Détermination de l’identité et de la pureté des cellules immunitaires à l’aide d’un PCR quantitatif à base d’épigénétique

Résumé

Ici nous décrivons une méthode robuste de déterminer l’identité et la pureté des cellules immunitaires par des signatures épigénétiques détectées à l’aide de PCR quantitatif (qPCR). La déméthylation de l’ADN à un locus spécifique sert d’identifiant unique pour un type de cellule particulier et permet d’identifier les lymphocytes T CD8MD, réglementaires ou Th17.

Résumé

Les fréquences de population de sous-types de cellules immunitaires peuvent avoir un grand effet sur l’efficacité des thérapies à cellules T. Les méthodes actuelles, comme la cytométrie du débit, ont des besoins spécifiques en échantillons, des apports d’échantillons élevés, sont faibles en débit et sont difficiles à normaliser, ce qui nuit à la caractérisation des produits de thérapie cellulaire au cours de leur développement et Fabrication.

Les essais décrits ci-dessous identifient et quantifient avec précision les types de cellules immunitaires dans un mélange hétérogène de cellules utilisant l’ADN génomique isolé (gDNA). Les modèles de méthylation d’ADN sont indiqués par la conversion de bisulfite, un processus dans lequel les cytosines unmethylées sont converties en uracils. Les régions d’ADN non méthylées sont détectées par amplification qPCR à l’aide d’amorces ciblant les zones converties. Un locus unique par essai est mesuré et sert d’identifiant précis pour un type de cellule spécifique. Les essais sont robustes et identifient les lymphocytes T CD8MD, réglementaires et Th17 d’une manière à haut débit. Ces essais optimisés peuvent potentiellement être utilisés pour les tests de traitement et de libération de produit pour le processus de thérapie cellulaire.

Introduction

L’utilisation des lymphocytes T dans l’immunothérapie cellulaire a augmenté de manière significative au cours de la dernière décennie, en particulier avec l’avènement du récepteur d’antigène chimérique (CAR) technologie des lymphocytes T¹. Bien que les thérapies à base de lymphocytes T aient connu un grand succès clinique, elles sont hétérogènes et les caractéristiques et les identités cellulaires peuvent varier considérablement d’un donneur à l’autre². L’hétérogénéité des populations de lymphocytes T peut avoir des répercussions majeures sur l’efficacité thérapeutique et compliquer les conclusions des essais cliniques. Pour cette raison, il est crucial de comprendre l’hétérogénéité des lymphocytes T pendant la fabrication et la formulation du produit afin de déterminer les formulations optimales des immunothérapies à cellule T.

Dans un sens large, les lymphocytes T peuvent être divisés en deux groupes : les lymphocytes T auxiliaires CD4MD, qui sécrètent des cytokines immunomodulatrices, et les lymphocytes T cytotoxiques CD8MD, qui lysèrent directement les cellules présentant l’antigène cognate sur les molécules complexes i du complexe d’histocompatibilité majeure (MHC). Les lymphocytes T auxiliaires CD4MD peuvent se différencier en une myriade de sous-ensembles spécifiques qui produisent un ensemble unique de cytokines. Certains suggèrent qu’un rapport défini des lymphocytes T CD4MD à CD8MD dans le produit cellulaire final maximise l’efficacité et la persistance in vivo, mais pourrait compliquer la fabrication cellulaire³. Les lymphocytes T régulateurs (Tregs), un sous-ensemble de lymphocytes T CD4MD, sont immunosuppresseurs et diminuent l’activation des cellules immunitaires. Les lymphocytes T régulateurs ont été impliqués dans la médiation de la tolérance tumorale et, s’ils sont présents lors de la fabrication des lymphocytes T CAR, peuvent inhiber la réponse immunitaire antitumorale des cellules T de carRAC^4,5,6. D’autres sous-ensembles CD4MD tels que les lymphocytes T 17 (Th17) favorisent le déminage tumoral et peuvent être mis à profit pour augmenter l’efficacité des thérapies à cellules T. Ainsi, l’augmentation des lymphocytes T Th17 CD4 MD est d’un intérêt particulier dans les milieux tumoraux solides où la production accrue d’interleukine 17 (IL-17) favorise la réponse immunitaire antitumorale^5,7,8,9. Comprendre l’importance des cellules Th17 dans les réponses tumorales a incité plus d’enquête sur les stratégies pour générer ces cellules in vitro^7,9. Par conséquent, les méthodes pour détecter ces sous-ensembles de cellules T sont cruciales pour optimiser les thérapies de cellules T et devraient être robustes, faciles, évolutifs, et reproductibles.

La cytométrie de flux est la méthode la plus courante pour déterminer l’identité d’une cellule immunitaire. Cependant, la cytométrie du débit nécessite des cellules vivantes et intactes qui doivent être analysées le jour même où elles sont récoltées. Pour la coloration intracellulaire de cytokine (ICS), l’inhibition de sécrétion de protéine est exigée pour retenir des cytokines dans les cellules de T. Cependant, différents composés inhibiteurs ont des effets différentiels sur la sécrétion de cytokines spécifiques, forçant les utilisateurs à créer des cocktails spécialisés pour la détection de la cytokine d’intérêt^10,11. En outre, la fidélité de la cytométrie de flux repose sur des clones d’anticorps qui se lient spécifiquement et puissamment à leur cible. L’utilisation de différents clones d’anticorps peut entraîner des résultats variables et conduire à des conclusions imprécises, ce qui rend la méthode difficile à normaliser¹². En outre, l’analyse des données recueillies par cytométrie de flux, et donc les conclusions tirées des données, peut varier considérablement entre les utilisateurs en fonction de la façon dont les portes sont fixées^13,14. Pour ces raisons, la cytométrie de flux n’est pas idéale pour le contrôle précis de la qualité pendant le développement de la thérapie cellulaire.

L’évaluation de la méthylation génomique au loci spécifique de gène est une méthode alternative de déterminer l’identité cellulaire. La raison d’être de l’utilisation de la méthylation de l’ADN pour identifier des types de cellules spécifiques a été décrite dans plusieurs articles et s’appuie sur des modèles spécifiques de méthylation présents dans une population cellulaire donnée^15,16,17. Dans les cellules cibles, certains sites contiennent des nucléotides non méthylés, tandis que dans les cellules non ciblées, ces sites sont méthylés. Ce modèle peut être détecté par conversion de bisulfite, un processus qui convertit exclusivement les nucléotides de cytosine non méthylée (C) en uracil (U). Les amorces et les sondes peuvent être conçues contre les sites convertis, puis amplifiées et détectées par qPCR¹⁶.

L’essai décrit ci-dessus mesure la fréquence des sous-types de cellules immunitaires dans les populations hétérogènes en quantifiant le nombre de loci non méthylés spécifiques par rapport à un gène d’entretien ménager. Des copies des éléments réglementaires non méthylés pour le gène CD8 B sont mesurées dans l’assay CD8, FoxP3 dans Treg, et IL-17 dans Th17 dans cet test. Ces loci ont été identifiés en isolant la population cellulaire spécifique d’intérêt (p. ex., les lymphocytes T CD8) et en effectuant le séquençage du bisulfite pour identifier les loci qui ne sont pas méthylés dans seulement ce type de cellule¹⁵. Les amorces et les sondes sont développées contre les loci uniques et les échantillons sont analysés par qPCR. Une courbe standard de numéros de copie connus est créée à partir de dilutions d’un plasmide standard de nombre de copie élevée, permettant la conversion d’une valeur Ct en numéro de copie de transcription.

Pour évaluer les performances de l’analyse, des échantillons témoins sont nécessaires, y compris un aDNc de référence et un plasmide d’étalonneur. Le matériel génomique de référence est un échantillon de sang mis en commun provenant de plusieurs donneurs ayant des fréquences de cellules immunitaires connues et est utilisé pour un contrôle de la qualité (QC) test de performance. L’échantillon de calvaire est un plasmide synthétisé qui contient les séquences de gènes CD8, FoxP3 et GAPDH dans un rapport équimolar. Il est utilisé comme mesure de l’efficacité de conversion bisulfite, parce que les conversions de bisulfite dans différentes régions génomiques varient en efficacité. Le rapport de la cible à GAPDH dans le calibrator est de 1, mais en raison des différences de l’efficacité de conversion bisulfite, le rapport peut varier. Ce facteur d’étalonnage est appliqué aux essais CD8 et Treg. FoxP3, le gène utilisé dans l’assay Treg, est situé sur le chromosome X. Parce que cet analyse ne mesure que des copies non méthylées de FoxP3, et qu’une seule copie de FoxP3 est non méthylée dans Tregs, cet analyse est agnostique du sexe et peut être utilisé avec des échantillons masculins et féminins¹⁸. L’analyse Th17 n’utilise pas un échantillon d’étalonneur ou GAPDH comme gène d’entretien ménager. Au lieu de cela, un autre ensemble d’amorce ciblant les loci méthylés présents dans les cellules non-Th17 est inclus et le nombre total de cellules est reflétée par la somme des copies méthylées et non méthylées de l’IL-17. Les données obtenues à partir du qPCR sont saisies dans un modèle d’analyse préétabli qui effectue des vérifications de contrôle de la qualité sur les données et calcule le pourcentage de la cellule cible au sein de la population de départ. Cela fournit une analyse automatisée et impartiale des données, éliminant ainsi la subjectivité des utilisateurs et améliorant les capacités de normalisation.

Cet analyse utilise l’ADNc, qui peut être isolé par une procédure de leuphatrose à l’aide de cellules cultivées ou fixes, ou de granulés de cellules congelées. La faible exigence relative à l’échantillon, la souplesse du matériau de départ de l’échantillon, la précision élevée et l’analyse normalisée tiennent compte des limites associées à la cytométrie du débit et sont idéales à des fins de contrôle de la qualité pendant le développement du processus de thérapie cellulaire.

Protocole

Tous les échantillons humains ont été obtenus à partir d’une source commerciale suivant leurs directives pour l’éthique de la recherche humaine.

1. Isolement génomique de l’ADN

REMARQUE : L’isolement génomique de l’ADN est effectué à l’aide d’un kit disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)à partir de cellules hématopoïétiques, telles que les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC), les lymphocytes T purifiés ou tout autre type de cellules hématopoïétiques. Dans cette expérience, des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) et des cellules T de trois donateurs humains différents ont été employées.

1. Placer 1-2 x 10⁶ cellules hématopoïétiques dans un tube conique et centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min.
2. Aspirez complètement le supernatant.
3. Ajouter 350 l de lyse/tampon de liaison à l’échantillon et couver pendant 10 min à 55 oC.
4. Ajouter 50 l de protéinase K (20 mg/mL) à 350 oL de suspension cellulaire et de vortex pour 30 s.
5. Ajouter 50 L de perles paramagnetiques liant l’ADN et 400 l d’isopropanol à 100 % et couver pendant 3 min à température ambiante (RT).
6. Placer le tube sur un support magnétique pendant 2 min et retirer le supernatant, en prenant soin de ne pas déranger les perles. L’ADN est lié aux perles magnétiques à cette étape.
7. Ajouter 950 l’un de tampon de lavage 1. Vortex pour 30 s et répéter l’étape 1.6.
8. Répétez l’étape 1.7.
9. Ajouter 950 l’un de tampon de lavage 2. Vortex pour 30 s et répéter l’étape 1.6.
10. Ajouter 100 lde de tampon d’élution et de vortex pendant 2 min. Placez le tube sur un support magnétique pendant 1 min et transférez le supernatant contenant l’ADNg g à un nouveau tube.
11. Utilisez 1 L de l’ADNc isolé des cellules hématopoïétiques pour mesurer la pureté de l’ADNc par spectrophotométrie à l’aide d’un fluorimètre en obtenant l’OD à 260 nm, 280 nm et 230 nm. Assurez-vous que le rapport de densité optique (rapport OD) à 260 et 280 nm se situe entre 1,7-2,0 et que le rapport OD à 260 et 230 nm se situe entre 1,5 et 2,4.

2. Préparation de l’échantillon

1. Préchauffer un thermomélangeur à 56 oC.
2. Étiquetez les tubes de 2 ml pour tous les échantillons, le calibrage et le matériel de référence.
3. Diluer les échantillons et le caler avec le tampon d’élution (disponible avec le kit utilisé pour l’étape 1) à RT.
   1. Pour tous les échantillons expérimentaux, diluer l’ADNc à un volume total de 142 L. Par exemple, diluer 4 'L de gDNA à 100 ng/L en 138 'L de tampon d’élution.
      REMARQUE: 400-1200 ng de gDNA peuvent être utilisés pour l’analyse.
   2. Diluer 75 l de l’étalonneur pour un volume total de 142 l.
   3. Vérifiez la concentration de gDNA de référence avec un spectrophotomètre, en utilisant TE (pH 8,0) comme un blanc.
   4. Diluer 1 000 à 1 200 ng de l’ADNc de référence pour un volume total de 142 L. Par exemple, diluer 10 L de gDNA de référence à 100 ng/L en 132 l de tampon d’élution.
4. Incuber les tubes à 56 oC pendant 5 min à 900 tr/min dans un thermomélangeur. Faites tourner brièvement les tubes pour recueillir les échantillons.

3. Conversion Bisulfite

REMARQUE : Assurez-vous que les temps d’incubation pendant la conversion du bisulfite suivent les heures recommandées. La surincubation ou la sous-incubation auront une incidence sur les résultats de l’analyse.

1. Définir un thermomélangeur à 80 oC.
2. Ajouter 270 l d’ammonium bisulfite et 90 l d’alcool tétrahydrofurfuryl (THFA) à tous les tubes. Vortex à mélanger complètement et brièvement spin vers le bas les échantillons pour recueillir le liquide au fond.
3. Incuber les tubes dans un thermomélangeur à 80 oC pendant 45 min à 900 tr/min. Si vous utilisez un bloc thermique, vortexz les tubes pendant 1-2 s toutes les 4,5 min pendant l’incubation.
4. Faites tourner brièvement les échantillons et laissez refroidir à RT pendant 3-5 minutes avant de continuer avec l’étape 4 ou 5. Le volume final doit être de 500 euros L.

4. Essais CD8 et Treg

1. Purification de l’ADN après la conversion du bisulfite
   REMARQUE : Cette étape est effectuée à l’aide d’un kit de purification de l’ADN disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) sur l’ADN converti au bisulfite. Assurez-vous que les réactifs sont réchauffés à RT avant utilisation.
   1. Avant de commencer la purification, créer un mélange homogène de perles paramagnetiques d’isolement de l’ADN en vortexant pendant 30 s. Ajouter de l’éthanol et de l’isopropanol aux tampons de lavage, en suivant les volumes indiqués sur les bouteilles, et définir un bloc de chaleur à 65 oC.
   2. À RT, ajouter 870 l de lyse/tampon de liaison et 105 l de perles paramagnetic de liaison d’ADN à chaque tube à partir de l’étape 3.4. Vortex à mélanger complètement et brièvement spin vers le bas les tubes.
   3. Ajouter 570 l de 2-propanol et vortex pour mélanger complètement.
   4. Incuber les tubes à RT pendant 7 min à 50 tr/min dans un thermomélangeur ou un mélangeur rotatif standard.
   5. Faites tourner brièvement les tubes. Placer les tubes sur le support magnétique et couver pendant 5 min.
   6. Avec les échantillons encore sur le support magnétique, retirer le supernatant sans déranger les perles.
      REMARQUE: L’ADN est lié aux perles.
   7. Retirez les tubes du support magnétique et ajoutez 900 l de tampon de lavage 1. Vortex les tubes pour resuspendre complètement les perles, puis brièvement tourner vers le bas les tubes.
   8. Remettre les tubes sur le support magnétique et couver pendant 3 min.
   9. Avec les échantillons encore sur le support magnétique, retirer le supernatant sans déranger les perles.
   10. Répéter les lavages (4.1.7-4.1.9), une fois avec le tampon de lavage 1, puis deux fois avec le tampon de lavage 2.
   11. Après avoir enlevé le supernatant, faites tourner brièvement les tubes et retournez au support magnétique pendant 3 min.
   12. Retirez tous les tampons de lavage résiduels 2 et retirez les tubes de la grille magnétique.
   13. Séchez les perles avec les couvercles du tube ouverts à 65 oC pendant 15 min.
   14. Ajouter 60 ll de tampon d’élution à chaque tube et incuber à RT pendant 7 min à 1 400 tr/min. Alternativement, vortex à une vitesse modérée à l’aide d’un adaptateur de mousse.
   15. Faites tourner brièvement les tubes et placez-les sur le support magnétique pendant 2 min.
   16. Transférer 55 l 'L d’éluate dans un nouveau tube sans déranger les perles. L’éluate contient l’ADN converti au bisulfite. Il n’est pas nécessaire de mesurer la concentration d’ADN.
2. Configurer et exécuter qPCR
   1. Allumez la machine qPCR et l’ordinateur qui exploite son logiciel.
   2. Sur l’interface utilisateur du logiciel créer une nouvelle expérience et sélectionnez quel bloc est utilisé pour exécuter l’expérience.
   3. Sélectionnez Courbe standard comme type d’expérience.
   4. Le cas échéant, sélectionnez la chimie de détection que vous souhaitez utiliser. Cet exemple utilise les réactifs TaqMan. Sinon, sélectionnez ROX comme référence passive.
   5. Le cas échéant, sélectionnez les propriétés de l’instrument en coursd’exécution en standard .
   6. Définissez votre conception expérimentale en attribuant des cibles (p. ex., GAPDH ou CD8 avec FAM en tant que reporter), et un quencher non fluorescent.
   7. Attribuez des noms d’échantillons pour les normes, les échantillons et les contrôles.
   8. Ensuite, assignez chaque position de puits en fonction de la plaque qPCR. Chaque puits nécessite une cible, comme CD8 ou GAPDH, et un nom d’échantillon. Chaque échantillon est exécuté en tripleett et doit être reflété sur la disposition de la plaque pour l’instrument.
   9. Attribuez à chaque standard la norme de tâche et spécifiez les numéros de copie finale selon le tableau 1.
   10. Attribuer des échantillons, étalonneur, et référence rattacher la tâche Inconnue.
   11. Désigner des puits pour aucun contrôle de modèle comme NTC ou N.
   12. Préparer les dilutions en série de l’ADN lambda (10 ng/L) qui seront utilisées comme norme (voir tableau 1).
   13. Préparer des cocktails de mélange maître qPCR, un pour le type de cellule cible et un pour GAPDH (voir le tableau 2). Exécutez tous les échantillons, les normes et le contrôle du CNT en triple.
       REMARQUE : GAPDH est utilisé pour quantifier le nombre total de cellules et est exécuté en parallèle avec l’amplification cible. Des copies d’éléments réglementaires non méthylés pour le gène CD8 B sont mesurées dans l’assiduC8, FoxP3 dans Treg et IL-17 en Th17.
   14. Utilisez une plaque de puits 96 pour qPCR. Chargez d’abord 3 l d’ADN de modèle dans les puits. Ensuite, chargez 7 ll du mix maître.
   15. Scellez la plaque avec un film qPCR et faites-la tourner brièvement vers le bas de la plaque avant de la placer dans l’instrument qPCR.
   16. Exécuter le qPCR comme indiqué dans le tableau 3.
   17. Après l’achèvement de l’exécution, exportez les données qPCR sous forme de fichier .txt ou .xlsx.
   18. Analyser les données à l’aide des modèles d’analyse pour l’analyse CD8 et l’analyse Treg (voir tableau des matériaux) pour calculer la moyenne Ct, Ct Déviation Standard, et le numéro de copie.

Numéro de copie plasmide initial/3 L	Volume	ADN diluant [1]	Numéro de copie finale par 3 L	Étiquette
31250	1000 l	-	31250	StST 1
31250	200 l	800 l	6250	StST 2
6250	200 l	800 l	1250	StST3
1250	200 l	800 l	250	StST4
250	200 l	800 l	50	StST 5
1250	30 l	1200 l	30	MST 6 [2]
[1] 10 ng/L ADN Lambda en TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0)
[2] Utilisez les MST3 pour préparer les MST 6

Tableau 1 : Préparation des dilutions standard. Une norme de dilution de 4 logs couvrant 31250-30 copies ont été préparées selon le tableau en utilisant l’ADN TE/lambda comme diluant. Les mêmes dilutions standard ont été utilisées pour cD8 et GAPDH. Les normes ont été stockées à -20 oC.

Réactifs	Montant
Lambda DNA (50 ng/L en TE, pH8.0)	1 l
TaqMan d’assay	0,5 l
Eau, sans nucléane	0,5 l
Mix Maître	5 ll
Total	7 l

Tableau 2 : Préparation du cocktail qPCR. Préparer le mix maître qPCR dans deux tubes distincts, un pour CD8 et GAPDH, à l’exclusion de l’ADN du modèle selon le tableau.

Étape	Temps	Temp	Cycles
Pré-incubation	35 min	95oC	1X (en)
Amplification	15 sec	95oC	50X 50X
	1 min	61oC
Recharge	5 sec	à 42oC	1X (en)

Tableau 3 : paramètres d’exécution qPCR pour les paramètres CD8 et Treg. Le qPCR a été exécuté selon les paramètres spécifiés dans le tableau.

5. Th17 d’assay

1. Purification de l’ADN après la conversion du bisulfite
   1. Effectuer les étapes de purification décrites à la section 4.1.
   2. Pour élifier les échantillons, ajouter 25 ll de tampon d’élution à chaque tube et incuber à RT pendant 7 min à 1 400 tr/min. Alternativement, vortex à une vitesse modérée à l’aide d’un adaptateur de mousse.
   3. Faites tourner brièvement les tubes et placez-les sur un support magnétique pendant 2 min.
   4. Transférer 20 l d’éluate dans un nouveau tube sans déranger les perles. L’éluate contient l’ADN converti au bisulfite.
2. Préamplification de l’ADN
   REMARQUE : La préamplification de l’ADN est recommandée pour les cibles de faible abondance pour une quantification précise par qPCR¹⁹. L’assay de méthylation Th17 a été conçu pour exiger la préamplification pour cette raison.
   1. Transférer 2 ll d’ADN converti au bisulfite dans les tubes à bande PCR. Créer un tube NTC avec 2 ll d’eau.
   2. Créer le mélange maître de préamplification pour tous les échantillons (voir tableau 4).
   3. Ajouter 23 ll du mélange maître à chaque tube. Capuchon les tubes, vortex, et brièvement tourner vers le bas les tubes.
   4. Exécutez le protocole de préamplification sur un thermocycleur à l’aide d’un couvercle chauffé. (Tableau 5). Une fois la course terminée, faites-la tourner brièvement vers le bas les tubes.
   5. Transférer 2 ll de l’ADN amplifié dans de nouveaux tubes et ajouter 78 l d’eau, en diluant les échantillons 1:40.
3. qPCR mis en place et exécuter
   1. Suivez la section 4.2 pour configurer et exécuter le qPCR.
4. Analyser les données à l’aide du modèle d’analyse de l’analyse Th17 (voir tableau des matériaux) pour calculer la moyenne ct, la déviation standard ct et le numéro de copie.

Réactif	Montant
Eau, sans nucléane	9,5 l
Hot Start PCR Master Mix	12,5 l
Th17 PCR Amorce	1 l
Total	23 l

Tableau 4 : Préamplifier l’ADN de l’analyse Th17. Le mix maître de réaction de pré-amplification a été préparé selon le tableau.

Étape	Temps	Temp	Cycles
Pré-incubation	35 min	95oC	1X (en)
Dénaturation	1 min	95oC	12X (en)
Recuit	45 sec	55oC
Allongement	30 sec	72oC
L’allongement final	10 min	72oC	1X (en)
Tenir	Indéfinie	4oC

Tableau 5 : Adn Preamplify Th17. L’ADN de Th17 a été pré-amplifié pendant 12 cycles avant le qPCR réel.

Résultats

Les trois essais de méthylation commencent par une entrée de gDNA et donnent un pourcentage de lymphocytes T CD8, Treg, ou Th17 dans toute la population cellulaire. Les données générées à partir du qPCR suivant la conversion du bisulfite ont été analysées à l’aide du modèle d’analyse fourni. Ce modèle a utilisé les courbes standard obtenues à partir des échantillons standard pour estimer le nombre de copies des cibles et le nombre total de cellules dans les échantillons d’essai. Le type de cellule pour cent a ensuite été calculé à l’aide des formules intégrées dans les modèles d’analyse. La figure 1 montre les données représentatives de l’analyse CD8MD, obtenues à partir de l’analyse des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et des lymphocytes T de trois donneurs différents à l’aide de la cytométrie du débit et de l’analyse de méthylation décrite. Les tendances entre les deux méthodes pour tous les donneurs des deux types de cellules étaient similaires. La figure 2 montre les données représentatives de l’analyse Treg. Trois donneurs purifiés de Treg ont été analysés utilisant le qPCR basé sur la méthylation et la cytométrie de flux et les résultats ont été tracés sur le graphique montré. Les résultats pour les deux méthodes étaient relativement similaires. Cependant, dans tous les cas, la cytométrie de flux a donné des valeurs plus élevées. La figure 3 montre la comparaison des cellules Th17 détectées par cytométrie et méthylation du débit. Dans ce graphique, il y a des conditions stimulées et non stimulées pour les méthodes expérimentales. Les cellules nécessitent une stimulation avec PMA et ionomycine et un traitement avec un inhibiteur du transport de protéines pour augmenter la quantité d’IL-17A présent dans chaque cellule afin qu’il puisse être détecté par cytométrie de flux²⁰. L’état de méthylation peut être détecté quel que soit l’état de stimulation. La cytométrie de flux a donné des niveaux plus bas des cellules de Th17 par rapport à la méthylation. La sensibilité et la spécificité de l’analyse ont été démontrées par la limite de blanc (LOB), la limite de détection (LOD) et la limite de quantitation (LOQ) affichées dans le tableau 6.

Figure 1 : Comparaison des flux et de la méthylation des pourcentages de CD8MD pour les PBMC et les lymphocytes T pour trois donneurs différents. Les PBMC et les lymphocytes T de trois donneurs différents ont été mis en test pour le pourcentage de lymphocytes T CD8 dans toute la population utilisant soit la cytométrie du flux, soit la méthylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Comparaison des débits et de la méthylation des pourcentages de Treg pour treg purifié pour trois donneurs différents. Des cellules purifiées de Treg ont été astorées pour le pourcentage des cellules de Treg dans la population entière utilisant la cytométrie de flux ou la méthylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Comparaison des flux et de la méthylation des pourcentages de Th17 pour les groupes expérimentaux stimulés et non stimulés. Des lymphocytes T stimulés et non stimulés ont été analysés utilisant la cytométrie de flux et la méthylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dosage	Lob	Lod	Loq
CD8 (en)	0	19	52
Gapdh Gapdh	0	7	21
FoxP3 FoxP3	0	3	12
Th17 TpG	0	35	73
Th17 CpG	0	38	73

Tableau 6 : LoB, LoD, LoQ des numéros de copie pour les essais basés sur la méthylation. La sensibilité et la spécificité de l’analyse sont détaillées par les valeurs LoB, LoD et LoQ obtenues par les directives MIQE^21,22. En général, aussi peu que 40 copies peuvent être détectées avec précision par ces essais.

Discussion

Avec l’avènement de nouvelles immunothérapies, il est nécessaire de mettre en place des méthodes normalisées de détection de l’identité et de la pureté des cellules immunitaires. Les méthodes d’évaluation des tests en cours et de rejet qui sont robustes, validées et évolutives restent à établir et posent un défi majeur à la commercialisation des thérapies cellulaires. Bien que la cytométrie du débit soit actuellement la méthode la plus courante pour le phénotypage des cellules immunitaires, la qualité de l’échantillon et les exigences de quantité élevées le rendent difficile pour une utilisation régulière. De plus, la mise en œuvre de la cytométrie du débit dans un environnement de bonnes pratiques de fabrication (GMP) est limitée par des stratégies de gating dépendantes de l’opérateur et l’exigence de normes de référence pour chaque marqueur utilisé^13,14. Bien qu’il ait été démontré que le gating automatisé améliore la robustesse des tests, il ne s’agit pas encore d’une stratégie bien établie de contrôle de la qualité. Tandis que le profilage d’expression de gène peut également être employé pour caractériser l’identité et la pureté de produit de thérapie cellulaire, les données sont semiquantitatives et laborieuses. En outre, l’ARN et le microARN sont relativement moins stables que l’ADN et peuvent contribuer à l’absence de résultats robustes et reproductibles. Ainsi, l’utilisation du statut épigénétique de méthylation de l’ADN d’un locus spécifique fournit une méthode stable, facile à exécuter, robuste et évolutive pour identifier et quantifier un type cellulaire d’intérêt.

La détection des schémas de méthylation des cellules phénotypes repose sur trois étapes critiques : premièrement, l’analyse nécessite l’utilisation de l’ADNc, qui est isolé selon les méthodes décrites. L’ADN de haute qualité est nécessaire et s’il n’est pas utilisé, la conversion de bisulfite peut être affectée^23,24. Si de l’ADN de mauvaise qualité est obtenu, une purification supplémentaire est recommandée pour assurer la fiabilité de l’analyse. Deuxièmement, la conversion réussie de bisulfite de la cytosine unmethylated à l’uracil est exigée. L’étape la plus critique dans la conversion de bisulfite est dénaturation d’ADN^23,25. Dénaturation à haute température à l’aide d’ammonium bisulfite, par opposition à bisulfite de sodium, augmente l’efficacité de conversion et la cohérence et est le processus recommandé pour ces essais^25,26. Les utilisateurs doivent s’assurer que la réaction se produit à 80 oC et que le mélange d’échantillons se fait fréquemment. Pour ces raisons, un thermomixeur numérique est recommandé (voir Tableau des matériaux). Troisièmement, la technique appropriée de pipetage doit être suivie pendant la préparation de qPCR. Trois répliques techniques sont nécessaires lors de la réaction qPCR pour adhérer à l’information minimale pour la publication des lignes directrices quantitatives en temps réel des expériences PCR (MIQE)²⁷. L’inclusion de répliques plus techniques est acceptable, mais n’est pas nécessaire. Une mauvaise technique de tuyauterie et/ou l’inutilisation de répliques techniques entraîneront des résultats qPCR peu fiables.

Si les étapes critiques sont suivies et que les résultats souhaités ne sont toujours pas obtenus, plusieurs contrôles dans l’analyse peuvent être mis à profit pour identifier le problème. Une conversion bisulfite appropriée est l’étape la plus cruciale dans cet essai. Une conversion de bisulfite incorrecte serait mise en évidence par un facteur d’étalonnage défaillant et/ou des valeurs de référence calculées par le modèle d’analyse. Si la conversion du bisulfite était effectuée de façon incorrecte (p. ex., si la réaction était effectuée à RT), il n’y aurait pas d’amplification pendant qPCR. De plus, aucune amplification ne serait constatée si une erreur avait été commise pendant la préparation de la réaction qPCR (p. ex., si le mix principal qPCR n’était pas ajouté). Ces deux questions peuvent être séparées en étudiant les échantillons standard. L’amplification dans les échantillons standard, mais pas les échantillons de référence, d’étalonneur et d’expérimentation, indiquerait que la conversion du bisulfite n’a pas été effectuée correctement. Aucune amplification dans aucun des échantillons n’indiquerait que le qPCR n’a pas été exécuté correctement.

Bien que cet essai porte sur l’exigence rigoureuse en matière d’échantillonnage et la variabilité de l’analyse associées à d’autres méthodes de phénotypage, en particulier la cytométrie du débit, il y a des limites à noter. Cet essai cible un seul locus qui est utilisé comme un identifiant unique pour la cellule cible, ce qui interdit l’analyse multiplexée qui est couramment effectuée avec la cytométrie de flux. Cela rend difficile l’identification de types de cellules complexes comme Th17. Cependant, l’utilisation des modèles de méthylation à un locus simple s’est avérée être un marqueur phénotypique précis de cellules multiples et a été employée dans les essais cliniques multiples^15,16. Cela est vrai en particulier dans Tregs où l’évaluation des signatures de méthylation FOXP3 est une méthode précise et sans ambiguïté pour détecter les vrais Tregs à partir de cellules transactielles FOXP3 exprimant²⁸. La perte de l’analyse multiplexée est compensée par l’exactitude des loci interrogés. Les itérations futures de l’essai pourraient inclure les colorants et les quenchers de qPCR multiples pour permettre la détection des loci multiples dans une réaction de qPCR.

Cet essai peut être utilisé comme méthode alternative pour la cytométrie du débit dans la détermination du phénotype cellulaire et de l’identité. Il convient de noter que cet essai ne donne pas les valeurs exactes que la cytométrie de flux ne (Figures 1-3). Cela est dû en partie à la variabilité de l’analyse des données associée à la cytométrie du débit. Selon la stratégie de gating, les résultats de la cytométrie de flux peuvent varier considérablement. C’est particulièrement le cas lors de l’utilisation de protocoles de coloration complexes pour examiner les cibles intracellulaires, telles que l’IL-17, où le coefficient de variation (CV) peut être aussi élevé que 15%¹⁴. Entre plusieurs utilisateurs, l’assay présenté a toujours eu un CV de 'lt;15%, soutenant la robustesse de l’assay et les capacités améliorées de normalisation. Les plus grandes différences entre le phénotypage épigénétique et le phénotypage à base de cytométrie du flux sont observées lorsque la stimulation cellulaire est nécessaire (figure 3). La détection des cellules de Th17 par l’intermédiaire de la cytométrie de flux a été accomplie utilisant un protocole commun pour la stimulation de cellule T et la coloration intracellulaire de cytokine^29,30,31. Les différences observées dans le phénotypage Th17 entre la mesure épigénétique et la cytométrie du débit pourraient être dues à la cinétique de la production d’IL-17. Bien que les signatures de méthylation soient stables, la production de protéines prend du temps et doit être présente en quantités suffisantes pour être détectée par les anticorps fluorescents^20,32. L’incubation de 6 h avec inhibiteur du transport de protéines et cocktail de stimulation cellulaire peut avoir besoin d’être étendu pour voir le niveau de cellules Th17 détectés par des méthodes de phénotypage à base épigénétique. D’autres études sont nécessaires pour déterminer la raison précise pour laquelle les valeurs ne correspondent pas et déterminer la méthode de phénotypage la plus précise.

Dans ce rapport, nous détaillons comment identifier et quantifier les types de cellules immunitaires dans un mélange hétérogène de cellules d’une manière simple et robuste. Les essais sont conçus et optimisés pour une utilisation potentielle pour les tests en cours de traitement et de libération des thérapies à base de cellules. Les essais décrits répondent à l’exigence pour les matières premières hautement qualifiées à utiliser dans les applications de thérapie cellulaire. En s’attaquant aux lacunes de la cytométrie du débit et d’autres méthodes moléculaires telles que la stabilité, les besoins en échantillons, la stimulation préalable, la perméabilisation cellulaire pour la coloration intracellulaire et la subjectivité de l’analyse des données, les essais décrits sont en ligne avec les objectifs de commercialisation des thérapies cellulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes	d’analyse	Eppendorf
pour le			Cliquez ici
Modèle d’analyse pour le dosage			du Th17Cliquez ici
Modèle d’analyse pour le			Cliquez ici
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, bleu/rouge/violet6/jaune	Thermo Fisher Scientific	A29004
CTS PureQuant CD8+ Dosage des lymphocytes	T Thermo Fisher Scientific	A43674
CTS PureQuant Th17	Dosage Thermo Fisher Scientific	A43676
CTS PureQuant Treg Thermo	Fisher Scientific	A43675
Dynabeads SILANE Kit d’ADN génomique Thermo	Fisher Scientific	37012D	Utilisé pour l’isolement et la purification de l’ADN génomique après conversion au bisulfite. Contient un tampon d’élution pour diluer les échantillons.
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Utilisé comme support magnétique lors de l’isolement et de la purification de l’ADN
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping	Thermo Fisher	Scientific A42923
eBioscience Essential Human Th1/Th17	Thermo Fisher Scientific	A42927
eBioscience Essential Human Phenotyping Kit	Thermo Fisher Scientific	A42925
Eppendorf SmartBlock 2 mL	Eppendorf	5362000035
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
HulaMixer Mélangeur d’échantillons	Thermo Fisher Scientific	15920D	Mélangeur d’échantillons recommandé
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND 1000
Antiadhésif, sans RNase Microfuge Tubes, 1,5 mL	Applied Biosystems	AM12450
QuantStudio 12S Flex	Applied Biosystems	4470661
TE, pH 8,0, sans RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9849
Mélangeur Vortex	Thermo Fisher Scientific	H2KT17113