Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Les modèles animaux expérimentaux sont indispensables dans la recherche immunisée fondamentale. L'administration de bactéries entières ou de composants microbiens a été fréquemment utilisée dans les petits modèles animaux pour induire une inflammation locale ou systémique¹. Le lipopolysaccharide (LPS, ou endotoxine bactérienne) est un composant de la paroi cellulaire et l'antigène de surface des bactéries gramnégatives (p. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., ou Legionella spp.). La molécule thermostable et grande (poids moléculaire 1-4 x 10⁶ kDa) se compose d'une moiety lipidique (Lipid A), région centrale (oligosaccharide), et un polysaccharide O (ou O antigène). Lipid A, avec ses chaînes d'acides gras hydrophobes, ancre la molécule dans une membrane bactérienne et médiatise (sur la dégradation des bactéries) l'activité immunologique et la toxicité du LPS. Après s'être lié à la protéine de liaison LPS (LBP), les complexes LPS:LBP ligate le complexe de récepteurs CD14/TLR4/MD2 situé à la surface de nombreux types de cellules, induisant une forte réaction proinflammatoire avec la translocation nucléaire NF-B et la régulation subséquente de cytokine expression².

Les lésions pulmonaires aigues (ALI) sont définies comme une insuffisance respiratoire hypoxémique aigue avec un œdème pulmonaire bilatéral en l'absence d'insuffisance cardiaque³. L'administration des voies respiratoires de LPS est un moyen commun d'induire une inflammation pulmonaire et ALI^4,5,6,7. Bien que la substance stérile ne soit pas appropriée pour étudier les interventions pharmacologiques dans les maladies infectieuses, les questions immunologiques mécanistes peuvent être répondues avec une précision suffisante. L'instillation du LPS dans la trachée induit une réaction inflammatoire robuste avec l'invasion de leucocyte, la régulation version des cytokines proinflammatoires, et la perturbation de la barrière alvéolo-capillaire en quelques heures à jours, selon le dosage^deLPS^{3, 6,7}.

Le protocole présenté décrit une procédure étape par étape détaillée pour induire ALI chez les souris par instillation intratrachéale de LPS. Le modèle a été validé en évaluant l'expression de cytokine, l'invasion de granulocyte de neutrophil, et la fuite intra-alvéolaire d'albumine comme précédemment décrit^8.

Ce protocole animal a été approuvé par le comité local pour les soins aux animaux (LANUV, Recklinghausen, Allemagne; protocole no 84-02.04.2015) et a été exécuté conformément aux directives des National Institutes of Health pour l'utilisation des animaux vivants (publication des NIH No 85-23, révisé en 1996).

1. Induction ALI

1. Utilisez des souris adultes C57BL/6 à l'âge d'environ 10-12 semaines. Loger les animaux dans des cages ventilées individuellement avec un accès gratuit à l'eau et à la chow standard des rongeurs. Cependant, il est possible d'effectuer cette approche sur les animaux plus jeunes et avec d'autres souches de souris.
2. Stocker le LPS (Escherichia coli O111:B4) dans des aliquots en concentrations de 5 mg/mL à -20 oC. Pour l'instillation intratrachéale, diluer le LPS dans la saline stérile tamponnée par le phosphate (PBS) jusqu'à une concentration finale de 2 000 g/mL.
3. Pesez la souris. Injecter de la kétamine [120 mg/kg de poids corporel de souris (BW)] et de la xylazine (16 mg/kg BW) par voie intrapéritoyonne (un tiers inférieur de l'abdomen, paramédian), et attendre le sursis de l'anesthésie.
4. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie en induisant un stimulus tactile. En cas d'anesthésie insuffisante, répéter l'injection de kétamine (30 mg/kg BW) et de xylazine (4 mg/kg BW).
5. Placez la souris en position couchée sur une table à température contrôlée afin de maintenir une température corporelle de 37 oC.
6. Appliquer un lubrifiant ophtalmique stérile pour prévenir la dessiccation des cornées sous anesthésie.
7. Soulevez les inciseurs de tête et de crochet sur une barre horizontale placée à environ 5 cm au-dessus de la table pendant que les pattes avant restent en contact étroit avec la table. Étendre le cou dans un angle de 90 degrés par rapport à la table (Figure 1). Tenez la langue avec des forceps pour redresser la gorge pour des conditions d'intubation plus faciles.
8. Couper un cathéter veineux de 22 jauges (G) sur une longueur de 20 mm. Insérez délicatement le cathéter dans la direction verticale le long de la racine de la langue. Placez une source de lumière froide sur la peau au-dessus du larynx pour aider à visualiser les cordes vocales et viser la trachée. Si la résistance du larynx se produit, rétractez le cathéter quelques millimètres avant d'avancer à nouveau.
9. Insérer le cathéter d'environ 10 mm dans la trachée. Assurez-vous que l'insertion n'est pas trop profonde car cela entraînera l'instillation unilatérale du liquide dans la bronche principale droite ou gauche.
10. Injecter du LPS (5 g/g BW) dilué dans le PBS à l'aide d'une pipette [le volume injecté dépend du poids corporel de la souris (p. ex., 20 g de poids corporel et utilisation de 50 l de solution LPS)].
    REMARQUE : La souris réagit généralement en toussant ou en haletant à l'instillation appropriée du liquide dans la trachée.
11. Connectez une seringue et ajoutez un bolus de 50 ml d'air pour vous assurer que le volume liquide complet est distribué dans les poumons. Retirez lentement le cathéter.
12. Gardez le haut du corps de la souris en position verticale pendant 30 s afin d'éviter les fuites du liquide de la trachée.
13. Chez les animaux opérés par une feinte, injectez 50 l de PBS stérile par voie intratrache au lieu de LPS.
14. Injecter de l'hydrochlorure de buprénorphine 0,08 mg/kg BW sous-cutané dans la peau lâche sur le cou immédiatement après l'induction ALI et tous les 12 h par la suite, au cours des 48 premières heures.
15. Maintenir une température corporelle de 37 oC jusqu'à ce que la pleine conscience soit retrouvée en gardant la souris sur la plaque chauffante.
16. Transférer la souris dans une cage aérée individuellement avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Surveillez la souris régulièrement. La diminution de la température corporelle et la dépression respiratoire indiquent une bonne induction de l'ALI.

2. Échantillonnage sanguin, lavage bronchoalveolaire, récolte d'organes

REMARQUE : Le moment de l'euthanasie dépend de la question scientifique abordée. Habituellement, il est effectué 12-72 h suite à l'instillation LPS^3,4,9,10. La gravité de l'ALI peut être déterminée cliniquement par l'observation régulière de la température corporelle et des symptômes de détresse respiratoire¹¹.

1. Induire l'anesthésie en plaçant la souris dans une chambre inondée d'isoflurane. Utilisez 3 vol% isoflurane avec un flux d'oxygène de 1 L/min. Assurer la narcose profonde en induisant un stimulus tactile. En cas de profondeur insuffisante de l'anesthésie, augmenter isoflurane jusqu'à 5 vol%.
2. Sacrifiez la souris dans l'anesthésie profonde par la dislocation atlanto-occipital.
3. Fixez la souris avec du ruban adhésif sur une table d'opération et désinfectez rapidement la fourrure sur l'abdomen avec 70 % d'éthanol. Ouvrez soigneusement la cavité abdominale dans la ligne médiane avec des ciseaux et des pinces. Enlever les parties de l'intestin pour obtenir l'accès à la veine cava inférieure (IVC) à droite de la colonne vertébrale et de l'aorte abdominale.
4. Localisez les veines rénales et insérez un canule plié de 23 G relié à une seringue de 1 ml dans l'IVC directement sous la confluence des veines. Aspirez 250 l de sang et transférez-vous dans un tube de 1,5 ml rempli de 20 l de 0,5 M d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA). Agiter doucement pour faciliter le mélange EDTA et mettre le tube sur la glace.
5. Pour le lavage bronchoalvéolar (BAL), préparer trois seringues de 1 ml avec 0,5 ml de PBS stérile et 0,1 ml d'air chacune. Rapidement désinfecter la fourrure de la gorge avec 70% d'éthanol et exposer soigneusement la trachée avec des ciseaux et des pincettes. Mobilisez la trachée et enroulez autour d'une suture.
6. Effectuer BAL: Perforer la trachée à l'aide de micro-ciseaux et insérer un cathéter veineux de 22 G coupé à une longueur de 20 mm. Fixer le cathéter avec la suture et instiller 0,5 mL de PBS stérile et 0,1 ml d'air. Aspirer le liquide après 60 s. Répétez la procédure avec les deux seringues supplémentaires et collectez l'aspiration entière dans un tube de 15 ml sur la glace.
7. Ouvrez délicatement le thorax avec des ciseaux et des pincettes pour récolter les poumons. Couper le diaphragme le long de la marge costale et couper à travers les côtes avec deux incisions latérales. Évitez soigneusement de perforer les poumons. Soulevez le sternum cranially et fixez-le ou retirez-le.
8. Préparer deux seringues de 10 ml avec un PBS chaud de 37 oC (sans calcium ni magnésium). Faire une petite incision dans le ventricule gauche. Perforez le ventricule droit avec un canule de 26 G et rincer la circulation pulmonaire avec le PBS préchauffé. Soyez conscient des poumons qui pâlissent pendant la procédure.
9. Enlever le lobe droit des poumons et le couper en deux moitiés. Les congeler dans de l'azote liquide, suivi d'un stockage à long terme à -80 oC pour une nouvelle expression génique et une analyse des protéines.
10. Retirer tout le poumon gauche et l'homogénéiser dans une plaque de 48 puits en haletant le tissu avec des ciseaux et une pince à épiler. Incuber le tissu dans 2 ml de tampon de digestion [RPMI 1640 avec 10% sérum fœtal de veau (FCS) et 0,1% NaN₃, collagène I (1 mg/mL), et DNase II (7 mg/mL)] à 37 oC pendant 60 min. Effectuer une homogénéisation plus poussée en pipetiligent soigneusement les morceaux de tissu pulmonaire et duvet.

3. Préparation des tissus pour l'analyse FACS

1. Préparer un tamponFACS frais (tableau 1) : utilisez toujours du PBS sans calcium et sans magnésium pour réduire l'adhérence cellulaire à cellule dépendante de la cation et prévenir l'agglutination. Supplément avec FCS (1%) protéger les cellules de l'apoptose, prévenir les taches non spécifiques et empêcher les cellules de coller aux tubes FACS. Inclure l'EDTA (0,5 mM) pour prévenir l'adhérence cellulaire à cellule basée sur la cation lorsque vous travaillez avec des cellules collantes et adhérentes comme les macrophages. Ajouter l'azide de sodium (0,1 %), car il empêche la contamination bactérienne et le photoblanchiment des fluorochromes et bloque l'excrétion d'anticorps.
2. Transférer les échantillons de sang (étape 2.4) dans 5 mL de tubes FACS et mélanger délicatement le sang avec 2 ml de tampon de lyse des globules rouges. Mettre les tubes sur la glace et terminer la réaction après 2 min en ajoutant 2 ml de PBS glacé. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 400 x g et jeter le supernatant. Resuspendre le granule cellulaire avec 60 L de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits¹².
   REMARQUE : Le moment de l'euthanatation de la souris influence le nombre de leucocytes dans le cadre de l'inflammation systémique. Par conséquent, il est recommandé d'ajuster le nombre de cellules à 1 x 10⁶ cellules/60 L dans cette étape pour obtenir les meilleurs résultats de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux.
3. Centrifugeur BAL fluide (étape 2.6) pendant 5 min à 400 x g. Aspirez le supernatant et congelez-le dans de l'azote liquide, suivi d'un stockage à long terme à -80 oC pour une analyse plus poussée des protéines. Resuspendre le granule de cellules BAL avec 2 ml de tampon FACS froid, puis transférer la suspension dans un tube FACS de 5 mL à l'aide d'un filtre à mailles de 100 m pour retenir les poils.
4. Encore une fois, centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 400 x g. Resuspendre le granule avec 60 L de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits¹².
   REMARQUE : Le moment de l'euthanatation de la souris influence le nombre de leucocytes dans BAL dans le cadre de l'inflammation. Par conséquent, il est recommandé d'ajuster le nombre de cellules à 1 x 10⁶ cellules/60 L dans cette étape pour obtenir les meilleurs résultats de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux.
5. Transférer le tissu pulmonaire gauche digéré (étape 2.10) dans un tube FACS de 5 mL à l'aide d'un filtre à mailles de 100 l pour extraire les amas et mettre fin au processus de digestion en ajoutant 2 ml de tampon FACS glacé. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 400 x g. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille avec 60 L de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits¹².
   REMARQUE : Le moment de l'euthanatation de la souris influence le nombre de leucocytes dans le tissu pulmonaire dans le cadre de l'inflammation. Par conséquent, il est recommandé d'ajuster le nombre de cellules à 1 x 10⁶ cellules/60 L pour obtenir les meilleurs résultats de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux.
6. Pour l'analyse FACS, incuber les cellules avec l'anticorps CD16/CD32 à 4 oC pendant 15 min pour bloquer la liaison non spécifique de l'immunoglobuline aux récepteurs Fc. Ajouter 20 l de solution de blocage à 1 x 10⁶ cellules dans 60 l dans un tube de 5 ml.
7. Pendant ce temps, préparez un mélange maître avec le tampon FACS et les anticorps tels que décrits dans le tableau 2.
8. Après le blocage, ne pas laver les cellules. Ajouter 20 l de mélange maître d'anticorps par échantillon pour obtenir un volume final de 100 l. Incuber les échantillons pendant 20 min dans l'obscurité à 4 oC.
9. Laver chaque échantillon avec 1 ml de tampon FACS et centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g. Jetez le supernatant et suspendez la pastille avec le tampon FACS à la concentration cellulaire appropriée pour les mesures FACS.
   REMARQUE : Un nombre de cellules de 1 x 10⁶ cellules/500 L est suggéré pour réaliser les meilleurs résultats de phénotypage immunisé dans l'analyse de FACS avec ce protocole. Cependant, il est recommandé que les anticorps doivent être titrés individuellement.
10. Au besoin, ajouter la coloration vivante/morte avant la coloration de surface à l'aide de kits spécifiques disponibles dans le commerce⁸.
11. Enfin, ajoutez des nombres fixes de perles d'étalonnage couplées fluorochrome disponibles dans le commerce (3 x 10⁵ perles dans 20 l de tampon FACS) à chaque échantillon pour déterminer les nombres cellulaires absolus¹². La stratégie de gating pour le sang, le BAL et les cellules tissulaires est montrée dans la figure 2.

L'approche décrite pour induire ali chez les souris a été validée en évaluant l'expression de cytokine, l'infiltration de granulocyte de neutrophil, et la perturbation alveolo-capillaire de barrière 24 h et 72 h après instillation de LPS. Les animaux injectés par LE PBS ont servi de contrôle. L'administration intratracheal de LPS a induit une réponse proinflammatory pulmonaire robuste. L'expression du TNF-MD dans les tissus pulmonaires a été significativement régulée, atteignant une augmentation soutenue et plus de 50 fois par rapport aux animaux témoins [RQ (TNF-18s); 24 h: 53,7 (SD 11,6); 72 h: 55,0 (SD - 20,6); p lt; 0,05)] (Figure 3A). L'invasion de leucocytes dans les tissus et l'espace alvéolaire est une caractéristique et une caractéristique pour le développement de l'ALI13. L'analyse de FACS a indiqué une infiltration significative des granulocytes de neutrophile (NG) dans l'interstitium de poumon, avec le nombre absolu de cellules ayant augmenté presque 9 fois comparé aux contrôles après 24 h [65.243 (SD - 15.855) contre 7.358 (SD ' 4.794), p 'lt ; 0.05] ( Figure 3B). Le nombre absolu de NG a légèrement diminué après 72 h ; toutefois, les augmentations de facteurs par rapport aux témoins sont demeurées stables [48 946 (SD 5 223) contre 5 510 (SD 654), p 'lt; 0.05]. Conformément à l'infiltration interstitielle de NG, l'expression de MMP-9 dans le tissu entier de poumon a également été sensiblement augmentée au cours de la période d'observation totale [RQ (MMP-9/18s), 24 h : 7.4 (SD - 1.5); 72 h : 10.4 (SD - 2.0); p lt ; 0.05] (figure 3C).

Ng ont été non seulement augmentés dans le tissu pulmonaire mais également dans le fluide de BAL. L'augmentation du pli par rapport aux animaux témoins a été plus prononcée que dans les tissus pulmonaires, avec des comptes de NG absolus de 24 h après l'induction de l'ALI de 52 005 (SD à 21 906) contre 1 829 (SD à 1 724) (p lt; 0,05) (figure3D). Après 72 h, le NG a été porté à 37 254 (SD 4 478) contre 17,0 (SD à 10,8) (p et lt; 0,05). L'oème pulmonaire dû à l'affaiblissement grave de la barrière alveolo-capillaire est pathognomonique pour le développement de l'ALI, avec LPS induisant rapidement l'apoptosis endothélial et la perméabilité accrue14,15. L'analyse du contenu d'albumine dans le fluide BAL par ELISA a indiqué une perte significative de fonction de barrière. 24 h après l'instillation de LPS, l'albumine dans le fluide BAL était de 43 ng/mL (SD no 13), comparativement à 20 ng/mL (SD no 9) dans des conditions de contrôle (p lt; 0,05) (Figure 3E). Après 72 h, chez les animaux ALI, le contenu de l'albumine était de 48 ng/mL (SD 14), contre 29 ng/mL (SD 9) (p et lt; 0,05).

Figure 1 : Diagramme schématique du paramètre d'intubation. Il convient de noter que le cou de la souris doit être super-étendu à un angle de 90 degrés par rapport à la table d'opération. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : FACS stratégie de gating pour le sang, le BAL et les cellules tissulaires. Des taches de points exemplaires de l'analyse FACS sont montrées dans des parcelles pseudocolores à deux paramètres (fluorescence double couleur). La stratégie de gating pour les échantillons respectifs est basée sur des cellules simples. (A) Arbre de gating pour les cellules sanguines : a -cellules mortes ; b - cellules vivantes (selon la coloration des cellules vivantes/mortes; aucune coloration CD45 nécessaire comme dans le sang, une hyperfluorescence rend les populations cellulaires clairement distinguables); d - granulocytes neutrophiles; e monocytes (selon les taches Gr1 et CD115). (B) Arbre de gating pour le lavage bronchoalveolar (BAL) fluide : a -cellules mortes ; b - cellules vivantes (selon la coloration des cellules vivantes/mortes); c - CD45- cellules immunitaires; d - granulocytes neutrophiles; et e et macrophages (selon ly6G et f4/80). (C) Arbre de gating pour le tissu pulmonaire : a -cellules mortes ; b - cellules vivantes (selon la coloration des cellules vivantes/mortes); c - CD45- cellules immunitaires; d - granulocytes neutrophiles; et e et macrophages (selon ly6G et f4/80). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Validation du modèle ALI murine contre les animaux témoins. (A) Expression de TNF-Dans le tissu pulmonaire des femelles C57BL/6 souris 24 h et 72 h suivant l'instillation intratrachéale de LPS (changement de pli d'expression des animaux opérés de faux). (B) Analyse FACS du nombre absolu de granulocytes neutrophiles dans le tissu pulmonaire. (C) Expression de MMP-9 dans le tissu pulmonaire (changement d'expression de pli ageplides d'animaux opérés par faux). (D) Analyse FACS du nombre absolu de granulocytes neutrophiles dans le liquide de lavage bronchoalveolar. (E) Contenu d'albumine dans le fluide BAL [moyenne - SD, n 7, test Mann-Whitney U, 'p 'lt; 0.05 (vs. PBS control)]. Ce chiffre a été modifié à partir d'Ehrentraut et d'autres8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Composition du tampon FACS.

Tableau 2 : Préparation du mélange maître pour la coloration FACS. Le tableau décrit la préparation du mélange maître pour 10 échantillons.

Les auteurs n'ont rien à révéler.