).

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Résultats

Aperçu du flux de travail de dépistage CRISPR à l'échelle du génome

La figure 1 illustre un aperçu du flux de travail de dépistage CRISPR mis en commun, en commençant par l'infection des cellules cibles avec le lentivirus de la bibliothèque CRISPR à un faible NIVEAU de VIE afin d'assurer des événements d'intégration unique et une représentation adéquate de la bibliothèque (généralem...

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Discussion

En raison de sa simplicité d'utilisation et de sa grande souplesse, la technologie CRISPR a été largement adoptée comme outil de choix pour l'édition précise du génome. Le dépistage CRISPR mis en commun fournit une méthode pour interroger des milliers de perturbations génétiques dans une seule expérience. Dans les écrans mis en commun, les bibliothèques sgRNA servent de codes-barres moléculaires, car chaque séquence est unique et est cartographiée selon le gène ciblé. En isolant l'ADN génomique de la population cellulair...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ces travaux ont été appuyés par Génome Canada, le Fonds de recherche de l'Ontario et les Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-142375, PJT-148802).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 micron
30° ; Incubateur à
37° ; Incubateur
C 37° ; C, 5 % CO2 incubateur
5 M NaClPromegaV4221
50X tampon TAEBioShopTAE222.4
6 N Solution d’acide chlorhydriqueBioShopHCL666.500
95 % Éthanol
Alamar blueThermoFisher ScientificDAL1025
Transilluminateur à lumière bleueThermoFisher ScientificG6600
Albumine sérique bovine, isolation contre les chocs thermiques, fraction V. Min. 98 %, qualité biotechnologiqueBioshopALB001.250
Dulbecco’s Modification of Eagles MediumLife Technologies11995-065Milieux de culture Cel
Cuvettes d’électroporationBTX45-0134
ÉlectroporateurBTX45-0651
Endura cellules électrocompétentesLucigen90293
Sérum fœtal bovinGIBCO12483-020
HEK293T cellules d’emballageATCCCRL-3216recommander le numéro de passage < 15
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrène)SigmaH9268Polymère cationique pour améliorer l’efficacité de la transduction
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrène)
LB Plaques gélosées avec carbénicilline
Milieu LB avec carbénicilline
Échelle d’ADN de faible poids moléculaireNew England BiolabsN3233S
Spectrophotomètre NanodropThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master MixNew England BiolabsM0544L
Opti-MEMLife Technologies31985-070Milieu sérique réduit
Plasmide maxi kit de purificationQiagen12963
pMD2.G (plasmide d’enveloppe)AddgenePlasmide #12259système lentiviral
psPAX2 (plasmide d’emballage)AddgenePlasmid #12260système lentiviral
PuromycinWisent400-160-UG
QIAkit d’extraction rapide de gelQiagen28704
Qubit dsDNA BR assayThermoFisher ScientificQ32853
Fluorimètre QubitThermoFisher ScientificQ33226
RNAse AInvitrogen12091021
milieu de récupération S.O.CInvitrogen15544034
SYRB Coloration de gel d’ADN sûreThermoFisher ScientificS33102
Bibliothèque Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - Cas9 inclusAddgeneAddgene ID #90203Bibliothèque CRISPR à l’échelle du génome, comprend Cas9, 71 090 sgRNA
Bibliothèque Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - non-cas9AddgeneAddgene ID #125517Bibliothèque CRISPR à l’échelle du génome, non-Cas9, 71 090 sgRNA
Solution Tris-EDTA (TE), pH8.0
Agarose UltraPureThermoFisher Scientific16500500
Wizard Kit de purification d’ADN génomiquePromegaA1120
X-tremeGENE 9 Réactif de transfection d’ADNRoche06 365 809 001Réactif de transfection à base de lipides
Filtre plaques Cà agitation

Références

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