Article de méthode

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

6.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/60303

⸱

14 octobre 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les tumeurs neuroendocrines (NET) proviennent des cellules neuroendocrines de la crête neurale. Ils sont à croissance lente et difficiles à la culture. Nous présentons une stratégie alternative pour cultiver des NETs des petites entrailles en les cultivant en tant que sphéroïdes. Ces sphéroïdes ont de petits marqueurs NET intestin et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues.

Résumé

Les tumeurs neuroendocrines de petite entrailles (SBNETs) sont des cancers rares provenant des cellules d'entéroochromaffin de l'intestin. La recherche dans ce domaine a été limitée parce que très peu de lignées cellulaires SBNET dérivées de patients ont été générées. Les cellules SBNET bien différenciées se développent lentement et sont difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires qui ont été établies ne sont pas facilement disponibles, et après le temps dans la culture peut ne pas continuer à exprimer des caractéristiques des cellules NET. La génération de nouvelles lignées cellulaires pourrait prendre de nombreuses années puisque les cellules SBNET ont un long temps de doublement et de nombreuses étapes d'enrichissement sont nécessaires afin d'éliminer les fibroblastes rapidement associés au cancer. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un protocole à la culture des cellules de SBNET des tumeurs chirurgicalement enlevées comme sphéroïdes dans la matrice extracellulaire (ECM). L'ECM forme une matrice tridimensionnelle qui encapsule les cellules SBNET et imite le micro-environnement tumoral pour permettre aux cellules SBNET de se développer. Ici, nous avons caractérisé le taux de croissance des sphéroïdes de SBNET et décrit des méthodes pour identifier des marqueurs de SBNET utilisant la microscopie et l'immunohistochimie d'immunofluorescence pour confirmer que les sphéroïdes sont des cellules neuroendocrines de tumeur. En outre, nous avons utilisé des sphéroïdes SBNET pour tester la cytotoxicité de la rapamycine.

Introduction

Les petites tumeurs neuroendocrines d'entrailles (SBNETs) proviennent des cellules d'entérosochromaffin du petit intestin. Bien que les SBNETs soient généralement connus pour se développer lentement, ils métastasent généralement au foie1. Tandis que le déplacement chirurgical ou l'ablation de tumeur peut être considéré dans beaucoup de cas, la répétition est presque universelle, et, par conséquent, la thérapie médicale joue un rôle important dans la gestion. D'énormes efforts ont été investis pour générer de nouvelles lignées cellulaires SBNET pour le dépistage des drogues. Cependant, il y a eu très peu de succès. Seules 6 lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) ont été signalées2,3,4,5; et malheureusement, une lignée cellulaire n'exprime plus de marqueurs NET6 et trois autres lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) ont été déterminées à provenir de lymphoblastes transformés au lieu de NETs7. Afin d'accélérer l'identification des médicaments pour cibler les SBNET, d'autres méthodes de dépistage in vitro des drogues sont nécessaires.

Ici, nous profitons de la disponibilité des SBNETs réséqués et avons établi un moyen de cultiver ces SBNETs dérivés du patient comme des sphéroïdes de plus en plus en ECM. L'objectif global de ce manuscrit est de décrire une méthode de culture SBNET comme une culture tridimensionnelle (3D) et des procédures de contour pour caractériser ces sphéroïdes pour la rétention des marqueurs SBNET par la coloration immunofluorescence et l'immunohistochimie.

En outre, nous démontrons comment ces sphéroïdes SBNET peuvent être utilisés pour tester l'effet de la rapamycine, un médicament anticancéreux pour lesNET8. La raison d'être de ce protocole est de développer une nouvelle méthode pour cultiver les cellules SBNET in vitro et de les utiliser pour le dépistage des drogues. L'avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d'établissement d'une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D des SBNETs peuvent être rapidement obtenues et que des tests de dépistage de drogues peuvent être effectués dans les 3 semaines. Les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés comme modèle pour effectuer des écrans de médicaments in vitro afin d'identifier de nouveaux médicaments pour les patients atteints de SBNET. Étant donné que les lignées cellulaires SBNET ne sont pas largement disponibles, les cultures 3D des sphéroïdes SBNET peuvent servir de nouveau modèle in vitro pour l'étude des SBNETs et peuvent être partagées entre les scientifiques dans le domaine.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les expériences utilisant des échantillons neuroendocrines humains de tumeur ont été approuvées par le comité d'hôpital et de cliniques d'université de l'Iowa (numéro de protocole 199911057). Une liste de tous les matériaux et équipements est décrite dans le Tableau des matériaux. Une liste des médias de croissance et des solutions clés se trouve dans le tableau 1.

1. La collecte de la tumeur neuroendocrine des petites entrailles (SBNET) et la dissociation cellulaire

  1. Obtenir des échantillons sOFET de patient réséqués après confirmation de tissus de tumeur du noyau chirurgical de pathologie.
  2. Couper les SBNET en cubes de 5 mm et les conserver dans 25 ml de milieu DMEM/F12 dans un tube conique pour le transport jusqu'au laboratoire.
  3. Transférer les tumeurs dans DMEM contenant 1% FBS, 1% pénicilline/streptomycine (Pen/Strep), 1% glutamine (Wash Medium) et incuber dans ce moyen de lavage pendant 15 min.
  4. Transférer les tumeurs dans un nouveau plat et hacher les tumeurs à moins de 1 mm à l'aide de ciseaux incurvés stériles.
  5. Transférer les tissus hachés dans un nouveau tube de 50 ml contenant 25 ml de lave-vaisselle.
  6. Centrifuger l'échantillon à 500 x g pendant 15 min à 4 oC.
  7. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 10 ml de lave-vaisselle contenant de la collagène (100 U/mL) et du DNase (0,1 mg/ml).
  8. Permettre à la digestion des tumeurs hachées de se produire dans un incubateur de 37 oC avec des secousses lentes (50 tr/min) pendant 1,5 h.

2. Culture des SBNETs comme sphéroïdes de tumeur dans L'ECM

  1. Une fois la digestion terminée (étape 1,8), centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 15 ml de lavave moyenne.
  2. Placer une passoire cellulaire de 70 m sur un nouveau tube de 50 ml et transférer 10 ml du milieu de lavage au-dessus de la passoire cellulaire. Faites tourbillonner le moyen de lavage pour couvrir le côté du tube en plastique pour empêcher les cellules NET de coller sur le côté du tube en plastique.
  3. Filtrer la suspension cellulaire par la passoire cellulaire.
  4. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant, suspendez la pastille dans 200 l de Lave-Feu (volume total est de 250 l) et placez-la sur la glace.
  5. Transférer 5 l l de cellules à 500 oL de facteur de lavage moyen (1/100 facteur de dilution). Utilisez les cellules diluées pour le comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre pour obtenir le nombre de cellules par millilitre. Multipliez par 100 pour corriger le facteur de dilution.
  6. Multipliez le nombre de cellules par mL obtenue à l'étape 2.5 par le volume total de cellules en suspension obtenue à l'étape 2.4 (250 l).
  7. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez les cellules en ECM liquide (1 x 106 cellules/mL) et conservez-les sur la glace.
  8. Transférer 5 à 20 l de sphéroïdes SBNET dans l'ECM dans une plaque de 96 puits et permettre à l'ECM liquide de se solidifier en plaçant la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 5 min.
  9. Ajouter 200 l de milieu de culture SBNET (DMEM/F12 - 10% FBS - 1% PEN/STREP - 1% glutamine - 10 mM de nicotinamide et 10 'g/mL d'insuline) à chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les sphéroïdes SBNET en ECM.
  10. Alternativement, la culture sBNET organoïdes dans les médias de cellules souches semblables à ce qui a été précédemment décrit pour la croissance du foie humain ou des organoïdes pancréatiques9 et énumérés dans le tableau des matériaux.
  11. Changez de média tous les 5-7 jours.

3. Quantification de la taille sphéroïde SBNET à l'aide d'ImageJ

  1. Prenez 5-10 photos de sphéroïdes SBNET au jour 1, 4, 7, 14, 23 et 97 de la culture en utilisant un objectif 10x.
  2. Ouvrez les images enregistrées dans ImageJ. Passez à l'onglet Analyse, sélectionnez l'option Mesures de définir et vérifiez l'option Zone.
  3. Utilisez l'outil de sélection ovale de la barre d'outils pour générer un ellipsoïde ou un cercle autour d'un sphéroïde bien ciblé.
  4. Passez à l'onglet Analyse et sélectionnez l'option Mesure. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 afin d'obtenir la mesure de zone de 25-50 sphéroïdes SBNET. Les valeurs sont fournies en pixel carré.
  5. Convertissez la zone de pixels en 'm2 en divisant la taille de chaque pixel avec la longueur de chaque pixel en facteur de conversion 'm des images de microscopie.
    REMARQUE : Les cellules SBNET se développent principalement sous forme de sphéroïdes et parfois d'ellipsoïdes.

4. Caractérisation des sphéroïdes SBNETS par immunofluorescence

  1. Transférer les organoïdes cultivés en ECM dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
  2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  3. Laver la culture organoïde en ajoutant 1 ml de PBS, mélanger, centrifugeuse à 1500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  4. Fixer les organoïdes en ajoutant 500 L de 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 min.
  5. Laver la culture deux fois avec 1 ml de PBS.
  6. Perméabilisez la culture en ajoutant 500 L de PBS - 3% BSA - 0,1% Triton X 100 pour 5 min.
  7. Ensuite, laver trois fois avec 1 ml de PBS - 3% BSA.
  8. Incuber pendant 1 h avec des anticorps primaires contre la synaptophyse (SYP)10 à 1/600 dilution ou chromogranine A (CgA)11 et le récepteur de la somatostatine 2 (SSTR2)12 à 1/400 dilution dans la mémoire tampon d'anticorps (2,5% d'albumine de sérum bovin, 0,1% de sodium azide, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium).
    REMARQUE : Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
  9. Laver trois fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA.
  10. Incuber avec des anticorps secondaires couplés à FITC à 1/500 dilution dans le tampon d'anticorps pendant 1 h. Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
  11. Laver 3 fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA. Assurez-vous d'aspirer et de jeter tous les supernatants.
  12. Ajouter 5 ll de support de montage contenant la tache nucléaire DAPI.
  13. Utilisez une pipette P20 pour transférer 5 l des sphéroïdes SBNET de l'étape 4.12 à une lame de verre et sceller avec un bordereau de couverture.
  14. Prenez des images à l'aide d'un microscope fluorescent à l'aide des objectifs 10x, 20x ou 40x.

5. SBNET sphéroïdes caractérisation par immunohistochimie (IHC)

  1. Transférer les sphéroïdes SBNET de la plaque de culture à un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
  2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  3. Fixez les sphéroïdes SBNET en ajoutant 500 l de formaline de 10 % au tube à partir de l'étape 5.2 et incubez à température ambiante pendant 2-5 jours avant l'embedding de paraffine et coupez les sections sphéroïdes de 4 m d'épaisseur.
  4. Déparaffiniser, réhydrater et utiliser la récupération d'épitope induite par la chaleur dans la solution de récupération d'antigène au pH 9 en chauffant à 97 oC pendant 20 min à l'aide de la station automatisée de traitement des diapositives 3-en-1 pour préparer des diapositives pour l'incubation des anticorps.
  5. Bloquer les diapositives et incuber avec des anticorps primaires contre SYP10 à une dilution 1/100 pendant 15 min, CgA11 à une dilution 1/800 pendant 15 min, et SSTR212 à une dilution de 1/5 000 pour 30 min.
  6. Incuber avec le système secondaire de détection d'anticorps pendant 15 min pour la coloration anti-SYP et CgA et 30 min pour la coloration anti-SSTR2. Prenez des photos à l'aide d'un objectif 400x.

6. Traitement des organoïdes SBNET avec de la rapamycine

  1. Dissoudre la rapamycine dans DMSO pour obtenir une solution de stock de 10 mM.
  2. Préparer le milieu de culture SBNET avec DMSO (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET et 1 euro de DMSO) et le milieu de culture SBNET avec 10 M de rapamycine (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET - 1 l de 10 mM de solution de rapamycine).
  3. Transférer 200 médias L avec le milieu de culture SBNET avec DMSO ou 10 M rapamycine aux cultures sphéroïdes SBNET.
  4. Incuber les sphéroïdes SBNET pendant 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
  5. Ajouter 1 m d'éthidium homodimère et incuber pendant 30 min. Retirez le milieu contenant de l'homodimère d'éthidium, lavez-le avec 200 L de PBS et transférez 200 L de PBS à chaque puits.
  6. Prenez des images de microscopie de sphéroïdes SBNET avec et sans traitement médicamenteux à l'aide du cube de filtre rouge avec les objectifs 10x, 20x ou 40x d'un microscope fluorescent.
    REMARQUE : Les cellules mortes tachées d'ethidium homodimer apparaissent en rouge à l'aide du cube de filtre rouge G d'un microscope disponible dans le commerce (Tableau des matériaux). Alternativement, le signal peut être capturé à l'aide d'un spectrophotomètre à 535 nm d'excitation et 624 nm d'émission.

7. Fractionnement des sphéroïdes SBNET

REMARQUE : Ceci est fait pour l'expansion et pour le partage avec d'autres chercheurs.

  1. Utilisez une pipette P1000 pour briser mécaniquement l'ECM et aspirer l'ECM avec des sphéroïdes SBNET à un tube stérile de 1,5 ml.
  2. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 oC, retirez tout le supernatant et placez le tube sur la glace.
  3. Ajouter 2-4x le volume de nouveau ECM à la pastille. Mélangez le nouvel ECM avec les anciens sphéroïdes ECM et SBNET en faisant monter et descendre 10 fois. Éviter d'introduire des bulles d'air.
  4. Transférer 5 à 20 L du mélange de sphéroïdes ECM et SBNET dans une nouvelle assiette et permettre à l'ECM de se solidifier.
  5. Couvrir avec le nouveau support SBNET et le transférer à l'incubateur. Le taux de récupération est d'environ 95 à 100%.
  6. Pour l'expédition des sphéroïdes SBNET dans un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes SBNET avec un nouveau ECM dans un flacon T25 et permettez à ECM de se solidifier.
  7. Remplissez le flacon T25 avec le milieu sphéroïde SBNET, vissez fermement le bouchon et préparez le paquet d'expédition.
  8. En recevant une culture sphéroïde SBNET, retirez le milieu de culture et effectuez l'étape 7.1 à 7.5 pour remettre les sphéroïdes SBNET dans la culture.

8. Cryostorage et récupération des sphéroïdes SBNET

  1. Transférer les sphéroïdes SBNET de 5 à 10 petits puits à un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, retirer le supernatant, le suspendre dans un milieu de congélation (90 % FBS et 10 % DMSO), le conserver dans un contenant de congélation cellulaire et le placer à -80 oC.
  2. Transférer dans l'azote liquide pour un stockage plus long.
  3. Pour récupérer les sphéroïdes SBNET, placez le flacon congelé sur la glace et attendez que le contenu soit complètement décongelé. Inverser le tube et le re-placer sur la glace afin d'accélérer le processus de décongélation.
  4. Une fois l'échantillon décongelé, placé à l'intérieur d'une centrifugeuse préréfrigérée et tourner à 1 000 x g pendant 10 min.
  5. Retirez le supernatant et suspendez les sphéroïdes dans ECM. Gardez le tube sur la glace, transférez 20 l dans une nouvelle plaque et attendez que l'ECM se solidifie.
  6. Transférer 200 l de milieu de culture SBNET avec 10 M d'inhibiteur ROCK (Y-27632)13 et transférer à l'incubateur.
  7. Permettre aux sphéroïdes SBNET de récupérer et de croître pendant 1 semaine. Retirez l'ancien milieu de culture, réapprovisionnez-vous avec 200 l de milieu de culture SBNET et retournez à l'incubateur.
  8. Permettre aux sphéroïdes SBNET de continuer à croître.
    REMARQUE: Il faut au moins 1 semaine pour les sphéroïdes à croissance rapide pour commencer à récupérer après cryoconservation13. Les sphéroïdes SBNET prennent au moins 2-4 semaines pour commencer à croître. De nombreuses cellules SBNET mourront dans les 2 premières semaines et le taux de survie est inférieur à 10%. Comme il s'agit d'un processus très long et à faible rendement, il est préférable de partager avec d'autres chercheurs SBNET sphéroïdes dans les flacons de culture (comme décrit à l'étape 7). Le cryostockage et la récupération ne doivent être utilisés qu'en tant que plan de sauvegarde en cas de contamination bactérienne.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Il n'y a actuellement que 2 lignées cellulaires SBNET établies et publiées2,3,4,5 et elles ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux chercheurs. Ici, nous proposons à la culture SBNET comme sphéroïdes dans eCM et l'utiliser comme un modèle alternatif pour étudier la sensibilité des médicaments SBNET. La tumeur patient-dérivée d'un SBNET qui a métastasé au foie a été rassemblée, digéré...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les cultures 3D tumorales sont devenues une ressource précieuse pour les tests précliniques15. Diverses biobanques organoïdes tumorales ont récemment été établies à partir du cancer du sein et des tumeurs du cancer de la prostate16,17. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé à la culture SBNET comme sphéroïdes et une méthode simple et rapide pour valider les cultures sphéroïdes pour les marqueurs NET par immunofluorescence...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH P50 CA174521 (à J.R. Howe et A.M. Bellizzi). P.H. Ear est récipiendaire du prix P50 CA174521 Du Programme d'amélioration de carrière.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-lapin FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Couple d’anticorps secondaires à un fluorophore vert
Solution de récupération d’antigèneAgilent DakoS2367Solution à pH 9 pour la préparation de lames pour IHC
Autostainer Link 48Agilent DakoNon disponibleSystème automatisé pour la coloration des anticorps
Conteneur de congélation de cellulesThermo Scientific5100-0001Récipient pour la congélation de cellules
CellSenceOlympusVersion 1.18Logiciel pour l’utilisation d’un microscope fluorescent
Anticorps contre la chromogranine AAbcam-45179RB-9003-POAnticorps contre
chromogranine A IF (clone LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Anticorps pour IHC
CollagenaseSigmaC0130Enzyme pour la digestion du tissu tumoral
DMEMGibco11965-092Milieu pour la préparation des tissus
DMEM/F12Gibco11320-033Milieu pour cultures d’organoïdes
DMSOSigmaD8418Solvant pour dissoudre le médicament
DNAseSigmaDN25Enzyme pour la digestion du tissu tumoral
Ethidium HomodimèreChemodexCDX-E0012-T1EColorant de liaison à l’ADN et à l’ARN
FBSGibco 16000044Réactif pour milieux de culture
Microscope à fluorescenceOlympusCKX35Microscope pour la prise de photos de sphéroïdes SBENT
GlutamineGibcoA2916801Réactif pour milieux de culture
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.51Logiciel pour l’image analyse
InsulineSigmaI0516Réactif pour milieux de culture
MatrigelCorning356235Matrice pour enrober et ancrer les organoïdes
Milieu de montage (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Fixateur pour cellules marquées avec coloration nucléaire
NicotinamideSigma72340Réactif pour milieux
de cultureParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710Réactif pour fixer les cellules
PEN/STREPGibco15140-122Réactif pour milieux de culture
PT Link AgilentDakoNon disponibleSystème automatisé pour préparer les lames pour la coloration IHC
RapamycineAlfa AesarJ62473Médicament capable d’inhiber la croissance des TNE
Anticorps secondaires pour IHCAgilent DakoK8000Anticorps secondaires pour IHC utilisant le système EnVision FLEX à base de polymère
Anticorps SSTR2GeneScritpA01591Anticorps pour IF
SSTR2 (clone UMB1)Abcamab134152Anticorps pour IHC
Anticorps synaptophysineAbcam32127Anticorps pour IF
Synaptophysin (clone DAK-SYNAP)Agilent DakoAnticorps M7315pour IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGERéactif pour perméabiliser les cellules
Y-2763 Inhibiteur de ROCKAdipogenAG-CR1-3564-M005Pour améliorer la viabilité des sphéroïdes SBNET après congélation et décongélation
la

Références

  1. Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
  2. Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
  3. Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
  4. Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
  5. Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
  6. Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
  7. Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
  8. Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
  9. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
  10. Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
  11. Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
  12. Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
  13. Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66(2019).
  14. Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
  15. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
  16. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
  17. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404(2018).
  18. Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Sph ro des SBNETprotocole de culture 3Dmatrice extracellulairemicroscopie par immunofluorescenceisolement cellulairedigestion tissulairecytotoxicit de la rapamycinemarqueur de la synaptophysinechromogranine A

Articles connexes