Article de méthode

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

DOI :

10.3791/60541

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1 novembre 2019

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1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

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Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Résumé

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La libération de pièges extracellulaires (ET) par les neutrophiles a été identifiée comme un facteur contribuant au développement de maladies liées à l'inflammation chronique. Les ETs de Neutrophiles (NET) se composent d'un maillage d'ADN, de protéines histones et de diverses protéines granules (c.-à-d. myeloperoxidase, élastase et cathepsine G). D'autres cellules immunitaires, y compris les macrophages, peuvent également produire des ET; cependant, dans quelle mesure cela se produit in vivo et si les pièges extracellulaires macrophages (MET) jouent un rôle dans les mécanismes pathologiques n'a pas été examiné en détail. Pour mieux comprendre le rôle des MET dans les pathologies inflammatoires, un protocole a été développé pour visualiser la libération de MET des macrophages humains primaires in vitro, qui peuvent également être exploités dans des expériences d'immunofluorescence. Cela permet une caractérisation plus poussée de ces structures et leur comparaison avec les ET libérées par les neutrophiles. Les macrophages humains dérivés du monocyte (HMDM) produisent des MET lors de l'exposition à différents stimuli inflammatoires après différenciation avec le phénotype pro-inflammatoire M1. La libération des MET peut être visualisée par microscopie à l'aide d'une tache d'acide nucléique fluorescent vert qui est imperméable aux cellules vivantes (p. ex., sYTOX vert). L'utilisation de macrophages primaires fraîchement isolés, tels que hmDM, est avantageuse dans la modélisation des événements inflammatoires in vivo qui sont pertinents pour les applications cliniques potentielles. Ce protocole peut également être employé pour étudier la libération de MET des lignées humaines de cellules de monocyte (par exemple, THP-1) suivant la différenciation en macrophages avec l'acétate de myristate de phorbol ou d'autres lignées de cellules de macrophage (par exemple, les cellules de Macrophage-like de macrophage murine-comme J774A.1).

Introduction

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La libération d'ETs des neutrophiles a d'abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne1. Ils se composent d'une colonne vertébrale de l'ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l'élastase neutrophile et myeloperoxidase2. Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination3. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d'études ont également découvert un rôle dans la pathogéni....

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Protocole

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Les HMDM ont été isolés des préparations de manteau buffy humain fournies par la banque de sang avec l'approbation éthique du district sanitaire local de Sydney.

1. Culture HMDM

  1. Isoler les monocytes des préparations de pelage bouffi préparées à partir du sang périphérique de donneurs humains sains à l'aide d'une préparation disponible dans le commerce pour isoler les lymphocytes, suivie d'une élutriation centrifuge contre-courant19, 20.
  2. Confirmer la présence de monocytes par cytospinning et coloration avec tache modifiée giemsa pour la caractérisation monocyte

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Résultats

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Les images brightfield montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli pour la différenciation cellulaire sont montrées dans la figure 1. Les macrophages polarisés M1 provenant d'expériences avec HMDM exposés à l'IFNMD et au LPS ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau, comme l'indiquent les flèches noires de la figure 1 (panneau du milieu). À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés M2 après l'e.......

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Discussion

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La génération et la visualisation de la formation MET à l'aide de HMDM différenciés M1 représente un nouveau modèle in vitro qui peut être utile pour étudier le rôle pathologique potentiel de ces structures macrophages, en particulier sous inflammatoire chronique Conditions. Il fournit un protocole robuste pour la stimulation des macrophages humains primaires pour libérer des METs, qui peuvent également être utilisés dans des études connexes avec des lignées de cellules de macrophage de monocyte humain ou de macrophage m.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention IMPACT perpétuelle (IPAP201601422) et Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ reconnaît également la réception d'un Australian Postgraduate Award de l'Université de Sydney. Nous tenons à remercier M. Pat Pisansarakit et Mme Morgan Jones pour leur aide dans l'isolement des monocytes et la culture tissulaire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Source lumineuse fluorescente à large spectre 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadasérie x-cite Corning
CellBIND Plaque à puits multiples (12 puits)Sigma-AldrichCLS3336pour la culture cellulaire
Trousse de coloration différentielle Quik (Giemsa modifiée)Polysciences Inc.24606Caractérisation des monocytes
saline équilibrée de Hanks (HBSS)Thermo-Fisher14025050Pour les étapes de lavage et le traitement HOCl
Acide hypochloreux (HOCl)Sigma-Aldrich320331Pour la stimulation MET
Interféron gammaThermo-FisherPMC4031Pour amorçage M1
Interleukin 4Sciences Intégréesrhil-4Pour l’amorçage M2
Interleukin 8Miltenyl Biotec130-093-943Pour la stimulation MET
L-GlutamineSigma-Aldrich59202CAjouté au milieu
de culture LipopolysaccharideIntegrated Sciencestlrl-eblpsPour l’amorçage M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Pour l’isolement des monocytes
Olympus IX71 inversé microscopeOlympus, Tokyo, Japon
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)Sigma-AldrichP8139Pour la stimulation MET
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichD5652Pour les étapes de lavage
Média RPMI-1640Sigma-AldrichR8758Pour la culture cellulaire
SYTOX greenLife TechnologiesS7020Pour MET visulaisation
TH4-200 source lumineuse à fond clairOlympus, Tokyo, Japonsérie x-cite
Facteur de nécrose tumorale alphaLonza300-01A-50Pour la stimulation MET
Solution

Références

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  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....

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Mots-clés

Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

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