Article de méthode

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

17K vues

⸱

DOI :

10.3791/60299

⸱

6 novembre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Résumé

Le traitement auditif de la cochlée dépend de l'intégrité des cellules ciliées mécanosensorielles. Au cours d'une vie, la perte auditive peut être acquise à partir de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le processus de vieillissement. La perte de cellules ciliées sensorielles est une caractéristique pathologique commune des variétés de perte auditive acquise. En outre, la synapse de cellules de cheveux internes peuvent être endommagées par des insultes légères. Par conséquent, les préparations de surface de l'épithélie cochléaire, en combinaison avec les techniques d'étiquetage immunoetsetaux et l'imagerie confocale, sont un outil très utile pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules capillaires sensorielles, changements des niveaux de protéines dans les cellules ciliées et les cellules de soutien, la régénération des cellules ciliées et la détermination de l'expression du gène de rapport (c.-à-d., GFP) pour la vérification de la transduction réussie et l'identification des types de cellules transductées. La cochlée, une structure osseuse en forme de spirale dans l'oreille interne, détient l'organe auditif de fin sensorielle, l'organe de Corti (OC). Les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien environnantes dans le CO sont contenues dans le conduit cochléaire et reposent sur la membrane basilaire, organisée de façon tonotopique avec détection à haute fréquence se produisant dans la base et basse fréquence dans l'apex. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la capacité de manipuler des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la recherche biologique, y compris dans la science de l'audition. Cependant, la cochlée de souris adulte est minuscule, et l'épithélium cochléaire est encapsulé dans un labyrinthe osseux, rendant la microdissection difficile. Bien que des techniques de dissection aient été développées et utilisées dans de nombreux laboratoires, cette méthode modifiée de microdissection utilisant l'adhésif de cellules et de tissu est plus facile et plus commode. Il peut être utilisé dans tous les types de cochlée de souris adultes après la décalcification.

Introduction

La cochlée est dédiée à la détection du son et responsable de l'audition. Le conduit cochléaire est enroulé dans une forme spirale dans le labyrinthe osseux et tient l'organe d'extrémité sensorielle auditive, l'organe de Corti (OC). Le CO repose sur la membrane basilaire, constituant l'épithélium cochléaire, d'une longueur d'environ 5,7 mm lorsqu'il est désenroulé chez les souris adultes CBA/ CaJ1,2. Parce que le CO est tonotopiquement organisé avec des hautes fréquences détectées dans la base et les basses fréquences dans l'apex, l'épithélium cochléaire est souvent divisé en trois parties pour des comparaisons analytiques: les tours asphériques, moyens et basaux correspondant à faible, détection moyenne et haute fréquence, respectivement. En plus d'un éventail de cellules de soutien, le CO est composé d'une rangée de cellules ciliées internes (IHC) situées médially et de trois rangées de cellules ciliées externes (CCO) situées latéralement par rapport à la spirale cochléaire.

Le traitement auditif correct dépend de l'intégrité des cellules ciliées sensorielles dans la cochlée. Les dommages ou la perte de cellules ciliées sensorielles sont une caractéristique pathologique commune de la perte auditive acquise, causée par de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le vieillissement processus3. En outre, l'intégrité et la fonction de la cellule capillaire interne / synapses nerveuses auditives peuvent être altérées par des insultes légères4. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la manipulation des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la science de l'audition. Bien que la cochlée adulte de souris soit minuscule et que l'épithélium cochléaire soit entouré d'une capsule osseuse entraînant des microdissections techniquement difficiles, des préparations de surface de l'épithélium en combinaison avec l'immunolabeling ou l'immunohistochimie et l'imagerie confocale ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules ciliées, les changements dans les niveaux de protéines dans les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien, et la régénération des cellules capillaires. Des préparations de surface cochléaires ont également été utilisées pour déterminer le modèle d'expression des gènes des journalistes (c.-à-d. GFP) et confirmer la transduction réussie et identifier les types de cellules transductées. Ces techniques ont été précédemment utilisées pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la perte auditive induite par le bruit à l'aide de souris adultes CBA / J5,6,7,8,9.

Contrairement à l'immunohistochimie utilisant des sections de paraffine ou des cryosections pour obtenir de petites parties transversales de la cochlée qui contiennent trois cellules ciliées externes (CCO) et une cellule capillaire interne (IHC) sur chaque section, les préparations de surface cochléaire permettent visualisation de toute la longueur de l'OC pour le comptage des cellules ciliées sensorielles et des synapses de ruban et de l'immunolabeling des cellules ciliées sensorielles correspondant à des fréquences fonctionnelles spécifiques. Le tableau 1 montre la cartographie des fréquences auditives en fonction de la distance le long de la spirale cochléaire chez la souris adulte CBA/J selon des études de Muller1 et Viberg et Canlon1,2. Les préparations de surface cochléaires ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. La méthode de dissection cochléaire à monture entière a été décrite à l'origine dans un livre édité par Hans Engstrom en 196616. Cette technique a ensuite été affinée et adaptée à une variété d'espèces telles que décrites dans la littérature par un certain nombre de scientifiques en sciences de l'audition10,11,12,13, 15,17 et par les laboratoires Eaton-Peabody au Massachusetts Eye and Ear18. Récemment, une autre méthode de dissection cochléaire a été rapportée par Montgomery et coll.19. La microdissection de la cochlée est une étape essentielle et critique pour les préparations de surface cochléaires. Cependant, disséquer les cochléées de souris est un défi technique et nécessite une pratique considérable. Ici, une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire est présentée pour une utilisation dans les cochléae adultes de souris. Cette méthode nécessite la décalcification et l'utilisation d'adhésif cellulaire et tissulaire (c.-à-d. Cell-Tak) pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire à des couvertures rondes de 10 mm pour l'immunoétiquetage. L'adhésif de cellules et de tissu a été employé couramment pour l'immunohistochimie20. Cette méthode de microdissection cochléaire modifiée est relativement simple par rapport à celles précédemment rapportées18,19.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Tous les protocoles de recherche impliquant des souris adultes mâles de l'ABC/J à l'âge de 10-12 semaines et des souris c57BL/6J à l'âge de 6-8 semaines ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'université médicale de Caroline du Sud (MUSC). Les soins aux animaux étaient sous la supervision de la Division des ressources animales de laboratoire du MUSC.

REMARQUE: Pour les procédures présentées ci-dessous, les souris sont anesthésiés avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par injections intrapéritones. Les souris sont décapitées après que l'animal ne répond plus aux stimuli douloureux, comme une pincée d'orteil.

1. Extraction d'os temporels

  1. Décapiter la souris immédiatement post mortem avec des ciseaux chirurgicaux (17 cm de long) et couper l'os du crâne avec des ciseaux de l'aspect postérieur vers l'avant le long de la ligne centrale du crâne après avoir exposé l'os du crâne en tirant la peau antérieurement.
  2. Retirez le tissu cérébral à l'aide de forceps et enlevez manuellement les os temporels avec le pouce et l'index pour les souris de trois mois ou plus. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux (11 cm de long) pour couper l'os temporal des souris de moins de trois mois.
  3. Mettre l'os temporel dans un plat Petri (30 mm de diamètre) contenant de la glace fraîche 4% paraformaldéhyde frais (PFA) solution dissous dans le phosphate tamponné saline (PBS), pH 7.4.
    REMARQUE: Préparer la solution PFA fraîche de 4% et ajuster le pH à 7.4 juste avant de fixer les os temporels, parce que l'équilibrage incorrect de pH de la solution PFA diminuera la qualité de l'immunolabeling.

2. Fixation et perfusion

  1. Retirez les rubans de la fenêtre ovale et perforez la membrane de la fenêtre ronde avec des #5 des forceps. Sous un microscope stéréo dissection faire un petit trou dans le sommet de la cochlée à l'aide d'une aiguille de 27 G connecté à une seringue de 1 ml.
  2. Perfuse doucement et lentement la cochlée avec la solution PFA de 4% par les fenêtres rondes et ovales jusqu'à ce que la solution se lave hors du petit trou à l'apex. Transférer la cochlée (une ou deux cochlée par flacon) sur des flacons de scintillation de volume de 20 ml contenant 10 ml de solution PFA de 4 %.
  3. Agiter doucement les flacons de scintillation à température ambiante (RT) pendant 2 h et laisser passer la nuit au réfrigérateur (4 oC) sur un rotateur.
    REMARQUE: Le moment de fixation peut être ajusté en fonction de l'anticorps utilisé. Par exemple, limiter la fixation à 1,5 h permettra d'immunolabeling réussie des terminaux post-synaptiques lors de l'utilisation de l'anticorps GluA 2.

3. Décalcification de l'os temporel

  1. Retirer la solution PFA et laver les cochlée avec du PBS 3x frais pendant 5 min chacun.
  2. Ajouter 20 ml de 4 % de sel disodium d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) de sel disodium (EDTA) solution (pH 7,4) aux flacons de scintillation et conserver dans un réfrigérateur pendant 48 à 72 h sur un rotateur avec une agitation douce. Changez la solution EDTA tous les jours jusqu'à ce que les cochlées soient décalcifiées. Vérifiez si les cochlées sont décalcifiées en touchant la partie vestibulaire osseuse avec des forceps pour évaluer l'élasticité ou simplement couper un petit morceau du bord de la partie vestibulaire. Si une telle coupe entraîne une pièce écrasée, la cochlée n'est pas décalcifiée.
    REMARQUE: La solution EDTA peut interférer avec l'immunoréaction des anticorps primaires en fonction de la concentration de la solution. Préparer 4% EDTA en PBS et ajuster le pH à 7,4. Pour une décalcification cohérente des os temporels, la solution EDTA fraîche est utilisée.
  3. Changer la solution à PBS pour la microdissection après la décalcification est terminée.
    REMARQUE: Si les cochlées ne sont pas suffisamment décalcifiées, la dissection des cochlées ne peut pas être effectuée.

4. Microdissection de l'épithélium cochléaire

REMARQUE: Une fois la décalcification terminée, la microdissection de l'épithélium cochléaire pour l'immunolabeling doit être effectuée dès que possible. Dans un plat Petri propre de 30 mm contenant du PBS, l'oreille interne est orientée de la manière suivante : en référence au haut (couvercle) et au bas du plat Petri, les fenêtres rondes et ovales cochléaires donnent sur le dessus. En ce qui concerne le dissecteur, la partie cochléaire est orientée vers l'avant (loin du secteur) et la partie vestibulaire vers l'arrière (presque dissector). Ce qui suit décrit les étapes en détail.

  1. Maintenez la partie vestibulaire de l'os temporel avec des forceps et coupez le tour acalique avec le scalpel à un angle de 45 degrés comme indiqué par la ligne rouge (Figure 1a).
  2. Couper verticalement le long de la ligne faible entre la fenêtre ronde et la fenêtre ovale, comme l'indique la ligne rouge (figure 1b) pour séparer la cochlée de la partie vestibulaire (Figure 1c).
    REMARQUE: Cette partie cochléaire contient les parties moyennes, basales et crochetdelées de l'épithélium.
  3. Placez la partie cochléaire avec le basal tourner vers le bas et le virage du milieu vers le haut du plat Petri et couper la capsule osseuse et la paroi latérale du virage du milieu vers l'extrémité à partir de laquelle la section apale a été enlevée, comme indiqué par la ligne rouge (Figu re 1d,e).
  4. Continuer à couper pour séparer complètement la partie médiane des régions basales et des hameçons(figure 1f,g).
    REMARQUE: La région de crochet de la cochlée est l'extrémité de l'épithélium cochléaire correspondant à la sensibilité aux tons 48 kHz et plus élevé chez les souris.
  5. Mettre la partie basale et crochet avec le site de la membrane basilaire orienté vers le bas du plat et couper verticalement le modiolus de la région du crochet pour enlever le modiolus comme indiqué par la ligne rouge verticale (Figure 1g).
    REMARQUE: Le modiolus est l'axe central conique de la cochlée qui se compose d'os spongieux et de nerf cochléaire ainsi que le ganglion en spirale. Il peut être préférable d'effectuer cette coupe avec des ciseaux.
  6. Couper les régions basales et crochetées comme l'indique l'autre ligne rouge à la figure 1g pour séparer la partie du crochet (Figure 1h).
    REMARQUE: La cochlée a maintenant été séparée en parties apicales, moyennes, basales et crochets. Les prochaines étapes seront la dissection finale de chacun des virages individuels, en utilisant le tour du milieu comme exemple.
  7. Couper les portions relativement grandes de capsule osseuse et de tissu latéral du tour du milieu, comme l'indique la ligne rouge (figure 1i).
    REMARQUE: La paroi latérale du conduit cochléaire est formée par le ligament spiralé et la stria vascularis.
  8. Tenez la paroi latérale avec des forceps pour aligner la capsule osseuse et la paroi latérale avec le fond de la vaisselle Petri et coupez ces tissus du côté de la membrane basilaire. Aplatir ensuite le spécimen pour orienter le côté de la surface des cellules capillaires sensorielles vers le haut. Couper le reste de la capsule osseuse et la paroi latérale (Figure 1j).
  9. Enlever la membrane tectoriale à l'aide de forceps pour séparer complètement la région du milieu (Figure 1k).
  10. Répéter les étapes 4.7-4.9 pour les dissections finales des tours ou des régions restants comme indiqué dans la figure 1l.
  11. Préparer un bordereau rond de 10 mm pour l'adhérence de l'épithélium sensoriel. Utilisez une pipette pour répandre à la main 0,5 l d'adhésif cellulaire et tissulaire au centre de la feuille de couverture ronde. Après le séchage (3 à 5 min à RT), mettre les couvertures dans PBS dans les plats Petri.
  12. Coller les quatre morceaux de l'épithélium sensoriel sur la couverture ronde de 10 mm dans le plat Petri. Ensuite, tenez un bord de la couverture pour le transférer dans un plat à quatre puits pour l'immunolabeling ou l'immunohistochemistry (Figure 1m).
    REMARQUE : La figure 2 illustre l'emplacement des compressions majeures.

5. Immunolabeling pour Cochlear Synapses

REMARQUE: Le protocole pour l'immunolabeling pour des synapses cochléaires suivis dans cette étude a été précédemment décrit13. Les rubans présynaptiques ont été étiquetés avec un anticorps CtBP2 (protéine de liaison anti-carboxyl-terminal de souris 2 IgG1, étiquetant le domaine B de la protéine d'échafaudage RIBEYE). Les terminaux post-synaptiques ont été étiquetés avec l'anticorps GluA2 (récepteur anti-glutamate de souris 2 IgG2a, sous-unités d'étiquetage du récepteur AMPA).

  1. Laver l'épithélium sensoriel avec PBS 3x pendant 5 min chaque lavage dans un plat à quatre puits, puis ajouter 2 ml de surfactant nonionic 2 % (c.-à-d., Triton-X 100) dans le plat pendant 30 min à RT sur un rotateur.
  2. Retirez la solution de surfactant nonionic du plat à l'aide d'une pipette et ajoutez 100 L de solution de blocage contenant 10% de sérum de chèvre normal à chaque puits pendant 1 h sur un rotateur avec une douce agitation à RT.
  3. Retirez la solution de blocage de chaque puits, lavez-la avec PBS 3x pendant 5 min chaque lavage sous une douce agitation à RT.
  4. Ajouter 100 l des anticorps primaires dilués avec du PBS à chaque puits : souris anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), souris anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Couvrir chaque plat à quatre puits avec son couvercle et le placer dans un grand récipient humidifié qui protège de la lumière. Incuber à 37 oC pendant 24 h.
    REMARQUE: En option, lapin anti-myosin VIIa (1:400) pour immunolabeling cellules ciliées sensorielles peuvent être ajoutés.
  5. Laver 3x avec PBS pendant 5 min chaque lavage avec une agitation douce à RT.
  6. Ajoutez 100 l des anticorps secondaires Alexa 594 chèvre anti-souris IgG1a (1:1,000), Alexa 488 chèvre anti-souris IgG2a (1:1,000) dilué avec PBS à chaque puits. Couvrir chaque plat à quatre puits avec son couvercle et le placer dans un grand récipient humidifié qui protège de la lumière. Incuber à 37 oC pendant 2 h.
    REMARQUE: Si la myosine VIIa est utilisée, ajouter Alexa 350 chèvre anti-lapin (1:200).
  7. Laver 3x avec PBS pendant 5 min. Ensuite, transférez la glissière ronde de 10 mm sur une glissière avec les échantillons sur le dessus.
  8. Ajouter délicatement 8 L de Fluoro-Gel avec tampon Tris au centre de la couverture. Puis tenez le bord d'un autre coverslip rond de 10 mm avec des forceps à monter sur le dessus, en sandwich les deux couvertures ensemble.
  9. Utilisez du vernis à ongles pour sceller les lames, les mettre dans un dossier de diapositives en carton et conserver au réfrigérateur.
    REMARQUE: Si un peu de Fluoro-Gel fuit entre les couvertures pendant le montage, nettoyez les bords des couvertures avant de sceller la lame avec du vernis à ongles. Les images confocales doivent être prises dans les 7 jours.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les préparations de surface de l'épithélium cochléaire, combinées à l'immunolabeling et à l'imagerie confocale, ont été largement utilisées dans la science auditive pour l'étude des pathologies cochléaires, telles que la quantification des synapses de ruban, des cellules capillaires sensorielles, et l'expression des protéines dans les cellules ciliées sensorielles5,6,7,8. Bien que la dissection...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La microdissection cochléaire des préparations de surface de montage entier en combination avec l'immunolabeling fournit un outil de base pour l'étude des pathologies d'oreille interne et des mécanismes moléculaires. Cette méthode de dissection cochléaire de souris adulte modifiée utilisant l'adhésif de cellules et de tissu simplifie cette procédure difficile.

Bien que cette méthode modifiée de préparation de surface cochléaire soit relativement facile et accessible, elle nécessite toujours de...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Le projet de recherche décrit a été soutenu par la subvention R01 DC009222 du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Ces travaux ont été réalisés dans l'édifice WR du MUSC dans un espace rénové soutenu par la subvention C06 RR014516. Les animaux ont été logés dans des installations musC CRI pour animaux, appuyés par la subvention C06 RR015455 du Programme des installations de recherche extra-muros du National Center for Research Resources. Les auteurs remercient le Dr Jochen Schacht pour ses précieux commentaires et Andra Talaska pour la relecture du manuscrit.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 mm Rund Coverslips Produitsmicroscopie pour la science et l’industrie260367
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-souris IgG2Thermo Fisher ScientificA-21131
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-souris IgG1Thermo Fisher ScientificA-21125
Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-lapin IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA11012
Plateaux Micro Slide en cartonFisher Scientific12-587-10
Cell-TakBD Biosciences354240
Corning Boîtes de PétriFisher Scientific353004
DAPIThermo Fisher Scientific62247
Dumont #5 ForcepsOutils scientifiques fins FST11251-20
EDTA Sel disodiqueSigma-AldrichE5134
Fluoro-gel avec tampon TrisMicroscopie électronique Sciences17985-10
Boîtes de culture cellulaire à quatre puitsGreiner Bio-One627170
Anticorps anti-myosine VIIa de chèvreProteus Biosciences25-6790
Lames de microscopeFisher Scientific12-544-7
Anticorps anti-CtBP2de souris BD Biosciences#612044
Anticorps anti-glu2R de sourisMilliporeMAB397
Sérum de chèvre normalThermo Fisher Scientific31872
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich441244
Phosphate SalineFisher ScientificBP665-1
ScalpelVWR100491-038
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Vannas Spring CiseauxOutils Fins Science15001-08
de

Références

  1. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  2. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
  3. Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
  6. Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
  7. Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
  8. Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
  9. Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469(2018).
  10. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
  11. Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
  12. Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
  13. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  14. Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063(2016).
  15. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
  16. Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
  17. Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
  18. MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
  19. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  20. Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
  21. Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
  22. Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
  23. Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
  24. Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262(2014).
  25. Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407(2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cochl e de souris adulteorgane de Cortitechniques d immunomarquageimagerie confocalem thode de microdissectionproc dure de d calcificationadh sif tissulairevisualisation des cellules cili esanalyse des synapses en ruban

Articles connexes