Un système de suivi de la dynamique du comportement de préférence sociale chez les petits rongeurs

Summary

Décrit ici est un nouveau système expérimental automatisé qui offre une alternative au test à trois chambres et résout également plusieurs mises en garde. Ce système fournit de multiples paramètres comportementaux qui permettent une analyse rigoureuse de la dynamique comportementale des petits rongeurs lors des tests de préférence sociale et de préférence de nouveauté sociale.

Abstract

L'exploration des mécanismes neurobiologiques du comportement social nécessite des tests comportementaux qui peuvent être appliqués à des modèles animaux d'une manière impartiale et indépendante des observateurs. Depuis le début du millénaire, le test à trois chambres a été largement utilisé comme paradigme standard pour évaluer la sociabilité (préférence sociale) et la préférence de nouveauté sociale chez les petits rongeurs. Cependant, ce test souffre de multiples limitations, y compris sa dépendance à la navigation spatiale et la négligence de la dynamique comportementale. Présenté et validé ici est un nouveau système expérimental qui offre une alternative à l'essai à trois chambres, tout en résolvant certaines de ses mises en garde. Le système nécessite un appareil expérimental simple et abordable et un système d'analyse open source accessible au public, qui mesure et analyse automatiquement plusieurs paramètres comportementaux aux niveaux individuel et de la population. Il permet une analyse détaillée de la dynamique comportementale des petits rongeurs lors de tout test de discrimination sociale. Nous démontrons l'efficacité du système en analysant la dynamique du comportement social pendant les tests de préférence sociale et de préférence de nouveauté sociale tels qu'exécutés par les souris et les rats mâles adultes. En outre, nous validons la capacité du système à révéler la dynamique modifiée du comportement social chez les rongeurs suite à des manipulations telles que la coupe des moustaches. Ainsi, le système permet une étude rigoureuse du comportement social et de la dynamique dans les petits modèles de rongeurs et soutient des comparaisons plus précises entre les souches, les conditions et les traitements.

Introduction

Révéler les mécanismes biologiques sous-jacents aux troubles neurodéveloppementaux (NDD) est l'un des principaux défis dans le domaine des neurosciences¹. Pour relever ce défi, il faut des paradigmes comportementaux et des systèmes expérimentaux qui caractérisent le comportement des rongeurs d'une manière standard et impartiale. Une étude influente publiée il y a plus de dix ans par Moy et ses collègues² a présenté le test à trois chambres. Depuis lors, ce test a été largement utilisé pour étudier le comportement social dans les modèles de rongeurs de NDDs. Ce test évalue deux tendances innées des rongeurs : 1) rester à proximité d'un stimulus social sur un objet (sociabilité, également appelé préférence sociale [SP]), et 2) préférer la proximité d'un nouveau stimulus social à un stimulus social familier (préférence de nouveauté sociale [SNP])^3,4. Plusieurs études ultérieures ont suggéré des méthodes d'analyse automatisée du test à trois chambres à l'aide de méthodes informatisées^5,6.

Ce test souffre encore de plusieurs mises en garde. Tout d'abord, il examine principalement la préférence de lieu social plutôt que la motivation du sujet à interagir directement avec un stimulus social, bien que certains groupes mesurent également le temps d'investigation olfactive (sniffing), manuellement⁷ ou utilisant des systèmes informatisés commerciaux^8,9,10. Deuxièmement, le critère à trois chambres est principalement utilisé pour mesurer le temps total passé par le sujet dans chaque chambre, et il néglige la dynamique comportementale. Enfin, il ne repose que sur un seul aspect du comportement social, qui est le temps passé par le sujet dans chaque chambre (ou le temps de reniflement, si mesuré).

Nous présentons ici un système expérimental novateur et abordable qui est une alternative à l'appareil à trois chambres. Il permet également la performance des mêmes tests comportementaux tout en résolvant les mises en garde mentionnées ci-dessus. Le système comportemental présenté mesure automatiquement et directement le comportement d'enquête d'un rongeur vers deux stimuli. En outre, il analyse la dynamique comportementale d'une manière indépendante de l'observateur. En outre, ce système mesure plusieurs paramètres comportementaux et les analyse à la fois au niveau individuel et au niveau de la population; ainsi, il soutient une analyse rigoureuse du comportement social et de sa dynamique lors de chaque test. En outre, le repositionnement aléatoire des chambres dans les coins opposés de l'arène au cours des différentes étapes d'essai neutralise tous les effets de la mémoire ou de la préférence spatiale. Ce système peut également être utilisé pour d'autres tests de discrimination, tels que la discrimination sexuelle. L'appareil personnalisé est facile à produire, et le système d'analyse est accessible au public en tant que code open-source, permettant ainsi son utilisation dans n'importe quel laboratoire. Nous démontrons la capacité de ce système à mesurer de multiples paramètres de comportement social dans les souches de rongeurs avec des couleurs de fourrure distinctes au cours des tests de préférence sociale et de préférence de nouveauté sociale. Nous validons également la capacité du système à révéler la dynamique modifiée du comportement social chez les rongeurs suite à des manipulations, telles que la coupe des moustaches.

Logiciel TrackRodent : trois algorithmes ont été écrits en MATLAB (2014a-2019a) pour suivre le sujet expérimental et ses interactions avec les stimuli. Tous les algorithmes ont été déposés dans GitHub, trouvé à l'article https://github.com/shainetser/TrackRodent.gt;. L'objectif principal des quatre algorithmes est de suivre les contours du corps du sujet pour détecter tout contact direct avec les zones de stimuli.

Algorithme basé sur le corps : cet algorithme a trois versions qui suivent les contours d'une souris foncée non câblée sur un fond blanc (BlackMouseBodyBased), une souris blanche sur un fond sombre (WhiteMouseBodyBased), ou un rat blanc sur un fond sombre (WhiteRatBodyBased ). L'interface utilisateur graphique (GUI) du logiciel exige que l'expérimentateur choisisse une expérience en utilisant des souris ou des rats et sélectionne ensuite le code correct. Pour chaque version de l'algorithme, il existe deux codes optionnels : l'un qui présente le processus de suivi à l'écran pendant qu'il effectue l'analyse, et l'autre qui ne fonctionne pas (d'où, il s'exécute plus rapidement et est appelé «rapide»). Par exemple, les noms des codes pertinents pour l'algorithme BlackMouseBodyBased sont : « BlackMouseBodyBased23_7_14 » et « BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast ». Tous les algorithmes se terminant par "rapide" ne montrent pas le suivi en ligne, et les utilisateurs doivent enregistrer directement les données dans le fichier des résultats (fichier.mat). Tous les algorithmes basés sur le corps nécessitent la définition d'un seuil unique (« seuil bas » dans l'interface graphique du logiciel) pour détecter le corps du sujet.

Algorithme basé sur la direction de la tête : le deuxième algorithme, qui n'est disponible que pour les souris noires, est basé sur l'algorithme basé sur le corps, en plus de déterminer la directionnalité de la tête. Cet algorithme détecte les interactions de la tête du sujet avec les zones de "stimuli", évitant ainsi les faux positifs qui peuvent résulter de contacts aléatoires du sujet avec ces zones. Pour cet algorithme, deux seuils de détection des contours du corps de la souris sont définis : seuil élevé, qui comprend la queue plus brillante des souris noires, et seuil bas, qui inclut le corps sans queue. Par la suite, l'algorithme s'adapte à un ellipsoïde aux limites détectées en utilisant le seuil inférieur et définit l'emplacement de la tête et de la queue de la souris (sans distinction entre les deux). La discrimination finale entre la queue et la tête est basée sur les limites définies par le seuil plus élevé.

Algorithme animal filaire : le troisième algorithme vise à minimiser les artefacts résultant de câbles (c.-à-d. fils électriques ou fibres optiques) connectés à l'animal, permettant d'analyser le comportement de l'animal lorsqu'il est connecté à un câble. Cet algorithme a des codes uniquement pour les souris noires et les rats blancs. Le code pour les rats exige que l'expérimentateur définisse à la fois des seuils bas et élevés, tandis que le code de souris ne nécessite qu'un seuil bas.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Haïfa.

1. Mise en place expérimentale

1. Arène
   1. Construire l'arène expérimentale pour les souris (Figure 1A,D) en plaçant une boîte en plexiglas blanche ou noire (selon la couleur de l'animal) (37 cm x 22 cm x 35 cm) au milieu d'une chambre acoustique (60 cm x 65 cm x 80 cm, faite de 2 cm d'épaisseur de bois recouvert à l'intérieur avec 2 cm d'épaisseur de mousse). Pour la lumière, retirez une bande (2 cm de large, 10 cm sous le plafond de la chambre) de la mousse autour de la chambre acoustique (en plus de la porte), et attachez une bande LED avec des ampoules rouges ou blanches. Assurez-vous que la lumière est aussi uniforme que possible autour de l'arène pour éviter les réflexions.
   2. Construire l'arène pour les rats de façon similaire à celle décrite ci-dessus pour les souris, avec des dimensions différentes qui correspondent convenablement à la taille des rats Sprague-Dawley (SD) (Figure 1G). Placer une boîte en plexiglas noir (50 cm x 50 cm x 40 cm) au milieu d'une chambre acoustique (90 cm x 60 cm x 85 cm, faite de bois de 2 cm d'épaisseur recouvert à l'intérieur d'une mousse de 2 cm d'épaisseur).
2. Chambres
   1. Pour les souris, créez deux chambres triangulaires noires ou blanches (selon la couleur de la fourrure) (12 cm isosceles, 35 cm de hauteur, avec les planchers fermés) à partir de 6 mm d'épaisseur en plexiglas. Localisez-les dans deux coins opposés choisis au hasard de l'arène (Figure 1B,E). Coller un treillis métallique (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm trous) dans la partie inférieure de chaque chambre à l'aide de colle époxy pour permettre des interactions directes avec le stimulus à travers le maillage (Figure 1C,F). Marquer chaque chambre d'une manière qui permet la discrimination des autres dans une vidéo sans donner d'indices aux sujets (voir la figure 1B,E par exemple).
      REMARQUE: Chaque chambre contiendra éventuellement un stimulus social (souris) ou un objet (jouet en plastique, 5 cm x 5 cm x 5 cm, avec une forme et une couleur distinctes; Figure 1C,I insets). Laissez l'odeur de colle époxy s'évaporer pendant au moins une semaine avant l'utilisation.
   2. Pour les rats, créer deux chambres triangulaires noires (20,5 cm d'isocèle, 40 cm de hauteur, en plexiglas de 6 mm d'épaisseur, avec les planchers fermés) et les placer dans deux coins opposés choisis au hasard de l'arène (figure 1H), chacune avec un maillage métallique (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm trous) couvrant sa partie inférieure (Figure 1I).
3. Placez une caméra monochrome de haute qualité, équipée d'une lentille grand angle, au sommet de la chambre acoustique et connectez-la à un ordinateur pour permettre une visualisation et un enregistrement clairs du comportement du sujet à l'aide d'un logiciel commercial (voir Tableau des matériaux pour les suggestions).

2. Paradigme comportemental

REMARQUE: Les étapes 2.1-2.7 décrivent le paradigme comportemental pour les souris. Voir la section 2.8 pour des instructions spécifiques impliquant des rats.

1. Assurez-vous que les cages de tous les animaux (sujets : souris mâles de 2-4 mois; stimuli : souris juvéniles de 21-30 jours) restent dans la salle expérimentale pendant au moins 1 h avant de commencer l'expérience comportementale.
2. Après la période d'acclimatation, insérez deux chambres vides dans l'arène au hasard à deux coins opposés. Placez le sujet au milieu de l'arène pour 15 min d'accoutuignance. Pendant ce temps, placez les deux stimuli sociaux, chacun dans une chambre différente située hors de l'arène pour l'accouturation. Placer un objet (un jouet en plastique, 5 cm x 5 cm x 5 cm, avec une forme et une couleur distinctes) dans une autre chambre.
3. Pour effectuer le test de préférence sociale (SP), commencez l'enregistrement vidéo et continuez l'enregistrement jusqu'à la fin du test.
4. Retirez les deux chambres vides et insérez immédiatement l'objet et l'un des stimuli sociaux, chacun dans une chambre distincte. Localisez ces chambres au hasard dans les coins opposés de l'arène qui étaient vides pendant l'accouturation. Permettre au sujet d'interagir avec les stimuli pour les 5 min du test SP. À la fin du test, arrêtez d'enregistrer.
5. Après le test SP, retirez les chambres contenant des stimuli de l'arène et laissez le sujet dans l'arène vide pendant 15 min. Nettoyez les chambres de l'extérieur avec des lingettes à l'éthanol de 10 %.
6. Pour effectuer le test de préférence de nouveauté sociale (SNP), commencer l'enregistrement vidéo et insérer deux chambres dans l'arène: l'une contenant le même stimulus social utilisé pour le test SP (stimulus familier), et l'autre contenant le stimulus social roman. Placez ces chambres au hasard dans deux coins opposés de l'aréna, en vous assurant que ces emplacements n'étaient pas utilisés pour le test SP. Permettre au sujet d'interagir avec les stimuli pour les 5 min du test SNP.
7. À la fin du test SNP, arrêtez l'enregistrement vidéo, retirez le sujet et les chambres de l'arène, et placez le sujet dans sa cage d'origine. Laissez les stimuli dans les chambres pour la prochaine expérience (avec un autre sujet) ou retournez-les dans leurs cages d'origine. Nettoyer l'aréna et les chambres avec de l'eau courante suivie de 10% d'éthanol et laisser sécher.
8. Paradigme comportemental pour les rats
   1. Pour les rats, répétez le paradigme comportemental décrit dans les étapes 2.1-2.7, avec deux modifications: 1) manipuler les sujets de rat et d'habituer les stimuli sociaux aux chambres pendant 2 jours (10 min chaque jour) avant l'expérience; et 2) prolonger le test SP pendant 15 min pour donner aux rats une plus longue période d'exposition aux stimuli sociaux. Plus tard, limitez l'analyse du test SP à la première 5 min.
      REMARQUE: Au moins une arène et cinq chambres sont nécessaires pour organiser une seule session.

3. Utilisation de l'interface graphique TrackRodent pour l'analyse comportementale

REMARQUE: Voir le panneau supérieur de la figure 2A pour l'interface graphique TrackRodent.

1. Ouvrez MATLAB (testé avec 2014a-2019a) et choisissez le dossier TrackRodent.
2. Ajoutez tous les sous-dossiers au chemin de travail en cliquant à droite sur chaque dossier et en sélectionnant Ajouter au chemin. Dossiers et sous-dossiers sélectionnés.
3. Tapez TrackRodent dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrez.
4. Téléchargez un seul fichier ou plusieurs fichiers vidéo (format AVI ou MP4) en sélectionnant le fichier de session load (AVI).
5. Un inspecteur de film, permettant l'inspection du clip vidéo image par image, sera immédiatement ouvert pour le premier fichier de la liste (Figure 2A). Utilisez-le pour examiner le clip vidéo et définir les premières et dernières images du segment à analyser. Enregistrez le nombre de ces images, qui sera nécessaire plus tard. Fermez la fenêtre une fois terminée.
6. Pour inspecter des fichiers vidéo supplémentaires, ouvrez l'inspecteur vidéo à tout moment en appuyant sur le film Inspect et en sélectionnant un fichier vidéo spécifique.
7. Sélectionnez les espèces testées (souris ou rat; la souris est la valeur par défaut).
8. Exclure toutes les zones qui peuvent interrompre le suivi, en fonction des couleurs du sujet et de l'arène (noir ou blanc).
   1. Pour exclure une zone donnée, appuyez sur Exclur la zone, et après que le curseur change à une forme transversale, marquez tous les coins de la zone pour l'exclusion. Lorsque c'est fait, cliquez à droite sur la souris, puis doublez-cliquez à gauche sur le centre de la zone marquée. La zone exclue deviendra une nuance de rouge sur l'écran. Répétez cette procédure pour exclure autant de domaines que nécessaire.
9. Pour supprimer une zone de l'exclusion, appuyez sur Supprimer la zone exclue,puis (à l'aide du curseur croisé) cliquez sur la zone à retirer de l'exclusion.
10. Pour définir chaque chambre comme une zone de «stimulation», pour la détection automatique de son enquête par le sujet, choisissez la forme de la zone «stimulus» pour être soit polygone ou elliptique en cochant la case appropriée, puis en appuyant sur Stimulus X (où «X» représente 1, 2, ou 3). Marquez les zones de «stimulus» de la même manière que les zones exclues, qui deviendront alors de couleur jaune. Pour modifier l'emplacement d'une zone de «stimulus» spécifique, appuyez à nouveau sur Stimulus X et marquez le nouvel emplacement de la zone (cela mettra automatiquement à jour l'emplacement).
    REMARQUE: Choisissez le nombre de stimuli différents d'une manière cohérente pour tous les fichiers (c.-à-d. objet comme stimulus 1 pour tous les fichiers de test SP).
11. Pour suivre la présence du sujet dans un compartiment virtuel spécifique à l'intérieur de l'arène, choisissez la forme de la zone «compartiment» (polygone ou elliptique), puis appuyez sur Compartiment X (où "X" représente 1, 2, 3, 4, ou 5). Marquez les zones 'compartiment' de la même manière que les zones exclues ou de stimuli, qui deviendront alors de couleur bleue. Pour modifier l'emplacement d'une zone 'compartiment' spécifique, appuyez à nouveau sur Compartiment X et marquez le nouvel emplacement de la zone (cela mettra automatiquement à jour l'emplacement).
12. Choisissez l'algorithme souhaité (BlackMouseBodyBased a été utilisé pour la vidéo) à partir de la liste (voir les algorithmes disponibles dans la figure 2B).
13. Écrivez les nombres d'images de démarrage et de fin pour l'analyse dans les boîtes de modification correspondantes de l'interface graphique.
14. Choisissez un seuil pour détecter le corps sujet.
    REMARQUE: La plupart des algorithmes n'utilisent que le seuil « faible », tandis que les algorithmes basés sur la directionnalité de la tête utilisent également le seuil « élevé ». Pour le seuil « faible », choisissez un niveau qui inclut le corps de la souris/rat sans la queue (autant que possible), tandis que le seuil « élevé » devrait également inclure la queue. Dans le cas d'utiliser des algorithmes basés sur la directionnalité de la tête, le logiciel déterminera l'emplacement de la tête comme étant opposé à l'emplacement de la queue.
    REMARQUE: Le logiciel ignorera plus tard les petits objets détectés à l'aide du seuil choisi.
15. Pour évaluer la détection automatique des bordures du sujet pour un seuil donné, insérez une valeur au champ de seuil pertinent et appuyez sur Entrez sur le clavier.
16. Lorsque vous choisissez plusieurs fichiers, passez au fichier suivant (en utilisant le bouton Suivant en haut) et sélectionnez les définitions appropriées pour chaque fichier. Une fois terminé, vérifiez les paramètres et les emplacements de la zone pour tous les fichiers en se déplaçant entre chacun, en utilisant les boutons Précédent et Suivant en haut de l'interface graphique.
    REMARQUE: Les définitions de tous les domaines et paramètres sont spécifiques à un fichier donné.
17. Pour commencer l'analyse comportementale de tous les fichiers sélectionnés, passez au premier fichier et appuyez sur Démarrer.
18. À la fin de l'analyse, un fichier de résultats (fichier.mat) est enregistré pour chaque film dans le même répertoire des fichiers de film.
    REMARQUE: Si la version lente (non rapide) de l'algorithme est utilisée, il enregistrera également une version du film avec une croix blanche du centre de la masse corporelle, qui change sa couleur chaque image qui est détectée comme enquête, à moins que le bouton save analyse de basculement du film de l'interface graphique n'est pas coché. Cette version du film (enregistré dans le même répertoire, avec le même nom que le film original, avec le suffixe «film analysé») peut être utilisé hors ligne pour évaluer la qualité de la détection automatique effectuée par le système.

4. Utilisation de l'interface graphique TrackRodent pour la présentation des résultats

REMARQUE: Voir le panneau inférieur de la figure 2A pour la présentation des résultats.

1. Pour inspecter les résultats de chaque fichier de film, appuyez sur Fichier de résultats de charge et choisissez les fichiers .mat générés par l'analyse comportementale.
2. Déplacez-vous entre les boutons de bascule pour examiner à l'écran l'une des analyses suivantes : Trace de localisation de la souris (figure 2A); Occupation des compartiments le long de la session (si les «compartiments» ont été définis, non indiqués); Exploration de stimuli le long de la session (Figure 2C); Temps total dans les compartiments (si les «compartiments» ont été définis, non indiqués); et Total stimuli temps d'exploration (Figure 2D).
   REMARQUE: Les zones de 'Stimulus' sont des domaines dans lesquels le logiciel évalue l'interaction du sujet, tandis que les zones 'Compartment' sont des domaines dans lesquels le logiciel suit la présence du sujet. L'arrêt de l'analyse à l'aide du bouton d'analyse Stop enregistrera automatiquement les résultats générés jusqu'à la dernière image analysée. Pour la plupart des ordinateurs, il devrait être possible de télécharger et d'analyser jusqu'à 20 films à la fois (selon les performances de l'ordinateur).

5. Utilisation de l'interface graphique TrackRodentPopulationSummary pour l'analyse de la population (Figure 2E)

1. Ouvrez MATLAB (testé avec 2014a-2019a) et choisissez le dossier TrackRodent.
2. Type TrackRodentPopulationRésumé dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrez.
3. Téléchargez plusieurs fichiers de résultats TrackRodent (format.mat) en appuyant sur Les fichiers de résultats Choisissez.
4. Remplissez les numéros de Last frame for analysis, Nom du test, Nom Stimulus 1, et Stimulus 2 nom.
5. Choisissez les analyses souhaitées à partir de la liste des analyses facultatives en cochant toutes les cases appropriées.
6. Choisissez les résultats d'exportation sur une feuille de calcul en cochant la case appropriée pour extraire tous les résultats des analyses cochées sous la forme d'un seul fichier de feuille de calcul.
7. Appuyez sur Démarrer et attendre jusqu'à ce que l'analyse complète.
   REMARQUE: Ceci conclut l'analyse. Le logiciel peut être utilisé pour analyser les résultats d'autant de fichiers de films que désiré, étant donné qu'ils ont tous été analysés de façon comportementale à l'aide du logiciel TrackRodent. L'analyse effectuée par le logiciel suppose l'enregistrement vidéo à un taux d'image de 30 Hz. Dans le cas où un taux d'image différent a été utilisé, multipliez le temps par 30 et divisez par le taux d'image utilisé pour l'enregistrer pour le convertir en valeur correcte (s).

Results

Utilisation du système pour le test de préférence sociale chez les souris C57BL/6J
La figure 1 montre trois versions de la configuration expérimentale. La première version (Figure 1A-C) est conçue pour les souris aux couleurs de fourrure foncées, telles que les souris C57BL/6J. La seconde (Figure 1D-F) est prévue pour les souris aux couleurs vives...

Discussion

Le système expérimental décrit ici, qui a été conçu comme une alternative à l'appareil à trois chambres^2,5, permet l'exécution des mêmes tests tout en résolvant certaines de ses limites. L'utilisation de chambres triangulaires, qui sont situées dans deux coins opposés de l'arène rectangulaire limite la zone d'interaction sujet-stimulus à un plan bien défini, permettant ainsi une analyse automatisée précise du comportement d'enquête. Un avantage est l'utilisation ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (anciennement PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Caméra monochromatique
FlyCap 2.0	FLIR (anciennement PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Logiciel d’enregistrement vidéo
Home 5 minute Colle époxy	Devocon	20845	Pour coller le treillis métallique sur les chambres de stimuli en plexiglas
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Environnement de programmation
Panneaux en plexiglas (6 mm d’épaisseurNoir ou blanc)	Melina (1990) LTD, Israël	NaN	Pour la construction d’arènes et de chambres de stimuli
Bandes de led rouges (60 leds par mètre) connectées à une alimentation 12 V	2012topdeal fournisseur eBay	NaN	Pour l’éclairage de la chambre acoustique