Article de méthode

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

11.7K vues

⸱

DOI :

10.3791/59876

⸱

12 septembre 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Résumé

L'un des principaux obstacles dans le domaine de la recherche sur la vésicule extracellulaire (VE) aujourd'hui est la capacité d'atteindre des préparations év.s.rpure dans un environnement d'infection virale. La méthode présentée vise à isoler les véhicules électriques loin des virions (c.-à-d. le VIH-1), ce qui permet une efficacité et un rendement plus élevés par rapport aux méthodes conventionnelles d'ultracentrifugation. Notre protocole contient trois étapes : précipitation sev, séparation du gradient de densité et capture des particules. Les essais en aval (c.-à-d. western blot et PCR) peuvent être exécutés directement après la capture des particules. Cette méthode est avantageuse par rapport à d'autres méthodes d'isolement (c.-à-d. ultracentrifugation) car elle permet l'utilisation de volumes de départ minimes. En outre, il est plus convivial que les méthodes alternatives d'isolation EV nécessitant plusieurs étapes d'ultracentrifugation. Cependant, la méthode présentée est limitée dans sa portée d'essais fonctionnels EV car il est difficile d'éluter les véhicules électriques intacts de nos particules. En outre, cette méthode est adaptée à un cadre strictement fondé sur la recherche et ne serait pas commercialement viable.

Introduction

La recherche centrée sur les vésicules extracellulaires (VE), en particulier les exosomes, un type de VE allant de 30 à 120 nm et caractérisée par la présence de trois marqueurs de tétraspaninCD81, CD9 et CD63, a été en grande partie façonnée par le développement de méthodes d'isolement et de purifier les vésicules d'intérêt. La capacité de disséquer les mécanismes multiformes a été entravée en raison de techniques complexes et chronophages qui génèrent des échantillons composés d'une population hétérogène de vésicules générées par différentes voies avec un large éventail de contenus, tailles, et Densités. Bien qu'il s'agisse d'un problème pour presque toutes les recherches sur les véhicules électriques, il est particulièrement important lorsqu'il s'agit d'étudier les véhicules électriques dans le contexte de l'infection virale, car les virions et les particules virales (VLP) peuvent avoir un diamètre similaire aux vésicules d'intérêt. Par exemple, le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) mesure environ 100 nm de diamètre, ce qui est à peu près la même taille que de nombreux types de véhicules électriques. Pour cette raison, nous avons conçu un nouveau flux de travail d'isolement EV pour résoudre ces problèmes.

L'étalon-or actuel de l'isolement EV est l'ultracentrifugation. Cette technique utilise les différentes densités vésicules, ce qui permet aux vésicules d'être séparées par centrifugation avec sédimentation différentielle de particules de densité plus élevée par rapport aux particules de densité inférieure à chaque étape 1,2. Plusieurs étapes de centrifugation à basse vitesse sont nécessaires pour enlever les cellules intactes (300-400 x g pendant 10 min), les débris cellulaires (2 000 x g pour 10 min) et les corps apoptotiques/grandes vésicules (10 000 x g pendant 10 min). Ces purifications initiales sont suivies d'une ultracentrifugation à grande vitesse (100 000 à 200 000 x g pour 1,5 à 2 h) vers les véhicules électriques sédimentaires. Des étapes de lavage sont effectuées pour assurer davantage la pureté de EV, cependant, ceci a comme conséquence la réduction du nombre d'EV isolés, abaissant de ce fait le rendement total 3,4. L'utilité de cette méthode est encore limitée par l'exigence d'un grand nombre de cellules (environ 1 x 108) et d'un grand volume d'échantillon (-gt; 100 ml) pour obtenir des résultats adéquats.

Pour répondre aux préoccupations croissantes, la précipitation de vésicules avec des polymères hydrophiles est devenue une technique utile ces dernières années. Le polyéthylène glycol (PEG), ou d'autres réactifs de précipitation séquencés connexes, permet à l'utilisateur de démonter les vésicules, les virus et les agrégats de protéines ou d'ARN protéiques dans un échantillon en couvainant simplement l'échantillon avec le réactif de choix, suivi d'une seule vitesse basse centrifugation1,2,5. Nous avons précédemment signalé que l'utilisation de PEG ou de méthodes connexes pour précipiter les véhicules électriques par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle entraîne un rendement significativement plus élevé6. Cette stratégie est rapide, facile, ne nécessite pas d'équipement supplémentaire coûteux, est facilement évolutive, et conserve la structure EV. Cependant, en raison de la nature promiscuité de cette méthode, les échantillons résultants contiennent une variété de produits comprenant des protéines libres, des complexes de protéine, une gamme de véhicules électriques, et des virions nécessitant ainsi une purification supplémentaire pour obtenir la population désirée1 ,2,7,8.

Pour surmonter l'hétérogénéité des véhicules électriques obtenus à partir de diverses méthodes de précipitation, l'ultracentrifugation du gradient de densité (DG) est utilisée pour mieux séparer les particules en fonction de leur densité. Cette méthode est réalisée à l'aide d'un gradient stepwise à l'aide d'un milieu de gradient de densité, comme l'iodixanol ou le saccharose, qui permet la séparation des véhicules électriques des protéines, des complexes protéiques et des particules virales ou virales (VLP). Il est important de noter que, bien qu'on ait pensé autrefois que la DG permettait une séparation plus précise des sous-populations de veaux, on sait maintenant que les tailles et les densités de diverses vésicules peuvent se chevaucher. Par exemple, on sait que les exosomes ont des densités de flottaison de 1,08-1,22 g/mL9, tandis que les vésicules isolées du Golgi (COPIou clathrine) ont des densités de 1,05-1,12 g/mL et celles du reticu(COPII) ) sédiments à 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. En outre, si l'on désire comparer les fractions exosomal avec les fractions contenant des particules virales, cela peut devenir plus difficile en fonction de la densité du virus d'intérêt , il existe des virus autres que le VIH-1 qui sont probablement en équilibre densités comme fractions positives exosomales2.

Enfin, l'enrichissement des préparations EV pour la visualisation en aval et les essais fonctionnels est essentiel à la recherche sur les véhicules électriques. L'utilisation de nanoparticules enrichies de véhicules électriques, en particulier de particules hydrogel multifonctionnelles de 700 à 800 nm de diamètre, constituent une étape cruciale dans la réalisation de préparations concentrées pour les véhicules électriques. Ils possèdent un appât aromatique à haute affinité qui est encapsulé par une coquille de tamisage externe poreuse pour favoriser la sélectivité. Les nanoparticules utilisées dans cette étude comprennent deux préparations distinctes avec des appâts de base différents (Réactive Red 120 NT80; et Cibacron Blue F3GA NT82) qui ont montré qu'elles augmentaient la capture des véhicules électriques à partir de divers réactifs et biofluides (voir le Tableau des matériaux )6,10,11,12,13,14,15. Les particules offrent l'enrichissement facile des véhicules électriques à partir de nombreux matériaux de départ, y compris les fractions d'iodixanol, supernatant de culture cellulaire, ainsi que les biofluides patients tels que le plasma, le sérum, les fluides rachidiens (CSF), et l'urine6,13 .

La méthode présentée ici améliore l'efficacité des techniques actuelles de purification des véhicules électriques en combinant plusieurs technologies; Précipitation synveux, ultracentrifugation du gradient de densité et captage des particules, afin de rationaliser le flux de travail, de réduire les besoins en échantillons et d'augmenter le rendement afin d'obtenir un échantillon de VE plus homogène pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques. Cette méthode est particulièrement utile dans l'étude des véhicules électriques et de leur contenu pendant l'infection virale, car elle comprend une étape de filtration de 0,22 m pour exclure les vésicules et les VLP de grande taille et indésirables et la séparation de la population totale de véhicules électriques en fonction de la densité afin d'en faire efficacement isoler les véhicules électriques des virions.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Filtration et précipitation des vésicules extracellulaires (VEV)

  1. Pour préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées (c.-à-d. lignées cellulaires et/ou cellules primaires), la culture d'environ 10 ml de cellules de bois tardif pendant 5 jours à 37 oC et de 5 % de CO2 dans un milieu de culture approprié (c.-à-d. RPMI ou DMEM avec 10 % de bovins foetaux sérum [FBS]).
    REMARQUE: Tous les réactifs moyens de culture doivent être exempts de véhicules électriques, et peuvent être achetés (voir Tableau des matériaux) ou préparés en interne par pré-ultracentrifugation du sérum à 100 000 x g pendant 90 min. Ce protocole a été un succès pour plusieurs lignées cellulaires couramment utilisées, notamment : CEM, Jurkat, 293T, U937 (lignes non infectées), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (lignées infectées par le VIH-1 et le HTLV-1), plusieurs cellules transfectées et des cellules myéloïdes et T primaires (les deux infectés et non infectés); cependant, ce protocole peut être utilisé pour n'importe quel type de cellule, y compris ceux qui nécessitent des conditions de médias ou de culture spécialisées. La densité des cellules peut devoir être optimisée pour différents types de cellules. Il est recommandé que la densité la plus élevée soit utilisée avec la mort cellulaire minimale après 5 jours.
  2. Centrifuger la culture à 3 000 x g pendant 5 min pour les cellules à granulés et jeter la pastille.
  3. Filtrer le supernatant de culture à l'aide d'un filtre stérile de 0,22 m et collecter le filtrate dans un tube propre.
  4. Ajouter un volume égal de réactif de précipitation PEG (1:1 ratio) au supernatant filtré. Inverser le tube plusieurs fois pour assurer un mélange homogène.
    REMARQUE: Ne PAS vortex.
  5. Incuber le mélange à 4 oC pendant la nuit (O/N).
  6. Mélange centrifugeàeur à 1 500 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) pour produire une pastille EV hétérogène.
    REMARQUE: Les granulés EV doivent apparaître de couleur blanche ou blanc cassé.
  7. Jetez le supernatant de culture appauvri par les véhicules électriques.
  8. Resuspendre la pastille EV en 150 à 300 oL de 1x saline tamponnée de phosphate sans calcium et magnésium (PBS) et garder sur la glace.

2. Construction d'un gradient de densité

  1. Mélanger le milieu de gradient de densité d'iodixanol avec 1x PBS pour créer 11 fractions de densité différentes de 1 ml de 6 à 18% d'iodixanol dans des incréments de 1,2% dans des tubes de microcentrifuge distincts comme le montre la figure 1A.
  2. Vortex chaque tube à mélanger.
  3. Fractions de densité de couche dans un tube ultracentrifuge pré-nettoyé et sec oscillant commençant par la fraction #18 et se terminant par la fraction #6 comme indiqué dans la figure 1B.
    REMARQUE: Tous les tubes doivent être désinfectés à l'aide d'un spray à l'eau de Javel de 10 %, suivi d'un rinçage 3x à l'eau déionisée et d'un lavage final de l'eau déionisée stérile avant le chargement des fractions de gradient.
  4. Ajouter le granule EV suspendu (300 l) au sommet du gradient en couches dans le tube d'ultracentrifuge.
  5. Ultracentrifuge à 100,00 x g à 4 oC pendant 90 min.
  6. Retirez soigneusement les fractions de 1 ml du tube d'ultracentrifuge et transférez chaque fraction dans de nouveaux tubes de microcentrifuge.

3. Enrichissement des fractions EV utilisant des nanoparticules

  1. Créez une boue de 30 % de nanoparticules en utilisant des volumes égaux de NT80, NT82 et 1x PBS.
    REMARQUE: Le mélange doit être vortexé avant d'être utilisé pour assurer l'homogénéité.
  2. Ajouter 30 let l'une de la boue à chaque tube de microcentrifuge contenant les fractions de densité et les pipette/inverser plusieurs fois pour les mélanger.
  3. Rotation des tubes de microcentrifugeur de densité contenant des nanoparticules enrichie par les véhicules électriques O/N à 4 oC à environ 20 tr/min.
  4. Tubes de microcentrifugeà fraction de densité de centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à RT.
  5. Jeter le liquide et laver le granule EV deux fois avec 1x PBS.
    REMARQUE: Les granulés de nanoparticules peuvent être congelés à -20 oC ou immédiatement utilisés pour diverses analyses en aval (c.-à-d. PCR, tache occidentale, spectrométrie de masse et autres essais).

4. Préparation recommandée de pellet de nanoparticules pour les essais en aval

  1. Pour l'isolement de l'ARN
    1. Resuspendre la pastille dans 50 lddad d'eau déionisée autoclaved traitée avec 0,001% de pyrocarbonate de diethyle (DEPC) filtré à travers un filtre de 0,2 m et isoler l'ARN selon le protocole du fabricant du kit.
  2. Pour l'électrophoresis de gel
    1. Resuspendre la pastille directement dans 15 'L de tampon Laemmli.
    2. Échantillon de chaleur 3x à 95 oC pendant 3 min. Vortex doucement et spin vers le bas entre chaque cycle de chaleur.
    3. Échantillon de centrifugeuse pour 15 s à 20 000 x g et chargez tout le matériel élucidé directement sur le gel.
      REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, limitez la quantité de particules chargées sur le gel et faites fonctionner le gel à 100 V pour vous assurer que les particules restantes sont contenues dans les puits.
  3. Pour la digestion de trypsine
    1. Resuspendre la pastille dans 20 l'urée avant l'alkylation et la trypsinisation de l'échantillon. Les nanoparticules peuvent être granulées par une centrifugation de 14 000 x g à RT pendant 10 min. L'échantillon contenant le peptide trypsinisé peut être transféré dans un tube de collecte propre.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les précipitations PEG augmentent le rendement des véhicules électriques
Notre approche combinée à l'isolement EV est significativement plus efficace en termes de récupération EV par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle, comme en témoigne la réduction de 90% du volume de matériel de départ requis. L'ultracentrifugation, l'étalon-or actuel dans l'isolement des véhicules électriques, nécessite environ 100 ml de supernatant de culture pour produire une préparati...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La méthode décrite permet d'améliorer le rendement des véhicules électriques et la séparation du virus des véhicules électriques en utilisant une approche combinée de l'isolement. Des quantités relativement importantes de matériau de départ (c.-à-d. supernatant cellulaire) peuvent être filtrées avant l'isolement des véhicules électriques par les précipitations, la séparation de la DG et l'enrichissement par nanoparticules, ce qui donne un volume final de 30 l, ce qui permet une utilisation immédiate dans une variété de e...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

B.L. est affilié à Ceres Nanosciences inc. qui produit des réactifs et/ou des instruments utilisés dans cet article. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts potentiel.

Remerciements

Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Kashanchi, en particulier Gwen Cox. Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, et NS099029 à F.K.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CEM CD4+ CellulesNIH Programme de réactifs contre le sida117CEM
DPBS sans Ca et Mg (1x)Qualité Biologique114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1Réactif de précipitation PEG
FBS appauvri en exosomesThermo Fisher ScientificA2720801
Sérum fœtal bovinSérum de pointePS-FB3
Sérum infecté par le VIH-1 U937 CellulesNIH Programme de réactifs SIDA165U1
Nalgene Seringue Filtre 0.2 µ ; m SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Rouge réactif 120
noyau Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Bleu Cibacron F3GA
noyau Optima XE-980 UltracentrifugeuseBeckman CoulterA94471
OptiPrep Gradient de densité MediumSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti Rotor à godet oscillantBeckman Soc331362
Tube ultra-transparent, 14 mm x 89 mmSocBeckman 344059

Références

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Purification des v sicules extracellulairess paration viralepr cipitation au PEGs paration par gradient de densitenrichissement en nanoparticulesprotocole d ultracentrifugationanalyse par Western blotd tection par PCRam lioration du rendement en VEcontamination par le VIH 1

Articles connexes