In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

Lina Yu; Wenxiu He; Jie Xie; Rui Guo; Juan Ni; Xia Zhang; Quishi Xu; Caifeng Wang; Qiuling Yue; Fangfang Li; Mengcheng Luo; Bo Sun; Lan Ye; Ke Zheng

doi:10.3791/59830

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Article de méthode

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

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DOI :

10.3791/59830

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17 juillet 2019

Lina Yu^*¹ , Wenxiu He^*¹ , Jie Xie^*¹ , Rui Guo^*¹ , Juan Ni² , Xia Zhang³ , Quishi Xu¹ , Caifeng Wang¹ , Qiuling Yue¹ , Fangfang Li¹ , Mengcheng Luo⁴ , Bo Sun³ , Lan Ye¹ , Ke Zheng¹

¹State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, ²The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, ³School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, ⁴Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.

Résumé

Les interactions protéines-acides nucléiques jouent un rôle important dans les processus biologiques tels que la transcription, la recombinaison et le métabolisme de l'ARN. Les méthodes expérimentales d'étude des interactions protéines-acides nucléiques nécessitent l'utilisation d'étiquettes fluorescentes, d'isotopes radioactifs ou d'autres étiquettes pour détecter et analyser des molécules cibles spécifiques. La biotine, une étiquette d'acide nucléique non radioactif, est couramment utilisée dans les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) mais n'a pas été régulièrement employée pour surveiller l'activité de protéine pendant des processus d'acide nucléique. Ce protocole illustre l'utilité de l'étiquetage de la biotine lors des réactions enzymatiques in vitro, démontrant que cette étiquette fonctionne bien avec une gamme d'analyses biochimiques différentes. Plus précisément, en accord avec les résultats antérieurs utilisant des substrats radio-isotopes ³²étiquetés P, il est confirmé par l'intermédiaire de l'EMSA étiqueté e de biotine que MEIOB (une protéine spécifiquement impliquée dans la recombinaison méiotique) est une protéine liant l'ADN, que MOV10 (un L'hélivraime d'ARN) résout les structures duplex d'ARN labelmées de biotine, et que MEIOB fend l'ADN mono-stranded de biotine-étiqueté. Cette étude démontre que la biotine est capable de substituer ³²P dans divers essais biochimiques liés à l'acide nucléique in vitro.

Introduction

Les interactions protéines-acides nucléiques sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que la réparation de l'ADN, la réplication, la transcription, le traitement de l'ARN et la traduction. Des interactions protéiques avec des séquences d'ADN spécifiques dans la chromatine sont nécessaires pour le contrôle serré de l'expression génique au niveau transcriptionnel¹. La régulation posttranscriptionnelle précise de nombreux ARN codants et non codants nécessite des interactions étendues et compliquées entre toute protéine et l'ARN². Ces couches de mécanisme de régulation de l'expression génique co....