Article de méthode

Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

DOI :

10.3791/60135

⸱

17 janvier 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous décrivons et validons une méthode pour générer uniformément les cardiomyocytes pluripotents pluripotents de cellules souches induits par l'homme robustes et caractériser leur fonction. Ces techniques peuvent aider à développer un aperçu mécaniste des voies de signalisation, fournir une plate-forme pour le dépistage à grande échelle des médicaments, et modéliser de façon fiable les maladies cardiaques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) fournissent une source humaine précieuse pour l'étude de la science fondamentale du calcium (Ca2)des voies de manipulation et de signalisation ainsi que des tests de dépistage et de toxicité des médicaments à haut débit. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodologies utilisées pour générer des iPSC-CM de haute qualité qui peuvent reproduire de façon cohérente des caractéristiques moléculaires et fonctionnelles à travers différentes lignées cellulaires. En outre, une méthode est décrite pour évaluer de façon fiable leur caractérisation fonctionnelle par l'évaluation des propriétés de manutention Ca2. Les conditions à faible teneur en oxygène (O2), la sélection du lactate et le temps prolongé en culture produisent des cardiomyocytes ventriculaires de haute pureté et de haute qualité. Semblable aux cardiomyocytes adultes isolés de rat (ARCMs), les iPSC-CM de 3 mois présentent l'amplitude plus élevée de Ca2, le taux plus rapide de reuptake de Ca2MD (decay-tau), et une réponse lusitrope positive à la stimulation adrénergique de l'adrénergique par rapport au jour 30 iPSC-CM. La stratégie est techniquement simple, rentable et reproductible. Il fournit une plate-forme robuste pour modéliser les maladies cardiaques et pour le dépistage à grande échelle des médicaments pour cibler les protéines de manipulation Ca2.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) sont une plate-forme humaine attrayante pour modéliser une grande variété de maladies cardiaques in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. En outre, iPSC-CMs peut être utilisé pour la prédiction des réponses des patients à des médicaments nouveaux ou existants, pour dépister les composés touchés, et de développer de nouveaux médicaments personnalisés9,10. Cependant, malgré des progrès significatifs, plusieurs limitations et défis doivent être pris en considération lors de l'utilisation de l'iPSC-CMs11. Par conséquent, les méthodes visant à améliorer les protocoles de différenciation cardiaque, à améliorer l'efficacité et la maturation des iPSC-CM, et à générer des sous-types spécifiques de cardiomyocytes (ventriculaire, auriculaire et nodal) ont été intensément étudiées et ont déjà conduit à de nombreuses stratégies culturelles pour surmonter ces obstacles12,13,14,15.

Malgré la robustesse de ces protocoles, une préoccupation majeure pour l'utilisation des iPSC-CM est la reproductibilité des procédures longues et complexes pour obtenir des cardiomyocytes de haute qualité qui peuvent assurer les mêmes performances et les résultats reproductibles. La reproductibilité est essentielle non seulement pour comparer les lignées cellulaires ayant des antécédents génétiques différents, mais aussi pour répéter les comparaisons cellulaires et moléculaires d'une même lignée cellulaire. La variabilité cellulaire, comme les différences de bien-à-puits dans la densité des iPSC, peut affecter la différenciation cardiaque, générant un faible rendement et des cardiomyocytes de mauvaise qualité. Ces cellules pourraient encore être utilisées pour effectuer des expériences qui ne nécessitent pas une population pure de CM (p. ex., lors de l'exécution de mesures transitoires Ca2MD). En effet, lors de l'analyse électrophysiologique, les non-CM ne battront pas, ni spontanément ni sous stimulation électrique, il sera donc facile de les exclure de l'analyse. Cependant, en raison de la mauvaise qualité, les iPSC-CM peuvent présenter des caractéristiques électrophysiologiques altérées (p. ex., transitoires Ca2, faible amplitude Ca2) qui ne sont pas dues à leur constitution génétique. Par conséquent, particulièrement en utilisant l'iPSC-CMs pour modéliser la maladie cardiaque, il est important de ne pas confondre les résultats d'un CM de mauvaise qualité avec le phénotype de la maladie. Des processus de dépistage et d'exclusion minutieux sont nécessaires avant de procéder à des études électrophysiologiques.

Cette méthode comprend des protocoles optimisés pour générer des cardiomyocytes de haute pureté et de haute qualité et pour évaluer leur fonction en effectuant des mesures transitoires Ca2 à l'aide d'un système d'acquisition et d'analyse de calcium et de contractilité. Cette technique est un moyen simple, mais puissant, de distinguer entre les préparations iPSC-CM à haut rendement et de faible efficacité et de fournir une caractérisation plus pertinente sur le plan physiologique des iPSC-CM humaines.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les expériences utilisant des cardiomyocytes de rat adultes dans cette étude ont été menées avec les protocoles approuvés du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine Icahn à Mount Sinai. Les cardiomyocytes adultes de rat ont été isolés des coeurs de rat de Sprague Dawley par la méthode Langendorff-basée comme précédemment décrit16.

1. Préparation des médias

  1. Préparer les médias hiPSC.
    1. Équilibrez le supplément et la température moyenne à ambiante (RT) basale. Assurez-vous que le supplément a complètement décongelé. Mélanger 400 ml du milieu basal et 100 ml du supplément et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  2. Préparer l'IMRP et le B27.
    1. Équilibrez le supplément B27 et le milieu basal (RPMI 1640) à RT. Assurez-vous que le supplément a complètement décongelé. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  3. Préparer l'insuline RPMI et B27 (-)
    1. Équilibrez le supplément d'insuline B27 (-) et le milieu basal (RPMI 1640) à RT. Assurez-vous que le supplément a décongelé complètement. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  4. Préparer les supports de sélection (RPMI (-) glucose et B27 et lactate).
    1. Équilibrez le supplément B27 et le milieu basal (RPMI 1640 (-) glucose) à RT. Assurez-vous que le supplément a décongelé complètement. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x, ajouter 4 mM de lactate de sodium constituée dans de l'eau stérile et filtrer à l'aide d'un filtre à vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  5. Préparer RPMI 20.
    1. Équilibrez le milieu basal (RPMI 1640) pour synthétiser le sérum bovin fœtal (FBS) (20% de concentration finale) et le RPMI. Filtrer à l'aide d'un filtre à vide de 0,22 m et conserver à 4 oC. Équilibrez à RT avant utilisation.
  6. Préparer les supports de passage en ajoutant à hiPSC des supports à bobine enroulée et à bobines de rhosoliens contenant de la kinase protéique (ROCK).
  7. Préparer les médias D0 en ajoutant l'inhibiteur GSK-3, CHIR 99021 à RPMI - B27 (-) milieu xinsuline (10 m final).
  8. Préparer les médias D3 et D4 en mélangeant les supports d'insuline RPMI et B27 (-) avec iWR-1 (5 m final).
    REMARQUE : Les milieux D1 et D5 sont constitués d'insuline RPMI et B27 (-) Les médias D7 sont constitués de RPMI et B27.
  9. Préparer le tampon de blocage (2 % d'albumine de sérum bovin [BSA], 2 % de FBS, 0,05 % de NP-40 en saline tamponnée en phosphate [PBS]) : Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 1 g de BSA, 1 ml de FBS, 49 ml de PBS et 250 oL de NP-40. Mélanger jusqu'à dissolution complète.

2. Préparation de cellules souches embryonnaires humaines (HESC) qualifiées Plaques et plaques de couverture

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sous une hotte stérilisée de culture de tissu.

  1. Décongeler la solution de stock de matrice qualifiée par hESC pendant la nuit sur la glace à 4 oC. Reportez-vous à la feuille de spécification du produit pour déterminer les volumes d'aliquot appropriés, car cela peut varier en fonction du stock. Entreposer ces aliquots à -20 oC dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml.
  2. Afin d'utiliser la matrice pour les plaques de revêtement ou les couvercles en verre, décongelez d'abord un aliquot de matrice hESC-qualifiée à 4 oC pendant 30 min.
  3. Aliquot 24 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) : mélange nutritif F-12 (DMEM/F:12) dans un tube conique de 50 ml.
  4. Mélanger le média froid DMEM/F:12 avec une pipette en verre de 2 ml afin de refroidir la surface de la pipette.
  5. À l'aide de la même pipette, prendre environ 500 à 700 l de DMEM/F:12 froid et mélanger avec l'aliquot de matrice hESC-qualifié dans le tube de microcentrifuge lui-même.
  6. Une fois correctement mélangé, transférer la solution dans le tube conique de 50 ml contenant le DMEM/F:12 froid et mélanger à nouveau.
  7. Pour une assiette standard de 6 puits, ajouter 1 ml de ce mélange à chaque puits. Assurez-vous que le puits est entièrement couvert. Laissez les plaques à RT sous le capot de culture de tissu pendant au moins 30 min. Si vous le souhaitez, conserver à 4 oC immédiatement après le placage jusqu'à 1 semaine et réquilibrer à RT pendant 30 minutes avant l'utilisation.
  8. Afin d'utiliser les plaques, aspirer la matrice et remplacer par des supports appropriés. Utilisez immédiatement.
  9. Entreposez les couvercles en verre dans un environnement stérile (p. ex., à l'intérieur d'une hotte stérile de culture tissulaire).
  10. Avant d'enrober, essuyez chaque bordereau individuel avec 70 % d'éthanol. Une fois que le bordereau est sec, placez-le à l'intérieur d'un puits d'une plaque stérile de 6 puits.
  11. Prenez 250 à 300 l de la solution de matrice qualifiée par le HESC et distribuez-la soigneusement directement sur le centre de la glissière en verre. Laissez les couvertures à RT sous le capot de culture de tissu pendant au moins 30 min avant utilisation.

3. Préparation de petites molécules

REMARQUE : Reconstituer toutes les petites molécules et modulateurs Wnt dans DMSO sauf indication contraire.

  1. Préparer 10 mM d'aliquots de 25 L chacun de IWR-1 et CHIR 99021 et stocker à -20 oC.
  2. Reconstituer 10 mM d'aliquots de 50 OL chacun de Thiazovivin (inhibiteur de ROCK) et stocker à -20 oC.

4. Entretien et passage des iPSC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes sous une hotte stérile de culture de tissu.

  1. Maintenir les iPSC dans les plaques de puits standard 6 et effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles. Maintenir les cellules avec 2 ml de support hiPSC par puits. Changer les médias tous les deux jours. Maintenir les cellules à 37 oC, 6 % O2, 5 % CO2. Passer les cellules lorsqu'elles sont entre 70 et 80% de confluents.
  2. Equilibrate PBS sans Ca2 et Mg2 à RT.
  3. Pour commencer le processus de passaging, ajouter 1 mL de PBS sans Ca2 et Mg2 'au puits qui doit être passé. Incuber à RT pendant 7 à 10 min. Vérifier les cellules sous le microscope pour s'assurer que le traitement PBS n'a pas entraîné une dissociation complète de la monocouche.
  4. Retirez le PBS et remplacez-le par 1 ml de support de passage. Utilisez un élévateur cellulaire pour gratter doucement et soulever les cellules de la surface du puits.
  5. Dissocier mécaniquement les cellules à l'aide d'une pipette stérile en verre de 2 ml. Répétez l'opération jusqu'à ce que les cellules soient bien dissociées uniformément en petites colonies lorsqu'elles sont observées au microscope.
  6. Une fois que les cellules ont été suffisamment dissociées, ajouter 5 ml de support de passage pour diviser les cellules 1:6. Ajuster le nombre de supports de passage à ajouter pour correspondre au ratio de fractionnement préféré.
  7. Aspirez la matrice hESC-qualifiée de la plaque hESC-enduite de matrice et remplacez par 1 ml de support de passage par puits. Ajouter 1 ml de cellules dissociées par puits.

5. Différenciation cardiomyocyte

  1. Utilisez des lignes hiPSC bien établies (plus de 20 passages) et présentez une morphologie homogène avant de commencer la différenciation cardiaque.
  2. Assurez-vous que les iPSC sont environ 70-80% confluents.
  3. Laver les cellules 1x en PBS sans Ca2 et Mg2 .
  4. Ajouter 2 ml de support D0 (étape 1,7) par puits et transférer les cellules à l'incubateur.
  5. Après 24 h, remplacer par 3 ml de support D1 par puits pendant 48 h.
  6. Le jour 3, remplacez les médias par 2 ml de médias D3 par puits. Répétez avec les médias D4 le jour 4.
  7. Le jour 5, remplacez les médias par 3 ml de dj. Par puits.
  8. Le jour 7, remplacer les supports par 3 ml de support D7 par puits et transférer dans un incubateur avec 37 oC, 5% CO2, et la concentration normale o2. Remplacez les supports D7 (RPMI et B27) tous les 2 jours.

6. Procédure de sélection et dissociation iPSC-CM

  1. Dix jours avant d'effectuer les mesures transitoires Ca2 ou toute analyse fonctionnelle, remplacez le support RPMI B27 par 3 ml de support de sélection par puits pendant 48 h.
  2. Remplacer les médias par 3 ml de supports de sélection pour un autre 48 h.
  3. Remplacer les médias par 2 ml de support RPMI et B27 par puits pendant 24 h.
  4. Manteau standard 6 plaques de puits telles que décrites à la section 2.
  5. Ajouter 1 ml de trypsine stérile de 0,25% avec EDTA à chaque puits. Incuber la plaque à 37 oC pendant 5 min.
  6. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, dissocier mécaniquement les cellules afin que les cellules individuelles puissent être observées au microscope.
  7. Transférer les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml et ajouter 2 ml de RPMI 20 milieux par puits. Centrifugeuse de 5 min à 800 x g.
  8. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules dans les médias RPMI et B27. Aspirez la matrice hESC-qualifiée des plaques et remplacez-la par 1 mL de support RPMI et B27.
  9. À l'aide d'une pointe de pipette de 1 000 ml, dissocier mécaniquement le granule cellulaire jusqu'à ce que la solution semble homogène.
  10. Transférer environ 500 000 cellules à chaque puits. Transférer à l'incubateur pendant 24 h.
  11. Remplacer les médias par 3 ml de média de sélection par puits pendant 48 h.
  12. Remplacer les supports par 3 ml de RPMI et B27 par puits. Maintenir les cellules dans les médias D7 (RPMI et B2 changeant les médias tous les 2 jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour une analyse fonctionnelle.

7. Préparation des iPSC-CM s'adressent à Flow Cytometry

  1. Une fois que les cellules sont de l'âge désiré et ont subi la sélection métabolique (section 6), lavez les cellules avec PBS sans Ca2 et Mg2.
  2. Ajouter 1 ml par puits de trypsine 0,25% et incuber de 5 à 7 min à 37 oC.
  3. Pipette le mélange 5-10x avec une pointe P1000 pour singulariser les cellules, et transférer dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de RPMI 20.
  4. Faire tourner les cellules à 600 x g pendant 5 min.
  5. Ajouter 100 l de solution de fixation (4% PFA) à la pastille cellulaire. Ajouter la solution dans le sens goutte avec un vortex continu et doux, puis mettre sur la glace pendant 15 min.
  6. Ajouter 1,5 ml de PBS. Recueillir les cellules par centrifugation et aspirer le supernatant.
  7. Pour chaque expérience, inclure un contrôle non taché par condition de fixation/perméabilisation.
  8. Resuspendre les cellules dans 500 l de la solution de blocage (2% FBS/2% BSA en PBS avec 0.1% NP-40) pendant 30 min à RT.
  9. Sans enlever la solution de blocage, ajouter l'anticorps primaire MLC2V/MLC2A (5 mg/mL), et couver 45 min à RT.
  10. Laver avec un tampon de blocage. Recueillir les cellules par centrifugation et solution d'aspiration.
  11. Ajouter l'anticorps secondaire Alexa Fluor 555/488(1:750) dilué dans le tampon de blocage pendant 45 min à RT ou pendant la nuit à 4 oC.
  12. Ajouter 1,5 ml de PBS. Recueillir les cellules par centrifugation et solution d'aspiration.
  13. Resuspendre les cellules dans 250 à 300 oL de PBS. Utilisez une pipette P1000 pour désagréger les cellules.
  14. Préparer les tubes à fond ronds avec un capuchon de passoire à cellules en nylon de 35 m. Prémouiller la passoire cellulaire avec 50 L de PBS et régler le tube sur la glace.
  15. Transférer la solution avec les cellules désagrégées aux tubes de fond ronds avec les bouchons de passoire de cellules. Laissez la solution cellulaire s'écouler naturellement ou appuyez sur le fond du tube contre une surface plane, au besoin, afin d'assurer un drainage complet et la collecte des cellules dans le tube. Assurez-vous de remettre le tube sur la glace dès que possible.
  16. Rincer la passoire cellulaire avec 250 L de PBS pour récupérer les cellules résiduelles.
  17. Maintenir les tubes sur la glace et recouvrir de papier d'aluminium jusqu'à l'analyse de cytométrie du débit.

8. Platage Cardiomyocytes sur des couvertures en verre

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un environnement stérile.

  1. Préparer les couvercles en verre tels que décrits dans les étapes 2.10 et 2.11.
  2. Une fois que les iPSC-CM ont été sélectionnés et sont de l'âge désiré, suivez les étapes 6,5 à 6,7 pour dissocier les iPSC-CM.
  3. Aspirez le supernatant et resuspendez les cellules dans une quantité suffisante de rpMI 20 médias pour avoir environ 300.000 cellules par 250 'L.
  4. À l'aide d'une pipette en verre de 2 ml, dissocier mécaniquement la pastille cellulaire jusqu'à ce que la solution semble homogène.
  5. Aspirez la matrice hESC-qualifiée des couvertures.
  6. À l'aide d'une pipette de 1000 l, mélanger et tirer 250 l de la solution à partir du tube conique de 15 ml.
  7. Distribuez lentement les 250 L de la solution sur les couvercles en verre, en prenant le soin supplémentaire de ne faire qu'ajouter à la zone où le revêtement de matrice qualifié par le HESC est présent.
  8. Transférer soigneusement à l'incubateur et laisser la nuit, en prenant soin de ne pas secouer ou répandre les cellules sur les couvertures. Le lendemain matin, ajouter délicatement 2 mL de milieux D7 (RPMI et B27) à chaque puits avec le bordereau. Changer les médias après 24 h et tous les 2 jours après cela.

9. Fixation des cellules

  1. Assurez-vous qu'une quantité suffisante de PBS avec Ca2 et Mg2 est liboudrée à 4 oC.
  2. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) diluée à 4 % en PBS avec Ca2 et Mg2 et alquer à 4 oC.
  3. Une fois que les iPSC-CM sont d'âge approprié, ont subi une sélection métabolique (section 6), et ont été plaqués sur des couvertures (section 8), laver les cellules 3x avec 1 ml de PBS froid avec Ca2 et Mg2 par puits.
  4. Ajouter 1 ml de PFA froid de 4% et laisser les cellules à RT sous le capot pendant 15 min.
  5. Laver les cellules avec du PBS froid pour éliminer l'excès de PFA.
  6. Ajouter 2 ml de PBS avec Ca2 et Mg2 et conserver à 4 oC.

10. Staining immunofluorescence

  1. Retirez le PBS des cellules fixes et ajoutez 1 ml de tampon de blocage. Incuber pour 1 h à RT.
  2. Retirez le tampon de blocage et ajoutez l'anticorps primaire (5 mg/mL) dilué dans le tampon de blocage. Incuber toute la nuit à 4 oC.
  3. Laver 3x en PBS avec Ca2 et Mg2 pendant 5 min chacun.
  4. Ajouter l'anticorps secondaire dilué dans le tampon de blocage 1:1,000.
  5. Couvrir la plaque de papier d'aluminium pour la protéger de la lumière et incuber pendant 45 min à RT. Gardez le papier d'aluminium pour les étapes suivantes.
  6. Laver 3x en PBS avec Ca2 et Mg2,5 min chacun.
  7. Ajoutez une quantité suffisante de solution de travail DAPI pour couvrir complètement les cellules et incuber à RT pendant 10 min.
  8. Laver l'échantillon à fond avec du PBS avec Ca2 et Mg2 pour éliminer l'excès de DAPI.
  9. Prenez de nouveaux toboggans en verre et ajoutez une goutte de support de montage au milieu. Utilisez le goutte-à-goutte pour répartir uniformément les supports de montage. Placez les couvertures avec les cellules face vers le bas sur les diapositives.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées pendant 30 jours si elles sont protégées de la lumière.

11. Évaluation des passagers intracellulaires Ca2

  1. Une fois que les iPSC-CM sont au moins 3 mois, ont subi une sélection métabolique (section 6), et ont été plaqués sur des couvertures, les traiter avec 2 'L de Fura-2, AM (concentration finale: 1 'M) et incuber à 37 oC pendant 10 min.
    REMARQUE : Fura-2 est sensible à la lumière. Effectuez toutes les procédures de chargement et les expériences dans l'obscurité.
  2. Préparer le système d'acquisition et d'analyse du calcium et de la passialité.
    1. Alimenter le système en veillant à ce que la lampe à arc soit lancée (Figure 1B).
    2. Placez la chambre sur le système et connectez les tubes de la pompe à l'entonne et aux prises appropriées et au fil électrique du stimulateur à la chambre comme le montre la figure 1C.
    3. Remplissez le tube de perfusion qui traverse le chauffe-eau en ligne fluide avec la solution de Tyrode préchauffée à 37 oC.
    4. Ajuster la caméra et encadrer les dimensions de l'ouverture pour minimiser la surface de fond.
  3. Montez un couvercle en verre avec iPSC-CMs dans la chambre et attachez-vous.
  4. Ajoutez 500 l l de la solution de Tyrode directement sur le dessus de la glissière en verre attaché doucement et commencez à perser la chambre (1,5 mL/min) avec la solution de Tyrode.
  5. Pace iPSC-CMs avec 1 Hz stimulation de champ à l'aide du stimulateur électrique (10 V, 4 ms).
  6. Incuber les iPSC-CM dans la chambre avec stimulation pendant au moins 3 à 5 min pour que les cellules lavent le colorant Fura-2 et s'adaptent à l'environnement et la tordent.
  7. Ajustez la fenêtre d'observation à la partie supérieure gauche de la glissière de verre.
  8. Commencez à enregistrer.
  9. Après avoir recueilli un flux cohérent de 5 à 10 pics, cliquez sur Pause pour arrêter temporairement l'enregistrement.
  10. S'assurer que ni la mise au point ni les dimensions de la fenêtre d'observation ne sont modifiées, déplacer la scène du microscope vers la zone adjacente, se déplacer vers l'extrémité opposée, et reprendre l'enregistrement.
  11. Répétez les étapes 11.9 et 11.10 pour scanner à travers le bordereau de couverture, d'abord se déplaçant vers la gauche, puis vers le bas d'une manière zig-zag pour couvrir toute la zone de couverture. Il s'agit de 80 à 100 mesures par bordereau de couverture.
    REMARQUE : Limitez le temps de mesure total à 10 min, car les facteurs secondaires entraînent une diminution du taux transitoire Ca2.
  12. Une fois les transitoires Ca2MD acquises, analysez les données avec le logiciel d'analyse des traces de fluorescence selon les instructions du fabricant.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit dans la figure 1A a généré des cardiomyocytes très purs qui acquièrent un phénotype ventriculaire/adulte avec le temps dans la culture. Évalué par la coloration immunofluorescence pour les isoformes de la chaîne de lumière régulatrice de myosine auriculaire et ventriculaire 2 isoformes (MLC2A et MLC2V, respectivement), la majorité des cellules générées par ce protocole étaient MLC2A-positives au jour 30 après induction de la différenciation cardiaque, tan...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les étapes critiques pour l'utilisation des iPSC-CM humains comme modèles expérimentaux sont : 1) la génération de cardiomyocytes de haute qualité (CM) qui peuvent assurer les performances et les résultats reproductibles cohérents; 2) permettant aux cellules de mûrir en culture pendant au moins 90 jours pour évaluer adéquatement leur phénotype; 3) effectuer des études électrophysiologiques, par exemple des mesures transitoires du calcium (Ca2)pour fournir une caractérisation fonctionnelle physiologiquement per...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été appuyée par la subvention de développement scientifique 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 et AHA 18TPA34170460 (C.K.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-Actine, &alpha ;-Anticorps musculaire lisse, souris monoclonaleSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 chèvre anti sourisInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 chèvre anti lapinInvitrogenA21428
B27 SupplémentGibco17504-044
B27(-) insulineSupplément GibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
Coloration nucléaire DAPIThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM HepesGibco11330-032
Élévateur de cellules à double extrémité, lame plate et J-HookCelltreat229306
Falcon Plaque de culture tissulaire multipuits, 6 puitsCorning 353046
Chauffage fluidique en ligneCell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC Matrice qualifiéeCorning354277Matrigel
Matrice hPSCGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Chambre d’imagerie de cellules vivantesLive Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A, anticorps de souris monoclonaleSystèmes synaptiques311011
Système de calcium et de contractilité des myocytesIonoptixISW-400
Anticorps à chaîne légère de myosine 2, polyclonal de lapin (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Unités de filtre stérile jetable à flux rapide avec membranePESThermoFisher124-0045
PBS avec Calcium et MagnésiumCorning21-030-CV
PBS sans Calcium et MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
L-lactate de sodiumSigma AldrichL7022
Supplément StemFlexGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsine-EDTA (0,25 %)ThermoFisher25200056
La solution de TyrodeBoston BioproductsBSS-355wAjuster le pH à 7,2. Ajouter 1,2 mM de chlorure de calcium
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Références

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