Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Résumé

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Résumé

Les modifications post-traductionnelles dépendantes de l'ubiquitine (ubl) des protéines jouent des rôles biologiques fondamentaux de régulation au sein de la cellule en contrôlant la stabilité des protéines, l'activité, les interactions et la localisation intracellulaire. Ils permettent à la cellule de répondre aux signaux et de s'adapter aux changements de son environnement. Les modifications au sein de ces mécanismes peuvent conduire à des situations pathologiques graves telles que les maladies neurodégénératives et les cancers. Le but de la technique décrite ici est d'établir des profils de PTMdépendants dépendants d'ub/ubls, rapidement et exactement, des lignées cellulaires cultivées. La comparaison de différents profils obtenus à partir de différentes conditions permet d'identifier des altérations spécifiques, telles que celles induites par un traitement par exemple. La transduction des cellules médiées lentivirales est effectuée pour créer des lignées cellulaires stables exprimant une version à deux étiquettes (6His et Drapeau) du modificateur (ubiquitine ou ubl comme SUMO1 ou Nedd8). Ces étiquettes permettent la purification de l'ubiquitine et donc des protéines ubiquitinated des cellules. Cela se fait par un processus de purification en deux étapes: Le premier est effectué dans des conditions dénaturantes en utilisant l'étiquette 6His, et le second dans des conditions natives en utilisant l'étiquette drapeau. Cela conduit à un isolement très spécifique et pur des protéines modifiées qui sont ensuite identifiées et semi-quantifiées par chromatographie liquide suivie par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) technologie. L'analyse informatique facile des données De SP à l'aide du logiciel Excel permet l'établissement de profils PTM en éliminant les signaux d'arrière-plan. Ces profils sont comparés entre chaque condition afin d'identifier des altérations spécifiques qui seront ensuite étudiées plus spécifiquement, à commencer par leur validation par des techniques de biochimie standard.

Introduction

La méthode proposée ici est dédiée à l'étude des PTM médiées par les membres de la famille de l'ubiquitine à partir de cellules de mammifères cultivées afin d'identifier les altérations potentielles associées à une condition spécifique (traitement, différenciation, etc.). Les PTM représentent la dernière étape de la régulation des fonctions des protéines¹. En effet, une fois produites par la machinerie translationnelle, la plupart sinon toutes les protéines subissent différents types de PTM qui modulent leur activité, interactions moléculaires, et emplacement intracellulaire¹. Parmi la pléthore de PTM sont ceux médiés pa....

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant 6His-Flag-Ubl

REMARQUE : Co-transfection des cellules HEK-293T avec pCCL-6HF-Ubl, pVSVG et delta-Helper.

1. Jour 0 : Seed 293T cells in a 6-well plate to obtain 50-70% confluence the day after.
2. Jour 1 : Co-transfect 50-70% cellules confluentes avec un mélange de 1 g de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 g de pVSVG et 1 g de vecteurs delta-Helper, à l'aide d'un réactif de transfection et d'un protocole pour la production de lentivirus. Après 6 h de transfection, changer le milieu pour un milieu frais correspondant aux cellules à transduire. Ensemencez les cellules à transduire ....

Résultats

Transduction des cellules mammifères de culture pour créer des cellules exprimant gFP et 6HF-Ub
Pour produire des lentivirus qui seront utilisés plus tard pour transduire les cellules MiaPaCa-2, 70 % des cellules HEK-293T confluentes sont cotranscérées avec une quantité égale des trois vecteurs, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Après 24 h de production, le milieu contenant des particules lentivirales est récupéré et filtré. Il est possible à ce stade de co.......

Discussion

Nous avons développé une méthodologie robuste et fiable pour générer des profils de protéines modifiées par les principaux membres de la famille de l'ubiquitine. En effet, nous avons appliqué avec succès ce protocole pour générer des profils de PTM par ubiquitine, mais aussi par SUMO et Nedd8, et pour détecter les altérations associées à un traitement⁷, en réponse à la surexpression ou à l'élimination d'un certain gène (données non montré) et dans les cellules qui ont acquis un phénotype résistant.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	se lie à toutes les protéines marquées
Flag Anticorps anti-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165	pour détecter l’expression de 6His-Flag de ub/ubl
Cell strainer 40 µ ; m	Falcon	352350	pour éliminer les pastilles flottantes des cellules lysées de guanidine
Peptide Flag Peptide	Sigma-Aldrich	F3290	Protéines marquées à partir de billes anti-drapeau
Chlorhydrate de guanidine	Sigma-Aldrich	50933	Agent chaotrope utilisé pour dénaturer toutes les protéines du lysat
cellulaire Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	élue les protéines de liaison 6His des billes de Ni-NTA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	pour transfecter les cellules HEK-293T pour produire des lentivirus
Tubes Lobind	Sigma-Aldrich	Z666491	évite l’absorption de matière précieuse
Filtre à membrane, 0,45 & micro ; m	Millipore	HAWP04700F1	pour filtrer le lentiviral surnantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification de l’étiquette 6His