Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

Résumé

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Résumé

L'un des principaux obstacles dans le domaine de la recherche sur la vésicule extracellulaire (VE) aujourd'hui est la capacité d'atteindre des préparations év.s.rpure dans un environnement d'infection virale. La méthode présentée vise à isoler les véhicules électriques loin des virions (c.-à-d. le VIH-1), ce qui permet une efficacité et un rendement plus élevés par rapport aux méthodes conventionnelles d'ultracentrifugation. Notre protocole contient trois étapes : précipitation sev, séparation du gradient de densité et capture des particules. Les essais en aval (c.-à-d. western blot et PCR) peuvent être exécutés directement après la capture des particules. Cette méthode est avantageuse par rapport à d'autres méthodes d'isolement (c.-à-d. ultracentrifugation) car elle permet l'utilisation de volumes de départ minimes. En outre, il est plus convivial que les méthodes alternatives d'isolation EV nécessitant plusieurs étapes d'ultracentrifugation. Cependant, la méthode présentée est limitée dans sa portée d'essais fonctionnels EV car il est difficile d'éluter les véhicules électriques intacts de nos particules. En outre, cette méthode est adaptée à un cadre strictement fondé sur la recherche et ne serait pas commercialement viable.

Introduction

La recherche centrée sur les vésicules extracellulaires (VE), en particulier les exosomes, un type de VE allant de 30 à 120 nm et caractérisée par la présence de trois marqueurs de tétraspaninCD81, CD9 et CD63, a été en grande partie façonnée par le développement de méthodes d'isolement et de purifier les vésicules d'intérêt. La capacité de disséquer les mécanismes multiformes a été entravée en raison de techniques complexes et chronophages qui génèrent des échantillons composés d'une population hétérogène de vésicules générées par différentes voies avec un large éventail de contenus, tailles, et Densités. Bien qu'il s'agisse d'un problème pour presque toutes les rech....

Protocole

1. Filtration et précipitation des vésicules extracellulaires (VEV)

1. Pour préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées (c.-à-d. lignées cellulaires et/ou cellules primaires), la culture d'environ 10 ml de cellules de bois tardif pendant 5 jours à 37 oC et de 5 % de CO₂ dans un milieu de culture approprié (c.-à-d. RPMI ou DMEM avec 10 % de bovins foetaux sérum [FBS]).
   REMARQUE: Tous les réactifs moyens de culture doivent être exempts de véhicules électriques, et peuvent être achetés (voir Tableau des matériaux) ou préparés en interne par pré-ultracentrifugation du sérum à 100 ....

Résultats

Les précipitations PEG augmentent le rendement des véhicules électriques
Notre approche combinée à l'isolement EV est significativement plus efficace en termes de récupération EV par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle, comme en témoigne la réduction de 90% du volume de matériel de départ requis. L'ultracentrifugation, l'étalon-or actuel dans l'isolement des véhicules électriques, nécessite environ 100 ml de supernatant de culture pour produire une préparati.......

Discussion

La méthode décrite permet d'améliorer le rendement des véhicules électriques et la séparation du virus des véhicules électriques en utilisant une approche combinée de l'isolement. Des quantités relativement importantes de matériau de départ (c.-à-d. supernatant cellulaire) peuvent être filtrées avant l'isolement des véhicules électriques par les précipitations, la séparation de la DG et l'enrichissement par nanoparticules, ce qui donne un volume final de 30 l, ce qui permet une utilisation immédiate dans une variété de e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CEM CD4+ Cellules	NIH Programme de réactifs contre le sida	117	CEM
DPBS sans Ca et Mg (1x)	Qualité Biologique	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	Réactif de précipitation PEG
FBS appauvri en exosomes	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Sérum fœtal bovin	Sérum de pointe	PS-FB3
Sérum infecté par le VIH-1 U937 Cellules	NIH Programme de réactifs SIDA	165	U1
Nalgene Seringue Filtre 0.2 µ ; m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Rouge réactif 120
noyau Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Bleu Cibacron F3GA
noyau Optima XE-980 Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Gradient de densité Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Rotor à godet oscillant	Beckman Soc	331362
Tube ultra-transparent, 14 mm x 89 mm	Soc	Beckman 344059