Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.
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Article de méthode
Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables
Dans cet article
Résumé
Résumé
La signalisation paracrine dérivée de tumeur est un composant négligé de l'immunosuppression locale et peut mener à un environnement permissif pour la croissance continue de cancer et la métatasie. Les signaux paracrines peuvent impliquer le contact cellule-cellule entre différents types de cellules, tels que PD-L1 exprimé sur la surface des tumeurs interagissant directement avec PD-1 sur la surface des cellules T, ou la sécrétion de ligands par une cellule tumorale pour affecter une cellule immunitaire. Ici nous décrivons une méthode de co-culture pour interroger les effets des ligands tumeur-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires (macrophage). Cette procédure simple utilise des supports perméables de la membrane de polycarbonate de 0,4 m disponible dans le commerce et des plaques de culture tissulaires standard. Dans le processus décrit, les macrophages sont cultivés dans la chambre supérieure et les cellules tumorales dans la chambre inférieure. La présence de la barrière de 0,4 m permet d'étudier la signalisation intercellulaire sans la variable confondante de contact physique, car les deux types de cellules partagent le même milieu et l'exposition aux ligands paracènes. Cette approche peut être combinée à d'autres, comme les altérations génétiques du macrophage (p. ex., l'isolement des souris génétiques knock-out) ou la tumeur (p. ex., les altérations négociées par CRISPR) pour étudier le rôle de facteurs et de récepteurs sécrétés spécifiques. L'approche se prête également à des analyses biologiques moléculaires standard telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase de transcription inversée (qRT-PCR) ou l'analyse occidentale de tache, sans la nécessité de trier le flux pour séparer les deux populations cellulaires. Les essais immunosorbent enzymatiques (ELISA) peuvent également être utilisés pour mesurer les ligands sécrétés afin de mieux comprendre l'interaction dynamique de la signalisation cellulaire dans le contexte du type de cellules multiples. La durée de la co-culture peut également être modifiée pour l'étude des événements temporels. Cette méthode de co-culture est un outil robuste qui facilite l'étude des signaux sécrétés par la tumeur dans le contexte immunitaire.
Introduction
Des études récentes ont porté sur la capacité des cellules cancéreuses à éviter la détection par les cellules immunitaires, à supprimer l'activation immunitaire locale ou à produire un milieu tolérogène de tumeur-permissive dans le microenvironnement de tumeur. Deux grandes classes d'interactions de tumeur et de cellules immunitaires ont été décrites qui facilitent ces effets : interactions contact-négociées ou ligands tumeur-scrétés. L'un des mécanismes les plus bien étudiés et cliniquement traitables de l'inhibition immunitaire par contact-négociée utilisée par les tumeurs est l'expression de PD-L1, qui interagit avec PD-1 sur les lymphocytes T pour inhiber leur activation et leur fonction1,2. En réponse à l'interféron-gamma (IFN), qui est exprimé par un certain nombre de cellules immunitaires activées, les cellules tumorales peuvent augmenter l'expression de PD-L1 pour induire l'épuisement des lymphocytes T activés PD-1-exprimant, les empêchant ainsi d'éradiquer efficacement les cellules tumorales3. L'utilisation d'anticorps pour bloquer l'interaction entre PD-L1 et PD-1 est actuellement utilisée pour traiter plusieurs types de cancer chez l'homme4. À la lumière de ce succès clinique et d'autres, l'identification et le ciblage des mécanismes immunosuppresseurs tumeur-dérivés a reçu l'attention croissante.
Au-delà de la suppression de l'immunité adaptative, les tumeurs sont également connues pour sécrétiser des facteurs qui suppriment les réponses pro-inflammatoires des cellules immunitaires innées. Les sécrétions tumorales ou induites par la tumeur, y compris IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, et le facteur stimulant de colonie (CSF-1), ont été montrées pour inhiber des réponses antitumorales des cellules de tueur naturel (NK), des granulocytes, et des cellules dendritiques dans le microenvironnement de tumeur5,6,7. Les cellules tumorales peuvent également sécréte des facteurs qui faussent le recrutement et la différenciation des cellules dérivées du myéloïde dans le microenvironnement tumoral pour favoriser la suppression de l'activation des lymphocytes T8,9.
Un type de cellule immunitaire innée qui a un effet profond sur la progression tumorale est le macrophage. Pendant de nombreuses années, la présence de macrophages tumeur-associés (TAMs) a été employé comme pronostic négatif de la surviepatiente 10. Le concept que les TAM immunosuppresseurs amortissent le dégagement immuno-négocié des tumeurs de cellules a été présenté il y a plus de 40 ans11. Plus récemment, il a été démontré que la réponse macrophage pro-inflammatoire peut être régulée tandis qu'un phénotype pro-tumoral peut être induit dans le microenvironnement tumoral. Ces macrophages immunosuppresseurs peuvent contribuer à une réponse tolérogène, conduisant la progression de tumeur et la résistance à la chimio- et à l'immunothérapie12. Étant donné que les macrophages sont souvent l'un des leucocytes les plus abondants avec la tumeur, la restauration de leur activité immunitaire tumeur-spécifique représente une cible potentielle pour les thérapies anticancéreuses13.
Tandis que les interactions contact-négociées entre les cellules de tumeur et les macrophages peuvent être modélisées par la coculture directe, l'utilisation des supports perméables de membrane peut élucider quels facteurs tumeur-sécrétés sont immunomodulatifs sans l'influence potentiellement confondante du contact tumeur-cellule-cellule immun. En utilisant des méthodes quelque peu similaires, d'autres ont démontré le potentiel d'identifier les facteurs sécrétés dans les microglies / interactions neuronales14 ainsi que les cellules tumorales avec des cellules méthéliales15. Nous avons également utilisé avec succès cette technique de co-culture pour caractériser le rôle d'une protéine tumeur-sécrétée, Pros1, comme un suppresseur de l'expression pro-inflammatoire de gène après la stimulation des macrophages péritonéaux avec LPS et interféron-gamma16. Ici nous décrivons une méthodologie simple qui peut être employée pour interroger comment les facteurs tumeur-sécrétés peuvent affecter l'activation de macrophage.
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Protocole
Toutes les procédures liées à la récolte et à l'utilisation de macrophages péritonés murine ont été menées à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'UNC.
1. Culture Macrophage
REMARQUE : Cette procédure peut utiliser des macrophages péritonéaux primaires (décrits en détail ci-dessous), des macrophages dérivés de la moelle osseuse ou des lignées cellulaires macrophages comme J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).
- Les macrophages péritonéaux de récolte tels que décrits précédemment16,17 et la plaque directement dans la chambre supérieure (s) d'un 0.4 'm polyester membrane insert co-culture 6 plaque de puits (Figure 1A).
REMARQUE : Le rendement approximatif des macrophages de chaque isolement est de 1 x 106 cellules au total, de sorte que le nombre moyen de cellules par puits est de 1,5 à 1,6 x 105 cellules dans une plaque de 6 puits. - Culture des macrophages récoltés dans le facteur stimulant de la colonie d'aigles modifiés (DMEM) de Dulbecco (DMEM)/F12, 10 % sérum bovin fœtal (FBS), 1x pénicilline/streptomycine, facteur de stimulation de la colonie de macrophage de 20 ng/mL (M-CSF) pendant 3 jours à 37 oC, 5 % CO2.
REMARQUE: La chambre haute contient 1 ml de milieu de culture tandis que la chambre inférieure est remplie de 1,5 ml. Le support doit être ajouté à chaque chambre.
2. Coculture de cellules tumorales avec macrophages
- Avant l'utilisation, la culture a disponible commercialement des cellules de tumeur dans leur milieu respectif suivant des méthodes de culture de tissu ATCC-recommandées.
- Laver les cellules tumorales adhérentes une fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), ajouter 0,05% trypsine et acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), et incuber à 37 oC jusqu'à ce que les cellules se détachent. Resuspendre les cellules dans FBS contenant milieu, quantifier le nombre total de cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou compteur cellulaire, puis centrifugeuse pendant 5 min à 220 x g à granulés.
- Pendant la centrifugation, aspirez le milieu des chambres supérieures et inférieures des plaques de support perméables à membrane contenant des macrophages et remplacez-les par un milieu frais.
- Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplissez avec 1 ml de milieu au lieu de 1,5 ml pour permettre un volume suffisant pour l'ajout cellulaire.
- Aspirer le milieu des cellules tumorales granulées et des cellules de resuspend dans DMEM/F12 avec 10% FBS, 1x pénicilline/streptomycine, et 20 ng/mL M-CSF à une concentration de 3 x 105 cellules/mL.
- Ajouter 0,5 ml de 3 x 10 cellules/mL cellules tumorales à la chambre inférieure des puits désirés (Figure 1B).
REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées immédiatement.
3. Traitement des cellules co-cultivées
- Pour induire l'expression des gènes pro-inflammatoires macrophages, traitez les macrophages individuellement ou co-cultivés en ajoutant 100 ng/mL IFNet et 50 ng/mL LPS.
- Variez la durée des temps de traitement en culture au besoin. L'activation de macrophage se produit dans un délai de 2 h et une certaine suppression tumeur-négociée se produit par 8 h. Co-culture pour 24 h donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente.
REMARQUE : Alternativement, les macrophages peuvent être induits pour adopter un phénotype curatif pro-blessure par l'addition des facteurs tels que l'interleukin-10 (IL10), et l'effet du ligand tumeur-secret évalué.
- Variez la durée des temps de traitement en culture au besoin. L'activation de macrophage se produit dans un délai de 2 h et une certaine suppression tumeur-négociée se produit par 8 h. Co-culture pour 24 h donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente.
- En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture individuellement et laisser non traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés individuellement avec 100 ng/mL IFN et 50 ng/mL LPS.
4. Analyse en aval des cellules co-cultivées
- Après le temps d'incubation souhaité s'est écoulé, isolez le lysate cellulaire ou le milieu de culture conditionné comme désiré, selon les besoins d'essai.
- Pour isoler le lysate cellulaire pour l'analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymérase (qPCR), aspirer le support des deux chambres du puits et laver une fois avec 2 ml de PBS. Appliquer le tampon de lyse d'ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages. Gratter doucement la membrane pour libérer le lysate de la cellule, et le transférer dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d'isolement de l'ARN.
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Résultats
Pour déterminer l'effet des ligands tumeur-sécrétés sur la polarisation de macrophage, la procédure décrite a été employée. Les macrophages péritonéaux cultivés en l'absence de cellules tumorales ont été utilisés comme témoins négatifs (non traités à l'extrême gauche) et positifs (IFNet et LPS stimulés àpartir de la gauche) (Figure 2A). Alternativement, les macrophages péritonéaux ont été co-cultivés avec les cellules de tumeur de mélanome b16F10 (ATCC) (figur...
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Discussion
L'analyse de co-culture présentée ici est une modification des essais précédemment établis qui permet l'étude des facteurs tumoraux-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires. Tandis que le contact de cellule-cellule est connu pour induire des changements dans l'activité immunisée, la capacité des ligands tumeur-sécrétés pour moduler l'activation immunisée est moins bien comprise. Nous décrivons une méthode qui, contrairement à la co-culture directe, peut être employée pour interroger comment les facteurs sécrété...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Eric Ubil a été financé, en partie, par l'American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Les travaux ont été appuyés par une subvention des NIH (R01-CA205398) et un prix de la Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-18-041) à HSE.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC ATCC | CRL-6475 | |
| kit de synthèse d’ADNc | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 | milieu ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Sérum de veau fœtal | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O111 :B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murin M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Souris recombinante IFN&gamma ; | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Supports perméables Transwell | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsine-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Références
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Réimpressions et autorisations
