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Article de méthode

Surveillance in Situ des assemblages de chaperon moléculaire s'est formé de façon transitoire dans les bactéries, les levures et les cellules humaines

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DOI :

10.3791/60172

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2 septembre 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les protéines cognates du domaine J coopèrent avec le chaperon Hsp70 pour aider à une myriade de processus biologiques allant du pliage des protéines à la dégradation. Ici, nous décrivons un assay in situ de ligature de proximité, qui permet la surveillance de ces machineries de chaperon transitoirement formées dans les cellules bactériennes, de levure et humaines.

Résumé

Les protéines du domaine J (PDJ) forment la plus grande et la plus diversifiée famille de co-chaperons dans les cellules eucaryotes. Des résultats récents montrent que des membres spécifiques de la famille JDP pourraient former des hétérocomplexes transitoires chez les eucaryotes pour affiner la sélection du substrat pour les désagrégations de protéines à base de chaperon de 70 kDa (Hsp70). Les complexes JDP ciblent les protéines agrégées induites par le stress aigu/chronique et aident vraisemblablement à assembler les désagrégation en recrutant plusieurs Hsp70 à la surface des agrégats protéiques. L'étendue du réseau de contrôle de la qualité des protéines (PQC) formé par ces PDJ physiquement interagissant demeure largement invivo. Ici, nous décrivons un analyse in situ d'interaction de microscopie basée sur la protéine appelée l'analyse de ligature de proximité (PLA), qui est capable de capturer vigoureusement ces complexes transitoirement formés de chaperon dans les compartiments cellulaires distincts des cellules eucaryotes. Nos travaux élargissent l'emploi de l'APL des cellules humaines à la levure (Saccharomyces cerevisiae) et les bactéries (Escherichia coli), rendant ainsi un outil important pour surveiller la dynamique des assemblages de protéines formés transitoirement dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes.

Introduction

Une grande quantité d'information génomique reste ininterprétable en raison de notre compréhension incomplète des interactomes cellulaires. Les méthodes conventionnelles de détection de l'interaction protéines-protéines, telles que la co-immunoprécipitation des protéines avec/sans liaison sépariale chimique et la co-localisation des protéines, bien que largement utilisées, posent une série d'inconvénients. Parmi les principaux inconvénients, mentionnons la mauvaise quantification des interactions et l'introduction potentielle d'événements contraignants non autochtones. En comparaison, les techniques émergentes basées sur la proximité offrent une alternative et une approche puissante pour capturer les interactions protéiques dans les cellules. L'assay de ligature de proximité (PLA)1, maintenant disponible en tant que kit propriétaire, utilise des anticorps pour cibler spécifiquement les complexes protéiques en fonction de la proximité des sous-unités en interaction.

L'APL est initiée par la formation d'un échafaudage composé d'anticorps primaires etsecondaires munis de petites étiquettes d'ADN (sondes D'APL) à la surface du complexe protéique ciblé (figure 1, étapes 1-3). Ensuite, déterminée par la proximité des étiquettes d'ADN, une molécule circulaire d'ADN est générée par hybridation avec des oligonucléotides de connecteur (figure1, étape 4). La formation de l'ADN circulaire est complétée par une étape de ligature de l'ADN. Le morceau circulaire nouvellement formé d'ADN sert de modèle pour l'amplification de la polymériase (PCR) à base de cercle roulant subséquent (PCR) amorcée par l'une des étiquettes conjuguées d'oligonucléotide. Cela génère une molécule d'ADN concatmérique unique attachée au complexeprotéique par l'intermédiaire de l'échafaudage d'anticorps (figure 1, étape 6). La molécule d'ADN concatégorique est visualisée à l'aide d'oligonucléotides étiquetés fluorescents qui s'hybrident à de multiples séquences uniques dispersées dans l'ADN amplifié (Figure 1, étape 7)2. Le signal PLA généré, qui apparaîtsous forme de point fluorescent (figure 1, étape 7), correspond à l'emplacement du complexe protéique ciblé dans la cellule. En conséquence, l'analyse pourrait détecter des complexes protéiques avec une grande précision spatiale. La technique ne se limite pas à la simple capture des interactions protéiques, mais pourrait également être utilisée pour détecter des molécules uniques ou des modifications protéiques sur les protéines à haute sensibilité1,2.

Hsp70 forme un système de chaperon très polyvalent fondamentalement important pour maintenir l'homéostasie cellulaire de protéine en participant à une série de fonctions d'entretien ménager et de stress-associées. Les activités d'entretien ménager du système de chaperon Hsp70 comprennent le pliage des protéines de novo, la translocation des protéines à travers les membranes cellulaires, l'assemblage et le démontage des complexes protéiques, la régulation de l'activité protéique et le lien entre le pliage des protéines et les différents machines de contrôle de la qualité3. Le même système de chaperon replie également les protéines mal repliées/dépliées, empêche l'agrégation de protéine, favorise la désagrégation de protéine et coopère avec les protéases cellulaires pour dégrader les protéines en phase terminale mal repliées/endommagées pour faciliter la réparation cellulaire après souligne protéotoxique4,5. Pour atteindre cette diversité fonctionnelle, le chaperon Hsp70 s'appuie sur des co-chaperons partenaires de la famille JDP et des facteurs d'échange de nucléotides (NEF) qui affinent le contrôle allostérique dépendant de l'ATP du Hsp70 de la liaison et de la libération du substrat3, 6. De plus, les co-chaperons JDP jouent un rôle essentiel dans la sélection des substrats pour ce système de chaperon polyvalent. Les membres de cette famille sont subdivisés en trois classes (A, B et C) en fonction de leur homologie structurelle au prototype JDP, le E. coli DnaJ. Les JDP de classe A contiennent un domaine J N-terminal, qui interagit avec Hsp70, une région riche en glycine-phénylalanine, une région de liaison de substrat composée d'une région de type doigt de zinc (ZFLR) et de deux domaines de baril de canon, et d'un domaine de dimerisation C-terminal. Les PDJ avec un domaine J N-terminal et une région riche en glycine-phénylalanine, mais dépourvus de ZFLR, entrent dans la classe B. En général, les membres de ces deux classes sont impliqués dans des fonctions de chaperonnage. Les membres relevant de la classe C fourre-tout, qui contient des JDP qui ne partagent que le j-domaine4, recrutent des Hsp70 pour effectuer une variété de fonctions non chaperonnées. Le rôle important des PDJ en tant qu'« adaptateurs » interchangeables du système Hsp70 se reflète dans l'expansion des membres de la famille au cours de l'évolution. Par exemple, les humains ont plus de 42 membres distincts du PDJ4. Ces JDP fonctionnent comme des monomères, des homodimers et/ou des oligomères homo/hétéro4,5. Récemment, une coopération fonctionnelle par la formation complexe transitoire entre la classe A (p. ex., H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) et classe B (p. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDPs eucaryotique a été rapporté pour promouvoir la reconnaissance efficace des agrégats de protéines amorphes in vitro7,8. Ces complexes mixtes de PDJ s'assemblent vraisemblablement à la surface de protéines agrégées pour faciliter la formation de disagrégations protéiques à base de Hsp70 et Hsp70-Hsp1007,8,9, 10. Les preuves essentielles à l'appui de l'existence de ces complexes de PDJ de classe mixte formés de façon transitoire dans des cellules eucaryotes ont été fournies avec pLA8.

PLA est de plus en plus utilisé pour évaluer les interactions protéiques dans les métazoaires, principalement dans les cellules de mammifères. Ici, nous rapportons l'expansion réussie de cette technique pour surveiller les complexes transitoirement formés de chaperon dans les organismes unicellulaires eucaryotes et procaryotes tels que la levure en herbe S. cerevisiae et la bactérie E. coli. Fait important, cette expansion met en évidence l'utilisation potentielle de l'APL dans la détection et l'analyse des microbes qui infectent les cellules humaines et animales.

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Protocole

1. Préparation de cellules Hela

  1. Préparer les matériaux suivants: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, complété par 10% FCS et 1% Pen-Strep; 4 % de paraformaldéhyde dans PBS; 0,5 % Triton-X100 en PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05 % Tween), pH 7,4; 0,0001% solution poly-L-Lysine stérile; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide; papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
    REMARQUE: Afin d'assurer une efficacité de fixation optimale, les solutions de paraformaldéhyde doivent être préparées fraîchement avant chaque expérience.
  2. Préparer une chambre humide en couvrant le fond d'une boîte fermée avec des tissus humides. Placez la chambre humide à 37 oC avant de commencer l'expérience, afin de s'assurer que la température de la chambre est de 37 oC tout en couvant les réactions enzymatiques.
  3. Culture Cellules HeLa dans les flacons T25, dans 5 ml de DMEM (High Glucose, Glutamate et Sodium Pyruvate complété) complété par 10% FCS et 1% Pen-Strep, dans un incubateur de 37 oC CO2 contenant 5% CO2. Dissocier les cellules adhérentes à l'aide de 0,05% Trypsin-EDTA. Après l'ajout de DMEM frais aux cellules dissociées, comptez les cellules à l'aide d'une chambre de comptage cellulaire et se développent sur des diapositives diagnostiques à l'intérieur d'une chambre humide.
  4. Stériliser les diapositives diagnostiques par irradiation UV dans un capuchon de culture de cellules stériles pendant 30 min.
  5. Ajouter 100 l de polylysine filtré e stérile à chaque puits requis pour l'expérience. Incuber pendant 30 min. Laver l'excès de poly-L-lysine en lavant chaque puits 3x avec de l'eau ultrapure de 50 ll.
  6. Trypsiniser les cellules HeLa et ajouter environ 15.000 cellules à chaque puits. Si nécessaire, diluer les cellules à au moins 30-50 'L de DMEM par puits.
  7. Cultivez les cellules dans une chambre humide dans un incubateur de CO2 de 37 oC de 5 % pendant environ 24 h. Les cellules doivent être des confluents de 60 % à 80 % avant de commencer l'APL.
    REMARQUE: Une confluence trop élevée diminue l'absorption des réactifs, diminuant le signal obtenu à la fin du protocole.
  8. Retirer le milieu en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les puits 3x avec 50 oL de PBS.
    REMARQUE: Les cellules sont sujettes à se détacher lorsque les liquides sont ajoutés durement. Cela peut être évité en ne laissant pas sécher complètement les puits avant d'ajouter un nouveau liquide et en ajoutant le nouveau liquide doucement au bord du puits.
  9. Fixez les cellules en ajoutant 50 l de paraformaldéhyde fraîchement préparé de 4 % dans le PBS à chaque puits. Incuber 10 min à température ambiante.
  10. Laver les diapositives 3x dans PBS. Effectuer des lavages dans un pot de teinture de diapositives Coplin contenant 100 ml de PBS. Pour chaque lavage, incuber 5 min à température ambiante sans trembler.
  11. Perméabilisez la membrane cellulaire en submergeant les diapositives en 100 ml de 0,5 % de Triton-X100 en PBS dans un bocal à taches de glissement de Coplin. Incuber 10 min à température ambiante sans trembler.
  12. Laver les glissières 3x dans TBS-T. Effectuer des lavages dans un pot de teinture de diapositives Coplin contenant 100 ml de SCT-T. Pour chaque lavage, incuber 5 min à température ambiante sans trembler.
  13. Après le dernier lavage, retirer l'excès de tampon avec un papier de soie. À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligation de proximité qui sera discuté à la section 4.

2. Préparation des cellules S. cerevisiae

  1. Préparer les matériaux suivants : 100 mM KPO4, pH 6.5, appelé Wash Buffer; 37 % de formaldéhyde; 4% de paraformaldéhyde en 100 mM KPO4, pH 6.5; 1,2 M sorbitol en 100 mM KPO4, pH 6,5; solution lyticase (lyticase de 500 g/mL, 20 mM de mercaptoéthanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% solution poly-L-Lysine; 1% Triton-X100 en 100 mM KPO4, pH 6.5; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide (préparée comme à l'étape 1.2); papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
    REMARQUE: Afin d'assurer une efficacité de fixation optimale, les solutions de paraformaldéhyde doivent être préparées fraîchement avant chaque expérience.
  2. Cultivez une culture du jour au lendemain dans le milieu non sélectif d'extrait de levure, de peptone et de dextrose (YPD) à 30 oC tout en secouant.
    REMARQUE: Selon les exigences expérimentales, les cellules S. cerevisiae peuvent être cultivées dans le milieu synthétique complet (SC) ou le milieu synthétique minimal (SM) à la place.
  3. Diluer la culture stationnaire à un OD600 de 0,1 dans 20 ml de milieu. Cultivez les cellules à 30 oC tout en secouant jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 0,5.
  4. Transférer la culture de 20 ml dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules en 5 ml de milieu frais.
  5. Fixez les cellules en ajoutant 550 L de formaldéhyde de 37 % à la culture. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  6. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de paraformaldéhyde fraîchement préparé de 4 % dans Wash Buffer. Incuber 45 min à température ambiante.
  7. Pendant l'incubation, préparez les diapositives diagnostiques en ajoutant 100 l de solution poly-L-lysine de 0,01 % à chaque puits. Incuber les toboggans pendant 30 min à température ambiante.
  8. Après 30 min, laver l'excès de poly-L-lysine avec de l'eau ultrapure et laisser sécher les lames à l'air. Les toboggans secs sont prêts à l'emploi.
  9. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon de lavage. Effectuer les lavages par centrifugation des cellules à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant et resuspendre les cellules dans Wash Buffer.
  10. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de 1,2 M de sorbitol dans Wash Buffer.
  11. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 l de solution Lyticase fraîchement préparée pour digérer la paroi cellulaire. Incuber les cellules dans la solution Lyticase pendant 15 min à 30 oC en secouant.
  12. Après la digestion, laver les cellules 3x par centrifugation à 665 x g pendant 3 min et retirer le supernatant. Resuspendre les cellules dans 250 'L de 1,2 M sorbitol dans Wash Buffer.
    REMARQUE: Parce que les cellules sont fragiles après la digestion de la paroi cellulaire, les resuspendre très soigneusement pour ne pas endommager les cellules.
  13. Ajouter 20 l de cellules resuspensionà la poly-L-lysine enduite. Laissez-les attacher aux glissières pendant 30 min. Laver les cellules non adhérentes en lavant les puits 3x avec 50 ll de tampon de lavage.
  14. Perméabilisez la membrane cellulaire en lavant 3x avec 50 L de 1% Triton-X dans Wash Buffer.
    REMARQUE: À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligature de proximité qui sera discuté à la section 4.

3. Préparation des cellules E. coli

  1. Préparer les matériaux suivants: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; solution lysozyme (2 mg/mL de lysozyme, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de glucose, 10 mM EDTA); 0,0001% solution poly-L-Lysine; 99 % de méthanol glacé; 99% de méthanol à température ambiante; 99% d'acétone; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide (préparée comme à l'étape 1.1.1); papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
  2. Cultivez une culture du jour au lendemain dans le milieu de Luria-Bertani (LB) à 30 oC en secouant.
  3. Diluer la culture stationnaire à un OD600 de 0,02 dans le milieu LB frais. Cultivez les cellules à 30 oC tout en secouant jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 0,4 pour les cellules de phase de notation.
  4. Environ 15 minutes avant que les cellules n'atteignent un OD600 de 0,4, préparez des lames enduites de poly-L-lysine en ajoutant 100 l de 0,0001% de polylysine à chaque puits. Incuber les toboggans pendant 30 min à température ambiante.
  5. Après 30 min, laver l'excès de poly-L-lysine avec de l'eau ultrapure et laisser sécher les glissières à l'air. Les toboggans secs sont prêts à l'emploi.
  6. Lorsque les cellules atteignent un OD600 de 0,4, transférer 1 ml de la culture à un tube de microcentrifuge stérile et des cellules de granules à 2 650 x g pendant 2 min.
  7. Resuspendre les cellules dans 50 l de milieu LB.
  8. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de méthanol glacé à 99 %. Mélanger très doucement à la main. Incuber les cellules pendant 30 min à -20 oC.
  9. Après fixation, ajoutez 20 l de cellules aux lames enduites de polylysine. Laisser sécher les lames à l'air pendant 30 min.
  10. Ajouter 50 ll de solution de lysozyme fraîchement préparée à chaque puits pour digérer la paroi cellulaire. Incuber dans une chambre humide pendant 30 min à 25 oC.
  11. Retirer la solution de lysozyme des puits en ajoutant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 3x en 100 ml de PBS-T. Effectuer chaque lavage dans un pot de copeaux de coloration pendant 30 s, sans trembler.
  12. Retirez le tampon de lavage des diapositives en tapant sur les diapositives sur un papier de soie.
  13. Perméabilisez les membranes cellulaires en ajoutant 50 L de 99 % de méthanol à chaque puits. Incuber 1 min à température ambiante.
  14. Enlever le méthanol en plaçant un papier de soie sur le bord du puits.
  15. Ajouter 50 l'acétone à 99 % de chaque puits. Incuber 1 min.
  16. Enlever l'excès d'acétone en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laisser sécher les glissières. À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligature de proximité qui sera discuté à la section 4.

4. La proximité Ligation Assay

  1. Préparer les matériaux suivants : Blocking Buffer; Tampon de dilution d'anticorps ; Wash Buffer 'A' (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7.4; Wash Buffer 'B' (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Rabbit Secondary Antibody PLUS; Anti-Mouse Secondary Antibody MINUS; 5x Tampon de ligation; ligase; 5x Tampon d'amplification (Orange :ex 554 nm ;em 576 nm); polymérase; eau ultrapure; et le support de montage contenant du DAPI.
    REMARQUE : Les réactifs de détection de l'APL sont également disponibles dans les variantes Green (ex 495 nm ;em 527 nm), Rouge (ex 594 nm;em 624 nm), FarRed (ex 644 nm ; 'em 669 nm) ou Brightfield (peroxidase de l'estréode (HRP) conjugués).
  2. Bloquez les cellules en ajoutant une goutte de tampon de blocage à chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC dans une chambre humide.
  3. Préparer des solutions d'anticorps en diluant les anticorps de stock dans Le tampon de dilution d'anticorps. Pour chaque puits, 40 l de solution d'anticorps sont nécessaires.
  4. Enlever le tampon de blocage en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Ajouter 40 l d'anticorps dilués dans le tampon de dilution d'anticorps à chaque puits. Incuber 60 min dans une chambre humide à 37 oC ou toute la nuit à 4 oC.
  5. Retirez la solution d'anticorps des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 5 min, sans trembler.
  6. Pendant les étapes de lavage, diluer 5x sondes d'anticorps secondaires, anti-lapin PLUS et anti-souris MINUS (la spécificité des espèces des sondes dépend des anticorps primaires utilisés), dans Antibody Dilution Buffer. Préparer 40 L de solution d'anticorps par puits.
  7. Ajouter 40 L de solution d'anticorps secondaire à chaque puits. Incuber pendant 60 min à 37 oC dans une chambre humide.
  8. Enlever la solution d'anticorps secondaire des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 5 min, sans trembler.
  9. Pendant les lavages, préparer 40 l de mélange de ligature par puits, en mélangeant 8 l l de tampon de ligation 5x, 31 l d'eau ultrapure et 1 l de ligase.
  10. Ajouter 40 ll de mélange de ligature à chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC dans une chambre humide.
  11. Retirer le mélange de ligation des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 2 min, sans trembler.
  12. Pendant les lavages, préparez 40 l l de mélange d'amplification par puits, en mélangeant 8 ll de solution d'amplification 5x, 31,5 l d'eau ultrapure et 0,5 l de polymérase.
    REMARQUE: L'amplification 5x contient des sondes fluorescentes. Protégez ce mélange de la lumière. Protégez également les glissières de la lumière pendant chacune des étapes suivantes. Si vous utilisez des bocaux translucides à glissière Coplin et des chambres humides, enveloppez-les dans du papier d'aluminium.
  13. Ajouter 40 ll de mélange d'amplification par puits. Incuber 100 min à 37 oC dans une chambre humide.
  14. Retirer le mélange d'amplification des puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'B' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 10 min sans trembler.
  15. Laver les toboggans dans 100 ml de Wash Buffer 'B' dilué 1:100 dans de l'eau ultrapure dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 30 s.
  16. Ajouter 20 L de DAPI contenant le milieu de montage par puits aux diapositives. Fermer les glissières avec un bordereau et sceller les glissières avec du vernis à ongles.
  17. En cas d'imagerie, incubez immédiatement le DAPI contenant le milieu de montage pendant 10 à 15 min, tout en se prémuniant de la lumière. Si ce n'est pas le cas, entreposez les glissières à -20 oC jusqu'à 1 semaine, à l'abri de la lumière.

5. Détection

  1. Utilisez la microscopie confocale pour acquérir des images des cellules HeLa, S. cerevisiae et E. coli avec des objectifs d'apochromat 20x/0,8 NA, 63x/1.4 NA et 100x/1.4 NA Plan Apochromat, respectivement. Excitez le DAPI taché d'ADN avec un laser à diodes pulsées de 405 nm. Pour le signal PLA (pour cette étude) exciter avec un laser à l'état solide 561 nm.

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Résultats

Nos études in vitro précédentes utilisant des protéines purifiées ont révélé qu'un sous-ensemble de PDJ de classe A et Declasse B de l'homme forment des complexes jDP transitoires de classe mixte pour cibler efficacement un large éventail de protéines agrégées et peut-être faciliter l'assemblage de Hsp70-basés protéines désagrége7. Nous avons employé PLA pour déterminer si les complexes de PDJ de classe mixte (A-B) se produisent dans les cellules cancéreuses cervicales humaines (HeLa). Les PDJ hum...

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Discussion

Les approches basées sur la co-immunoprécipitation et la colocalisation ont été utilisées comme méthodes de longue date pour caractériser les assemblages de protéines. La détection de complexes de chaperonspécifiques spécifiques formés de façon transitoire est un défi majeur avec de telles méthodes conventionnelles, et par conséquent, les résultats précédents sont largement limités à des interprétations qualitatives. Les techniques de co-immunoprécipitation basées sur la lyse cellulaire nécessitent souvent des liaisons c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

NBN est soutenu par une subvention spéciale de recrutement de la Faculté de médecine de l'Université Monash, les sciences infirmières et de la santé, avec un financement du gouvernement de l'État de Victoria et du gouvernement australien. Nous remercions Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Allemagne) et Harm H. Kampinga (Department of Biomedical Sciences of Cells and Systems, University of Groningen, Pays-Bas) pour leur soutien et leur partage inestimables de réactifs, Holger Lorenz (ZMBH) Imaging Facility, Heidelberg University, Allemagne) pour son soutien à la microscopie confocale et au traitement d'images, et Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australie) pour la lecture critique du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
37 % FormaldéhydeMerck103999
AcétoneSigma-Aldrich32201
anticorps anti-DNAJA2Abcamab157216
anticorps anti-DNAJB1Enzo Life SciencesADI-SPA-450
anticorps anti-DnaKAnticorps anti-mCherry maison
Abcamab125096
anticorps anti-Sis1Cosmo Bio CorpCOP-080051
anticorps anti-Ydj1StressMarq Biosciences  ; SMC-150,anticorps
anti-YFPEn interne
Coplin Pot de coloration sur lamesSigma-AldrichS5516
Lames de diagnosticMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink Réactifs de détection in situ OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Milieu de montage Situ + DAPISigma-AldrichDUO82040
Sonde PLA In Situ DuoLink Anti-Souris MINUSSigma-AldrichDUO92004
Sonde PLA In Situ DuoLink Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink, SérumSigma-AldrichDUO82049
Thermo-Fischer10082147
LysozymeSigma-Aldrich62971
MéthanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Pénicilline/StreptomycineThermo-Fischer15070063
Poly-L-LysineSigma-AldrichP47-07
SorbitolSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TrypsineThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseÉtats-Unis BiologiqueZ1004
Tampons de lavage in situ de veau fœtal

Références

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
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