Cette méthode décrit la préparation d'échantillons à partir de cellules cultivées et de tissus animaux, l'extraction et la dérivatisation de la coenzyme A dans les échantillons, suivie s'il y a une chromatographie liquide à haute pression pour la purification et la quantification de la coenzyme Dérivée A par détection de l'absorption ou de la fluorescence.
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Article de méthode
Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus
Dans cet article
Résumé
Résumé
La recherche émergente a indiqué que l'approvisionnement en coenzyme a (CoA) cellulaire peut devenir limitant avec un impact préjudiciable sur la croissance, le métabolisme et la survie. La mesure du CoA cellulaire est un défi en raison de son abondance relativement faible et de la conversion dynamique de CoA libre en thioesters CoA qui, à leur tour, participent à de nombreuses réactions métaboliques. Une méthode est décrite qui navigue à travers les pièges potentiels pendant la préparation de l'échantillon pour produire un essai avec une large gamme linéaire de détection qui convient à une utilisation dans de nombreux laboratoires biomédicaux.
Introduction
Coenzyme A (CoA) est un cofacteur essentiel dans tous les organismes vivants et est synthétisé à partir d'acide pantothénique, également appelé pantothénate (le sel d'acide pantothénique) ou vitamine B5. Le CdA est le principal vecteur intracellulaire d'acides organiques, y compris les acides à chaîne courte comme l'acétate et le succinate, les acides à chaîne comme le propionate et le méthylmalonate, les acides gras à longue chaîne comme le palmitate et l'oleat, les acides gras à très longue chaîne tels que les acides gras à très longue chaîne tels que acides gras polyinsaturés, et les xénobiotiques tels que l'acide valproïque. L'acide organique forme un lien de thio....
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Protocole
La procédure animale mentionnée dans ce protocole a été effectuée selon les protocoles 323 et 556 et spécifiquement approuvée par le St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparation des solutions
REMARQUE : Utilisez de l'eau ultrapure pour toutes les solutions et lorsqu'elle est indiquée dans les procédures.
- Préparer 1 mM d'hydroxyde de potassium (KOH) dans l'eau.
- Préparer 0,25 M KOH dans l'eau.
- Préparer 1 M Trizma-HCl dans l'eau et ajuster au pH 8.0.
- Préparer 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrile (Optima Grade). Les ....
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Résultats
Une méthode relativement rapide et fiable pour la détection du CoA total dans les cellules et les tissus cultivés a été développée en dérivant le thiol de CoA à un agent fluorescent utilisant mBBr, puis en purifiant le CoA-bimane dérivé en utilisant la phase inverse HPLC. Une courbe standard est d'abord générée, où des quantités connues et croissantes de la norme CoA-bimane sont injectées individuellement et les zones sous les pics dans les chromatogrammes CoA-bimane sont tracées en fonction de l'entrée CoA-bimane (
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Discussion
Ici, nous démontrons une procédure fiable, étape par étape pour quantifier le Total CoA dans les cellules et les tissus animaux avec un large éventail de détection linéaire qui est accessible dans de nombreux laboratoires qui ont un HPLC avec soit un détecteur de sortie d'absorption ou de fluorescence. Alternativement, la spectrométrie de masse est une technique courante pour évaluer les thioesters CoA et CoA, mais n'est pas largement disponible en raison du coût de l'instrumentation et des connaissances spécialisées req.......
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Déclarations de divulgation
MWF, CS et SJ ont écrit le document, MWF et CS ont fourni les données et les chiffres, COR a conçu les expériences et a examiné le manuscrit de façon critique. SJ et COR sont des inventeurs sur une demande de brevet en instance (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" détenue par St. Jude Children's Research Hospital qui couvre le composé PZ-2891 référencé dans cet article.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent le financement de la recherche parrainée fournie par CoA Therapeutics, Inc., une filiale de BridgeBio LLC, les National Institutes of Health subvention GM34496, et l'American Lebanese Syrian Associated Charities.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-(2-pyridyl)-éthyl gel de silice Colonne SPE | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 &mu ; m 100 et Aring ; Colonne HPLC | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Sonde Omni-Tip perturbateur tissulaire | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 rotor motorisé stator homogénéisateur | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X filtre à tube centrifuge | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 détecteur de fluorescence | Waters | 2475 | |
| 2489 détecteur UV-Vis | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 module de séparation | Waters | e2695 |
Références
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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Réimpressions et autorisations
