Method Article

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

DOI:

10.3791/60541

⸱

November 1st, 2019

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La libération de pièges extracellulaires (ET) par les neutrophiles a été identifiée comme un facteur contribuant au développement de maladies liées à l'inflammation chronique. Les ETs de Neutrophiles (NET) se composent d'un maillage d'ADN, de protéines histones et de diverses protéines granules (c.-à-d. myeloperoxidase, élastase et cathepsine G). D'autres cellules immunitaires, y compris les macrophages, peuvent également produire des ET; cependant, dans quelle mesure cela se produit in vivo et si les pièges extracellulaires macrophages (MET) jouent un rôle dans les mécanismes pathologiques n'a pas été examiné en détail. Pour mieux comprendre le rôle des MET dans les pathologies inflammatoires, un protocole a été développé pour visualiser la libération de MET des macrophages humains primaires in vitro, qui peuvent également être exploités dans des expériences d'immunofluorescence. Cela permet une caractérisation plus poussée de ces structures et leur comparaison avec les ET libérées par les neutrophiles. Les macrophages humains dérivés du monocyte (HMDM) produisent des MET lors de l'exposition à différents stimuli inflammatoires après différenciation avec le phénotype pro-inflammatoire M1. La libération des MET peut être visualisée par microscopie à l'aide d'une tache d'acide nucléique fluorescent vert qui est imperméable aux cellules vivantes (p. ex., sYTOX vert). L'utilisation de macrophages primaires fraîchement isolés, tels que hmDM, est avantageuse dans la modélisation des événements inflammatoires in vivo qui sont pertinents pour les applications cliniques potentielles. Ce protocole peut également être employé pour étudier la libération de MET des lignées humaines de cellules de monocyte (par exemple, THP-1) suivant la différenciation en macrophages avec l'acétate de myristate de phorbol ou d'autres lignées de cellules de macrophage (par exemple, les cellules de Macrophage-like de macrophage murine-comme J774A.1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La libération d'ETs des neutrophiles a d'abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne1. Ils se composent d'une colonne vertébrale de l'ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l'élastase neutrophile et myeloperoxidase2. Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination3. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d'études ont également découvert un rôle dans la pathogénie de la maladie, en particulier pendant le développement de maladies induites par l'inflammation (c.-à-d. la polyarthrite rhumatoïde et l'athérosclérose4). La libération des ET peut être déclenchée par diverses cytokines pro-inflammatoires, y compris l'interleukine 8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF)5,6, et l'accumulation localisée d'ET peut augmenter les lésions tissulaires et évoquer un réponse pro-inflammatoire7. Par exemple, les ET ont été impliqués comme jouant un rôle causal dans le développement de l'athérosclérose8, la promotion de la thrombose9, et la prévision du risque cardiovasculaire10.

Il est maintenant reconnu qu'en plus des neutrophiles, d'autres cellules immunitaires (c.-à-d. les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages) peuvent également libérer des ET lors de l'exposition à la stimulation microbienne ou pro-inflammatoire11,12. Ceci peut être particulièrement significatif dans le cas des macrophages, considérant leur rôle clé dans le développement, la régulation, et la résolution des maladies inflammatoires chroniques. Par conséquent, il est important d'acquérir une meilleure compréhension de la relation potentielle entre la libération d'ET des macrophages et le développement de la maladie inflammation-connexe. Des études récentes ont montré la présence de METs et NETs dans les plaques atherosclérotiques humaines intactes et organisé thrombi13. De même, les MET ont été impliqués dans la conduite des lésions rénales par la régulation des réponses inflammatoires14. Cependant, contrairement aux neutrophiles, il existe peu de données sur les mécanismes de formation du MET à partir de macrophages. Des études récentes utilisant des modèles in vitro humains de formation MET montrent certaines différences dans les voies impliquées dans chaque type de cellule (c.-à-d., en ce qui concerne l'absence de citrullination histone avec des macrophages)6. Cependant, certains ont montré que la libération NET peut également se produire en l'absence de citrullination histone15.

L'objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et directe pour évaluer la libération de MET dans un modèle de macrophage cliniquement pertinent. Il existe un certain nombre de différents modèles de cellules macrophages in vitro qui ont été utilisés pour étudier les ETM (c.-à-d., la lignée cellulaire monocyte humaine THP-1 et diverses lignées de cellules macrophages murine)16. Ces modèles sont liés à certaines limites. Par exemple, la différenciation des monocytes THP-1 aux macrophages nécessite généralement une étape d'amorçage, comme l'ajout d'acétate de myristate phorbol (PMA), qui active lui-même les voies dépendantes de la protéine kinase C (PKC). Ce processus est connu pour déclencher la libération ET4 et les résultats dans une libération basale faible MET des cellules THP-1. D'autres études ont mis en évidence certaines différences dans la bioactivité et les réponses inflammatoires montées par macrophages in vivo par rapport aux cellules THP-1 traitées par PMA17.

De même, le comportement et les réponses inflammatoires de différentes lignées cellulaires de type macrophage murine ne représentent pas complètement le spectre de réponse des macrophages humains primaires18. Par conséquent, dans le but d'étudier la formation d'ET de macrophage dans le cadre clinique, les macrophages humains primaires de monocyte-dérivé (HMDMs) sont censés être un modèle plus pertinent plutôt que monocytic ou murine macrophage-comme des lignes de cellules.

Et libération de M1 polarisé HMDMs a été démontré e après l'exposition de ces cellules à un certain nombre de stimuli inflammatoires différents, y compris l'acide hypochloreux oxydant dérivé de myeloperoxidase (HOCl), PMA, TNFMD, et IL-86. Décrit ici est un protocole pour polariser des HMDM au phénotype de M1 et visualiser la libération suivante de MET sur l'exposition à ces stimulus inflammatoires. La PMA est utilisée comme stimulus de la libération de MET pour faciliter les comparaisons avec les études précédentes qui ont utilisé des neutrophiles. Fait important, HOCl, IL-8, et TNF sont également utilisés pour stimuler la libération met, qui sont censés être de meilleurs modèles de l'environnement inflammatoire in vivo. La méthode microscopique pour la visualisation de la libération et consiste à tacher l'ADN extracellulaire dans les cultures cellulaires vivantes à l'aide de SYTOX vert, une tache d'acide nucléique vert fluorescent imperméable qui a été appliquée avec succès dans les études précédentes neutrophile. Cette méthode permet une évaluation rapide et qualitative de la libération et de l'ET, mais elle n'est pas appropriée comme méthode autonome pour la quantification de l'étendue de la libération ET. Une autre méthode devrait être utilisée si la quantification est nécessaire pour comparer l'étendue de la libération d'ET résultant de différentes conditions de traitement ou interventions.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les HMDM ont été isolés des préparations de manteau buffy humain fournies par la banque de sang avec l'approbation éthique du district sanitaire local de Sydney.

1. Culture HMDM

  1. Isoler les monocytes des préparations de pelage bouffi préparées à partir du sang périphérique de donneurs humains sains à l'aide d'une préparation disponible dans le commerce pour isoler les lymphocytes, suivie d'une élutriation centrifuge contre-courant19, 20.
  2. Confirmer la présence de monocytes par cytospinning et coloration avec tache modifiée giemsa pour la caractérisation monocyte19.
  3. Dans des conditions stériles, ajuster la densité des monocytes à 1 x 106 cellules/mL à l'aide de milieux RPMI-1640 sans sérum. Ajouter 1 ml de cette suspension cellulaire à chaque puits d'une plaque de culture de tissu de 12 puits. Culture dans un incubateur cellulaire à 37 oC en présence de 5 % de CO2 pour 2 h afin de favoriser l'adhérence à la plaque de culture tissulaire.
  4. Dans des conditions stériles, retirez le milieu cellulaire et remplacez-le par un milieu culturel RPMI-1640 complet contenant 10 % (v/v) de sérum humain mis en commun et 20 mM de L-glutamine.
  5. Culture des cellules à 37 oC en présence de 5% de CO2 dans un incubateur cellulaire pendant 8 jours, en changeant les médias tous les 2 jours.

2. Polarisation du HMDM

  1. Dans des conditions stériles, préparez le milieu d'amorçage M1 en ajoutant l'interféron (IFNMD; 20 ng/mL) et le lipopolysaccharide (LPS; 1 g/mL) au média culturel complet RPMI-1640. Préparer le média d'amorçage M2 en ajoutant l'interleukine 4 (IL-4; 20 ng/mL) au média culturel complet RPMI-1640.
  2. Dans des conditions stériles, aspirez les supports des puits de plaque de culture tissulaire qui contiennent le HMDM, qui ont été ensemencés et cultivés comme décrit à la section 1.
  3. Laver soigneusement les puits contenant les cellules 3x avec du PBS stérile (pré-chauffé à 37 oC), en utilisant 1 ml d'aliquots de PBS.
  4. Ajouter 1 mL du support d'amorçage M1 ou M2 à chaque puits contenant le HMDM (selon le cas approprié à l'expérience).
  5. Incuber les cellules pendant 48 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.

3. Stimulation de HMDM pour induire la libération de MET

  1. Dans des conditions stériles, préparez le support culturel contenant différents stimulateurs de libération de MET (selon le cas approprié pour l'expérience) au support complet RPMI-1640 : PMA (25 nM), tNFmD recombinant humain (25 ng/mL), ou IL-8 recombinant humain (50 ng/mL) ).
  2. Pour les expériences de stimulation HOCl, préparer HOCl (200 M) dans HBSS (pré-chauffé à 37 oC), immédiatement avant l'ajout aux cellules. Assurez-vous que le HOCl n'est pas préparé dans un support cellulaire complet.
    REMARQUE: La concentration de la solution de stock de HOCl est quantifiée en mesurant l'absorption UV de la solution à 292 nm et pH 116 et en utilisant un coefficient d'extinction de 350 M-1cm-121.
  3. Après le traitement de polarisation décrit dans la section 2, aspirer le support cellulaire de chaque puits et laver soigneusement les cellules 3x avec 1 mL d'aliquots de l'un ou l'autre: stérile PBS (pour PMA, TNF et IL-8) ou HBSS (pour HOCl), qui ont été pré-chauffés à 37 oC.
  4. Pour les expériences avec PMA, TNFMD ou IL-8 : ajoutez 1 mL du support complet contenant des PMA, TNFMD ou IL-8 après avoir enlevé le PBS dans l'étape finale du lavage.
  5. Pour les expériences avec le TNMD, incuber les cellules pendant 6 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire. Pour les expériences avec PMA et IL-8, incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
  6. Pour les expériences avec HOCl, ajouter 1 ml de HOCl dans HBSS après avoir enlevé le HBSS dans l'étape finale de lavage. Ensuite, incuber les cellules pendant 15 min à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
    1. Aspirez soigneusement le supernatant de cellules et lavez les cellules 3x avec 1 mL d'aliquots de HBSS comme décrit dans l'étape 3.3.
    2. Après avoir retiré le HBSS de l'étape finale de lavage, ajoutez 1 ml de support culturel complet RPMI-1640. Ensuite, incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.

4. Visualisation du MET dans la culture des cellules vivantes

  1. Préparer le colorant vert SYTOX dans le HBSS à une concentration de 40 M.
  2. À la fin des traitements décrits à la section 3 pour induire la libération du MET, ajoutez directement 25 ll de 40 M de colorant à chaque puits contenant du HMDM.
  3. Incuber les cellules à température ambiante (RT) pendant 5 min dans l'obscurité.
  4. Placez le HMDM dans des puits de culture tissulaire au stade du microscope d'un microscope fluorescent inversé pour l'imagerie.
  5. Procédures de microscope
    1. Allumez une source de lumière fluorescente à large spectre, une source lumineuse de brightfield et un microscope inversé installé à l'abri d'un appareil photo numérique couleur haute résolution (voir Tableau des matériaux).
    2. Faites pivoter la roue du filtre jusqu'à la position « numéro 2 » pour la fluorescence verte (excitation de 504 nm, émission de 523 nm) pour l'imagerie des échantillons verts tachés contenus dans les puits de culture tissulaire.
    3. En utilisant l'objectif 5x, concentrer l'image avec la mise au point grossière, puis les boutons de mise au point fine sur le microscope, jusqu'à ce que l'image semble nette, claire et ciblée lorsqu'on la regarde à travers l'oculaire du microscope.
    4. Passez le microscope en mode caméra.
    5. Démarrez le logiciel associé.
    6. Sélectionnez l'onglet Capture sur le logiciel.
    7. Cliquez sur le bouton Play pour prévisualiser l'image et ajuster le bouton de mise au point fine sur le microscope jusqu'à ce que l'image semble nette, claire et focalisée dans la fenêtre de prévisualisation du logiciel.
    8. Cliquez sur le bouton Capture.
      REMARQUE: L'image capturée s'affiche automatiquement dans le logiciel d'accompagnement.
    9. Dans le logiciel, cliquez sur Fichier Enregistrer comme le type de fichier d'image requis.
    10. Au microscope, faites pivoter la roue du filtre jusqu'à la position « numéro 5 » pour l'imagerie brightfield et répétez les étapes 4.5.2-4.5.9 pour obtenir l'image de brightfield correspondante.
    11. Répétez les étapes 4.5.2-4.5.10 si nécessaire pour l'acquisition d'image ultérieure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les images brightfield montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli pour la différenciation cellulaire sont montrées dans la figure 1. Les macrophages polarisés M1 provenant d'expériences avec HMDM exposés à l'IFNMD et au LPS ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau, comme l'indiquent les flèches noires de la figure 1 (panneau du milieu). À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés M2 après l'e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La génération et la visualisation de la formation MET à l'aide de HMDM différenciés M1 représente un nouveau modèle in vitro qui peut être utile pour étudier le rôle pathologique potentiel de ces structures macrophages, en particulier sous inflammatoire chronique Conditions. Il fournit un protocole robuste pour la stimulation des macrophages humains primaires pour libérer des METs, qui peuvent également être utilisés dans des études connexes avec des lignées de cellules de macrophage de monocyte humain ou de macrophage m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par une subvention IMPACT perpétuelle (IPAP201601422) et Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ reconnaît également la réception d'un Australian Postgraduate Award de l'Université de Sydney. Nous tenons à remercier M. Pat Pisansarakit et Mme Morgan Jones pour leur aide dans l'isolement des monocytes et la culture tissulaire.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Source lumineuse fluorescente à large spectre 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadasérie x-cite Corning
CellBIND Plaque à puits multiples (12 puits)Sigma-AldrichCLS3336pour la culture cellulaire
Trousse de coloration différentielle Quik (Giemsa modifiée)Polysciences Inc.24606Caractérisation des monocytes
saline équilibrée de Hanks (HBSS)Thermo-Fisher14025050Pour les étapes de lavage et le traitement HOCl
Acide hypochloreux (HOCl)Sigma-Aldrich320331Pour la stimulation MET
Interféron gammaThermo-FisherPMC4031Pour amorçage M1
Interleukin 4Sciences Intégréesrhil-4Pour l’amorçage M2
Interleukin 8Miltenyl Biotec130-093-943Pour la stimulation MET
L-GlutamineSigma-Aldrich59202CAjouté au milieu
de culture LipopolysaccharideIntegrated Sciencestlrl-eblpsPour l’amorçage M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Pour l’isolement des monocytes
Olympus IX71 inversé microscopeOlympus, Tokyo, Japon
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)Sigma-AldrichP8139Pour la stimulation MET
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichD5652Pour les étapes de lavage
Média RPMI-1640Sigma-AldrichR8758Pour la culture cellulaire
SYTOX greenLife TechnologiesS7020Pour MET visulaisation
TH4-200 source lumineuse à fond clairOlympus, Tokyo, Japonsérie x-cite
Facteur de nécrose tumorale alphaLonza300-01A-50Pour la stimulation MET
Solution

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111(2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

Related Articles