Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

Laszlo Radnai; Rebecca F. Stremel; James R. Sellers; Gavin Rumbaugh; Courtney A. Miller

doi:10.3791/60017

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Article de méthode

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

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DOI :

10.3791/60017

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17 août 2019

Laszlo Radnai¹^,² , Rebecca F. Stremel¹^,² , James R. Sellers³ , Gavin Rumbaugh² , Courtney A. Miller¹^,²

¹Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, ²Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, ³Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Un test ATPase couplé à la nicotinamide adenine (NADH) a été adapté au dépistage semi-élevé de la myosine par petite molécule. Cet essai cinétique est exécuté dans un format microplate de 384 puits avec des volumes de réaction totaux de seulement 20 L par puits. La plate-forme devrait s'appliquer à pratiquement n'importe quelle enzyme productrice d'ADP.

Résumé

Les enzymes ATPase utilisent l'énergie libre stockée dans le triphosphate d'adénosine pour catalyser une grande variété de processus biochimiques endergoniques in vivo qui ne se produiraient pas spontanément. Ces protéines sont cruciales pour essentiellement tous les aspects de la vie cellulaire, y compris le métabolisme, la division cellulaire, les réponses aux changements environnementaux et le mouvement. Le protocole présenté ici décrit un nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-couplé ATPase-assay qui a été adapté au criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule d'ATPase. L'analyse a été appliquée à la myosine du muscle cardiaque et squelettique II, deux ATPases à base d'actine, comme preuve de principe. L'hydrolyse de l'ATP est couplée à l'oxydation de NADH par des réactions enzymatiques dans l'effort. Tout d'abord, l'ADP généré par l'ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK). PK catalyse la transition du phosphoenolpyruvate (PEP) à la pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH), qui catalyse l'oxydation du NADH en parallèle. Ainsi, la diminution de la concentration d'ATP est directement corrélée à la diminution de la concentration de NADH, qui est suivie du changement à la fluorescence intrinsèque de NADH. Tant que la PPE est disponible dans le système de réaction, la concentration d'ADP reste très faible, évitant l'inhibition de l'enzyme ATPase par son propre produit. En outre, la concentration atp reste presque constante, donnant des cours de temps linéaires. La fluorescence est surveillée en permanence, ce qui permet d'estimer facilement la qualité des données et aide à filtrer les artefacts potentiels (p. ex., résultant de précipitations composées ou de changements thermiques).

Introduction

Les myosines sont des transducteurs d'énergie mécanochimique qui hydrolysent l'adénosine triphosphate (ATP) pour générer un mouvement directionnel le long des filaments du cytosquelette d'actine chez les eucaryotes¹^,². Ils se sont adaptés structurellement et kinétiquement à leurs différentes fonctions intracellulaires, telles que le transport d'organites, la contraction musculaire ou la génération de tension cytosquelettique¹^,². La superfamille de myosine est représentée par 40 gènes de myosine appartenant à 12 classes distinctes de myosine dans le gén....