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Article de méthode

Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus

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DOI :

10.3791/60182

⸱

27 septembre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Dans cet article

Résumé

Cette méthode décrit la préparation d'échantillons à partir de cellules cultivées et de tissus animaux, l'extraction et la dérivatisation de la coenzyme A dans les échantillons, suivie s'il y a une chromatographie liquide à haute pression pour la purification et la quantification de la coenzyme Dérivée A par détection de l'absorption ou de la fluorescence.

Résumé

La recherche émergente a indiqué que l'approvisionnement en coenzyme a (CoA) cellulaire peut devenir limitant avec un impact préjudiciable sur la croissance, le métabolisme et la survie. La mesure du CoA cellulaire est un défi en raison de son abondance relativement faible et de la conversion dynamique de CoA libre en thioesters CoA qui, à leur tour, participent à de nombreuses réactions métaboliques. Une méthode est décrite qui navigue à travers les pièges potentiels pendant la préparation de l'échantillon pour produire un essai avec une large gamme linéaire de détection qui convient à une utilisation dans de nombreux laboratoires biomédicaux.

Introduction

Coenzyme A (CoA) est un cofacteur essentiel dans tous les organismes vivants et est synthétisé à partir d'acide pantothénique, également appelé pantothénate (le sel d'acide pantothénique) ou vitamine B5. Le CdA est le principal vecteur intracellulaire d'acides organiques, y compris les acides à chaîne courte comme l'acétate et le succinate, les acides à chaîne comme le propionate et le méthylmalonate, les acides gras à longue chaîne comme le palmitate et l'oleat, les acides gras à très longue chaîne tels que les acides gras à très longue chaîne tels que acides gras polyinsaturés, et les xénobiotiques tels que l'acide valproïque. L'acide organique forme un lien de thioester enzymatiquement avec CoA pour permettre son utilisation comme substrat dans plus de 100 réactions dans le métabolisme intermédiaire1. Les thioesters CoA sont également des régulateurs allostériques et des activateurs transcriptionnels. Il est maintenant apprécié2 que l'offre totale cellulaire DeA est réglementée3,4; ainsi, la disponibilité de CoA peut être limitante, et que les insuffisances de CoA peuvent être catastrophiques, comme illustré par les désordres génétiques hérités qui ont un impact coadsynthèse5. Pantothenate kinase catalyse la première étape de la biosynthèse CoA (Figure 1) et Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, appelé PKAN, est causée par des mutations dans le gène PANK2 6. La synthase CoA, codée par le gène COASYN, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse coA (Figure 1) et de la neurodégénérescence associée aux protéines COASY, appelée CoPAN, est causée par une mutation du gène COASYN 7. Les deux PKAN et CoPAN sont des maladies neurodégénératives héréditaires associées à l'accumulation de fer dans le cerveau et les carences de CoA sous-en-plan les pathologies de la maladie.

Les niveaux cellulaires de CoA total varient entre les tissus8 et le CoA total peut augmenter ou diminuer sous une variété d'états physiologiques, pathologiques et pharmacologiques. Liver CoA augmente lors du passage du carburant de l'état nourri à l'état à jeun9, et les niveaux de CoA du foie sont anormalement élevés chez les souris obèses déficientes en leptine10. Le CoA du foie diminue en réponse à l'ingestion chronique d'éthanol11. Les niveaux de CoA du cerveau dans le modèle de souris Kok2 Pank2 sont déprimés pendant la période périnatale, mais plus tard dans le stade adulte, la teneur en CoA du cerveau est équivalente aux niveaux de type sauvage, ce qui indique une réponse adaptative de CoA pendant le développement12. La manipulation de la teneur en CoA tissulaire par la transgenèse ou les méthodes d'administration de gènes a un impact sur les fonctions métaboliques et neuronales13,14,15. Le développement préclinique de thérapies potentielles pour PKAN ou CoPAN inclut des mesures de CoA de cellules ou de tissu comme indicateurs de l'efficacité16,17,18,19,20 . L'évaluation de toutes ces conditions et de leurs conséquences métaboliques ou fonctionnelles exige une méthode quantitative pour mesurer le CoA total.

Un analyse précis et fiable pour mesurer le CoA dans les échantillons biologiques est un défi technique dans de nombreux laboratoires. Malheureusement, il n'y a pas de sondes disponibles pour évaluer ou quantifier les thioesters CoA ou CoA dans les cellules intactes, bien que les analogues des thioesters naturels de CoA aient été largement utilisés comme sondes mécanistes dans les études de l'ester de CoA utilisant des enzymes21. La conversion de CoA, avec un masydryle libre (-SH) moiety, à un thioester CoA (ou vice versa) est rapide dans les cellules ou les tissus animaux lors du transfert vers un environnement différent et pendant la lyse cellulaire. De nombreuses synthétases acyl-CoA et thioestérases acyl-CoA dans les cellules servent de médiateur sa part aux interconversions au sein du pool CoA, et d'autres enzymes qui utilisent des thioesters CoA comme substrats restent actifs dans les échantillons biologiques jusqu'à ce qu'ils soient éteints par des produits chimiques ou physiques. moyen de. Le déchargement des groupes d'acyl de CoA à carnitine par acyl-transferases est un exemple dans le réseau de réactions qui peuvent modifier la distribution de thioester CoA/CoA. Les traceurs radioactifs peuvent être utilisés pour mesurer les taux de synthèse du CoA dans les cellules. Les méthodes actuelles de mesure des dérivés du CoA et du CoA dans les échantillons biologiques ont été examinées22 et comprennent des essais spectrophotométriques enzymatiques couplés, une chromatographie liquide à haute pression et des procédures basées sur la spectrométrie de masse. Cependant, ces méthodes sont souvent axées sur des espèces moléculaires de CoA particulières et sont aveugles à la variation du pool total de CoA. Les essais enzymatiques couplés nécessitent généralement de plus grandes quantités de matériel d'entrée en raison de sensibilités de détection faibles et ont une gamme limitée de linéarité.

Notre laboratoire a développé une procédure fiable pour la quantification du Total des ACo dans les cellules cultivées et les tissus animaux. La stratégie comprend l'hydrolyse de tous les thioesters CoA pour ne produire que des ACo gratuits pendant la préparation de l'échantillon, plutôt que de faire des efforts pour maintenir et analyser l'ensemble du spectre des espèces de CoA. La procédure est une compilation de méthodes individuelles publiées pour la préparation de l'échantillon, la dérivation du CDA, la purification et l'identification après chromatographie liquide à haute pression (HPLC), et la quantification du CDA dérivé par absorption ou détection de fluorescence23,24,25. Les déterminations de la CDA obtenues à l'aide de cette procédure ont permis de comprendre la réglementation de la CDA et de développer une approche thérapeutique pour le traitement des carences en CaD.

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Protocole

La procédure animale mentionnée dans ce protocole a été effectuée selon les protocoles 323 et 556 et spécifiquement approuvée par le St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Préparation des solutions

REMARQUE : Utilisez de l'eau ultrapure pour toutes les solutions et lorsqu'elle est indiquée dans les procédures.

  1. Préparer 1 mM d'hydroxyde de potassium (KOH) dans l'eau.
  2. Préparer 0,25 M KOH dans l'eau.
  3. Préparer 1 M Trizma-HCl dans l'eau et ajuster au pH 8.0.
  4. Préparer 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrile (Optima Grade). Les solutions de stock de mBBr sont stables à -20 oC pendant de nombreux mois à condition qu'elles soient maintenues dans l'obscurité car l'exposition à la lumière peut photolyser le monobromobimane au bimane26.
  5. Préparer le tampon de lavage pour l'extraction de phase solide (SPE) colonne : 50% de méthanol (Grade Optima) - 2% d'acide acétique.
  6. Préparer le tampon d'élution pour la colonne SPE : 95 % d'éthanol (catégorie HPLC) contenant 50 mM de formatdi d'ammonium.

2. Préparation de la norme CoA-bimane

  1. Achetez une norme CoA de haute qualité auprès d'une source réputée (p. ex., Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Préparer une solution de stock à haute concentration de CoA en 20 mM Tris, pH 8. La quantité de CoA dans le stock de haute concentration est déterminée ou confirmée par absorption spectrophotométrique à 260 nm (16 800 M- 1cm-1). Ajouter 4 fois l'excès molaire de mBBr; vortex en hauteur pendant 10 s. Par exemple, pour 10 mM CoA en tampon, ajouter 40 mM mBBr. Le mBBr est ajouté en excès pour s'assurer que tous les CoA est dérivé.
  3. Incuber à température ambiante pendant 4 h dans l'obscurité sans trembler pour dériver le CoA avec du mBBr. mBBr réagit avec le groupe de thiol du CoA, et il est pH et la température dépendante27. L'ajout du mBBr convertit le CoA en coA fluorescent soluble dans l'eau (ou absorbant ultraviolet) CoA-bimane (CoA-bimane; Figure 2).
  4. Ajouter de l'acide acétique de 100 l et du vortex à feu vif pendant 10 s pour arrêter la réaction.
  5. Centrifugeàeur à 2 000 x g pendant 15 minutes pour enlever tout précipité.
  6. Nettoyer le supernatant à l'aide d'une colonne SPE pour enlever le mBBr non réagi (décrit ci-dessous). La filtration et la centrifugation de l'éluate ne sont pas nécessaires après le nettoyage de la colonne SPE (section 5.8).
  7. Recueillir l'éluate de la colonne SPE contenant le CoA-bimane dans un tube pré-pesé, sécher sous le gaz azoté, peser et construire une courbe d'étalonnage standard avec des quantités connues de CoA-bimane.
    1. Vérifiez la norme CoA-bimane pour la pureté par HPLC (voir ci-dessous) avec la détection d'absorption à la fois à 260 euros (moiety adénine) et 393 (bimane moiety) et la coïncidence des deux pics dans le chromatogramme.
    2. Confirmer la quantité de la norme CoA-bimane dans le stock à haute concentration à l'aide de 260 nm (16 800 M- 1cm-1).
  8. Enregistrez le temps de rétention hPLC pour l'identification de CoA-bimane dans des échantillons expérimentaux à l'aide de la norme CoA-bimane.
  9. Entreposer les aliquots du stock à haute concentration de la norme CoA-bimane, protégé de la lumière et entreposé à -20 oC pendant 2 ans. Évitez le dégel et le regel répétés.

3. Extraction et dérivatisation du CDA dans les cellules cultivées

  1. Récoltez les cellules adhérentes en culture à l'approche des densités de sous-confluents tardives. Par exemple, les cellules humaines HepG2/C3A sont cultivées à une densité de 6-8 x 106, ou heK 293T cellules sont cultivées à une densité de 1,3 x 107 par 100 mm plat.
    1. Utilisez régulièrement des cultures en double ou triplicates pour les déterminations du CoA. Incuber des plats de culture distincts en parallèle avec les cultures de cellules d'échantillon pour déterminer le nombre viable de cellules. Calculer la quantité de CoA par 106-107 cellules après la purification HPLC.
  2. Aspirer la culture moyen hors du plat. Lavez rapidement les cellules sur le plat avec de la saline tamponnée par le phosphate glacé (PBS) pour enlever tout milieu résiduel et aspirer le PBS du plat. Lavez rapidement les cellules avec de l'eau glacée pour enlever les PBS résiduels et aspirer rapidement l'eau du plat. Évitez de déranger les cellules adhérentes lors de l'ajout du PBS ou de l'eau.
  3. Ajouter 1 ml d'eau glacée au plat de culture. Gratter les cellules dans l'eau froide dans le plat et transférer la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre contenant 400 L de 0,25 M KOH et 1,5 ml d'eau.
    1. Mélanger la suspension vigoureusement par vortex à haute teneur pendant 10 s. Ensuite, couvrir étroitement avec du film de paraffine et couver à 55 oC pendant 1 h sans trembler dans un bain d'eau. Le pH de l'échantillon doit être de 12. Le pH élevé est important pour hydrolyser les thioesters CoA et peut être ajusté avec des aliquots supplémentaires de KOH si nécessaire.
  4. Récolte des cellules cultivées en suspension par centrifugation à basse vitesse : 136 x g pendant 6 min à 4 oC. Laver une fois avec du PBS glacé, puis laver brièvement à nouveau avec de l'eau froide, et enfin resuspendre dans 2,5 ml d'eau froide plus 400 L 0,25 M KOH. Mélanger vigoureusement et incuber à 55 oC comme décrit ci-dessus.
  5. Ajouter 160 l de 1 M Trizma-HCl et 10 oL de 100 mBBr et mélanger par vortex à hauteur pendant 10 s. Cela porte le pH à environ 8 pour soutenir la réaction mBBr avec CoA gratuit. Couvrir et incuber des échantillons à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité pour que le mBBr réagisse avec le thiol de CoA.
  6. Ajouter 100 l d'acide acétique et mélanger par vortex à haute teneur pendant 10 s pour arrêter la réaction
  7. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 15 min pour enlever les débris cellulaires précipités.
  8. Retirez et enregistrez le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne SPE qui est décrit ci-dessous.

4. Extraction et dérivatisation du CoA dans les tissus

  1. Disséquer les morceaux de tissu animal, d'environ 0,5 cm de diamètre ou moins, et effacer brièvement (1-2 s) sur du papier absorbant, puis geler le flash dans l'azote liquide et les stocker à -80 oC jusqu'au traitement. CoA dans les tissus est hydrolysé ou converti en un thioester si ce n'est flash congelé. Cette étape est importante pour obtenir le rendement maximal de CoA dans les tissus.
  2. Pesez rapidement les morceaux de tissu congelés (5 à 60 mg) avant de commencer l'analyse et enregistrez le poids de chaque échantillon. Cette détermination du poids humide est utilisée pour le calcul de la teneur en CoA après la purification HPLC. Éviter le dégel complet des morceaux de tissu.
  3. Ajouter 2 ml de 1 mM DE KOH à un tube à essai en verre (p. ex., 13 mm x 100 mm jetable) destiné à l'insertion d'une sonde et à une perturbation tissulaire à l'homogénéisateur rotor-stator. Garder le tube sur la glace jusqu'à l'utilisation. Ceci est fait pour s'assurer que les échantillons sont homogénéisés à une température froide et CoA n'est pas détruit en raison de la chaleur générée lors de l'homogénéisation.
  4. Transférer et homogénéiser les tissus (30 à 40 mg) dans le tube à essai en verre (contenant du froid de 1 mM DE K.-O.) pendant 30 s. Éviter la décongélation complète du tissu.
  5. Ajouter 500 oL de 0,25 M KOH; vortex à haute teneur de 10 s et conserver sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons soient homogénéisés. Cela amènera le pH de l'échantillon au-dessus de 12 à hydrolyser les thioesters CoA pour produire coA total (libre CoA - hydrolysé salincissements AC thioesters).
  6. Incuber les échantillons à 55 oC pendant 2 h dans un bain d'eau sans trembler pour soutenir l'hydrolyse.
  7. Ajouter 150 oL de 1 M Trizma-HCl et 10 oL de 100 mM mBBr; vortex en hauteur pendant 10 secondes. Cela porte le pH à environ 8 pour soutenir la réaction mBBr avec CoA gratuit.
  8. Incuber des échantillons à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité pour s'assurer que tous les CoA sont dérivés de mBBr.
  9. Ajouter 100 l'acide acétique et le vortex à feu vif pendant 10 s pour arrêter la réaction.
  10. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 15 min jusqu'aux débris de cellules précipités.
  11. Retirez et enregistrez le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne SPE (décrit ci-dessous).

5. Nettoyage d'échantillon avec la colonne d'extraction de phase solide (SPE)

  1. À température ambiante, équilibrez chaque colonne jetable de gel de silice éthylique de 2-(2-pyridyl) (1 ml) avec 1 ml de tampon de lavage pour s'assurer que le groupe fonctionnel de pyridyle est protoné et fonctionnera comme un échangeur d'anions. Le gel de silice éthylique de 2-(2-pyridyl)-est un échangeur d'anion faible qui est idéal pour CoA-bimane à un pH de base. 2-(2-pyridyl)-gel de silice éthylique a un pKa de 6 et l'élution est fait pH 7.
  2. Ajouter l'échantillon de supernatant (étape 4.11) à la colonne et recueillir eluate.
  3. Laver la colonne deux fois avec 1 ml de tampon de lavage pour éliminer toute espèce non conservée.
  4. Laver la colonne une fois avec 1 ml d'eau.
  5. Laver la colonne deux fois avec 1 ml de tampon d'élution dans un tube à essai en verre séparé (12 mm x 75 mm) pour recueillir le CoA-bimane.
  6. Échantillon de CoA-bimane sec dans le tube sous le gaz azoté à la sécheresse. L'échantillon séché est stable à température ambiante jusqu'à une utilisation ultérieure. Sceller et couvrir complètement le tube et le stocker.
  7. Une fois prêt pour l'analyse hPLC, suspendre l'échantillon dans 300 l d'eau et mélanger vigoureusement par vortex à haute température pendant 10 s.
  8. Transférer l'échantillon suspendu dans un filtre à tube de centrifugeuse (0,22 m d'acétate de cellulose, taille de 2 ml) et une centrifugeuse à 5 000 x g pendant 10 min pour enlever tout précipité.
  9. Transférer l'échantillon filtré dans un flacon de verre adapté à l'injection de HPLC.

6. Purification et mesure HPLC de CoA-bimane

  1. Préparer les tampons. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Acetonitrile (Optima Grade).
  2. Alimentez le système HPLC.
    REMARQUE : Le système HPLC de notre laboratoire est un module de séparation Waters e2695 équipé d'un détecteur d'absorption 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) et d'un détecteur de fluorescence 2475 contrôlé par le logiciel Empower 3. Le système dispose également d'un injecteur d'échantillon automatisé.
  3. Injecter chaque échantillon (p. ex., 20 l) pour la séparation sur une colonne Gemini C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm à l'aide du programme dans le tableau 1 avec un débit de 0,5 ml/min. La température de la colonne est de 25 oC. Mesurer l'absorption des UV/Visible à 393 nm, et la détection fluorescente à 393 nm, 470 nm. Le temps de rétention est déterminé par l'exécution d'une courbe standard CoA-bimane avant chaque ensemble d'échantillons.
  4. Enregistrez la zone sous le pic CoA-bimane pour chaque échantillon et comparez avec la courbe standard pour calculer le pmol de CoA-bimane injecté sur la colonne HPLC. La courbe standard d'absorption de CoA-bimane est utilisée pour les échantillons de tissus, et la courbe standard de fluorescence CoA-bimane est utilisée pour les échantillons de culture tissulaire.
  5. Comme les valeurs du CoA-bimane représentent un ACo total pour chaque échantillon, normalisez le nombre de cellules viables pour les échantillons de culture, ou le poids mg humide pour les échantillons de tissus (figure 6). Alternativement, calculez les valeurs totales de CoA après normalisation à la teneur en ADN ou en protéines pour chaque échantillon. La teneur en ADN ou en protéines peut être déterminée séparément à l'aide d'aliquots échantillon qui sont enlevés lors de la préparation de l'échantillon avant l'ajout de KOH.

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Résultats

Une méthode relativement rapide et fiable pour la détection du CoA total dans les cellules et les tissus cultivés a été développée en dérivant le thiol de CoA à un agent fluorescent utilisant mBBr, puis en purifiant le CoA-bimane dérivé en utilisant la phase inverse HPLC. Une courbe standard est d'abord générée, où des quantités connues et croissantes de la norme CoA-bimane sont injectées individuellement et les zones sous les pics dans les chromatogrammes CoA-bimane sont tracées en fonction de l'entrée CoA-bimane (

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Discussion

Ici, nous démontrons une procédure fiable, étape par étape pour quantifier le Total CoA dans les cellules et les tissus animaux avec un large éventail de détection linéaire qui est accessible dans de nombreux laboratoires qui ont un HPLC avec soit un détecteur de sortie d'absorption ou de fluorescence. Alternativement, la spectrométrie de masse est une technique courante pour évaluer les thioesters CoA et CoA, mais n'est pas largement disponible en raison du coût de l'instrumentation et des connaissances spécialisées req...

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Déclarations de divulgation

MWF, CS et SJ ont écrit le document, MWF et CS ont fourni les données et les chiffres, COR a conçu les expériences et a examiné le manuscrit de façon critique. SJ et COR sont des inventeurs sur une demande de brevet en instance (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" détenue par St. Jude Children's Research Hospital qui couvre le composé PZ-2891 référencé dans cet article.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le financement de la recherche parrainée fournie par CoA Therapeutics, Inc., une filiale de BridgeBio LLC, les National Institutes of Health subvention GM34496, et l'American Lebanese Syrian Associated Charities.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-(2-pyridyl)-éthyl gel de silice Colonne SPEMillipore-Sigma54127-U
coenzyme AAvanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 &mu ; m 100 et Aring ; Colonne HPLCPhenomenex00F-4439-E0
monobromobimaneThermoFisher ScientificM-1378
Sonde Omni-Tip perturbateur tissulaireOmni International32750H
ParafilmFisherS37440
PowerGen 125 rotor motorisé stator homogénéisateurThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X filtre à tube centrifugeCoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Waters 2475 détecteur de fluorescenceWaters2475
2489 détecteur UV-VisWaters2489
Waters e2695 module de séparationWaterse2695
Waters

Références

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Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus
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