Article de méthode

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

DOI :

10.3791/60548

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9 février 2020

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1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

Dans cet article

Résumé

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Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les neurones ont des exigences intenses pour la haute énergie afin de soutenir leurs fonctions. Le transport mitochondrial altéré le long des axones a été observé dans les neurones humains, qui peuvent contribuer à la neurodégénérescence dans divers états de la maladie. Bien qu’il soit difficile d’examiner la dynamique mitochondriale dans les nerfs humains vivants, de tels paradigmes sont essentiels pour étudier le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence. Décrit ici est un protocole pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie mitochondriale dans les axones de neurone de forebrain dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). Les iPSC sont différenciés en neurones glutamatergiques telencéphaliques utilisant des méthodes bien établies. Les mitochondries des neurones sont tachées avec MitoTracker CMXRos, et le mouvement mitochondrial dans les axones sont capturés à l’aide d’un microscope d’imagerie à cellules vivantes équipé d’un incubateur pour la culture cellulaire. Les images en accéléré sont analysées à l’aide d’un logiciel avec des plugins "MultiKymograph", "Bioformat importateur" et "Macros". Des kymographes du transport mitochondrial sont produits, et la vitesse mitochondriale moyenne dans les directions antérogrades et rétrogrades est lue du kymographe. En ce qui concerne l’analyse de la morphologie mitochondriale, la longueur mitochondriale, la zone et le rapport d’aspect sont obtenus à l’aide de l’ImageJ. En résumé, ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie pour faciliter les études des maladies neurodégénératives.

Introduction

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La motilité et la distribution mitochondriales jouent un rôle vital dans l’accomplissement des exigences énergétiques variables et spécialisées dans les neurones polarisés. Les neurones peuvent étendre les axones extrêmement longs pour se connecter avec les cibles grâce à la formation de synapses, qui exigent des niveaux élevés d’énergie pour la mise en mémoire tampon Ca2 et les courants ioniques. Le transport des mitochondries de soma à l’axone est essentiel pour soutenir la fonction axonale et synaptique des neurones. Le mouvement mitochondrial dynamique spatialement et temporellement est effectué par le transport axonal rapide à des taux de plusieurs micromètres par seconde1.

Plus précisément, les protéines motrices ou adaptatrices, telles que la kinésie et la dyneine, participent au transport rapide d’organelle le long des microtubules pour contrôler le mouvement des mitochondries2,3. L’activité neuronale normale exige le transport approprié des mitochondries nouvellement assemblées du soma neuronal à l’axone distal (transport axonal antérograde) et au transport inverse des mitochondries de l’axone distal de nouveau au corps cellulaire (transport rétrograde). Des études récentes ont indiqué que l’allocation mitochondriale incorrecte est fortement associée aux défauts neuronaux et aux maladies dégénératives de neurone moteur4,5. Par conséquent, pour disséquer le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence, il est important d’établir des méthodes pour examiner le mouvement mitochondrial le long des axones dans les cultures vivantes.

Il y a deux principaux défis dans l’examen et l’analyse du suivi des mitochondries : (1) identifier les mitochondries à partir de l’arrière-plan dans chaque image, et (2) analyser et générer les connexions entre chaque image. Pour résoudre le premier défi, une approche d’étiquetage de la fluorescence est largement utilisée pour distinguer les mitochondries de l’arrière-plan, comme le colorant MitoTracker ou la transfection de la protéine de ciblage mitochondrial fusionnée à la fluorescence (p. ex. mito-GFP)6,7,8. Pour analyser l’association entre les cadres, plusieurs algorithmes et outils logiciels ont été décrits dans des études antérieures9. Dans un article récent, les chercheurs ont comparé quatre outils automatisés différents (p. ex. Volocity, Imaris, wrMTrck et Difference Tracker) pour quantifier le transport mitochondrial. Les résultats ont montré que, malgré les écarts dans la longueur de la voie, le déplacement mitochondrial, la durée du mouvement et la vitesse, ces outils automatisés sont adaptés pour évaluer la différence de transport après le traitement10. En plus de ces outils, un plugin intégré "Macros" pour ImageJ (écrit par Rietdorf et Seitz) a été largement utilisé pour analyser le transport mitochondrial11. Cette méthode génère des kymographes qui peuvent être utilisés pour analyser le mouvement mitochondrial, y compris la vitesse dans les deux directions antérogrades et rétrogrades.

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui changent constamment de nombre et de morphologie en réponse à des conditions physiologiques et pathologiques. La fission mitochondriale et la fusion régulent étroitement la morphologie mitochondriale et l’homéostasie. Le déséquilibre entre la fission mitochondriale et la fusion peut induire des réseaux mitochondriaux extrêmement courts ou longs, ce qui peut altérer la fonction mitochondriale et entraîner des activités neuronales anormales et la neurodégénérescence. Le transport mitochondrial et la morphologie altérés sont impliqués dans diverses maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et la paraplégie spastique héréditaire (HSP)12,13,14,15. HSP est un groupe hétérogène de troubles neurologiques héréditaires caractérisés par la dégénérescence de la région corticospinal et l’échec ultérieur de contrôler les muscles des membres inférieurs16,17. Dans cette étude, les neurones de cerveau xavant iPSC-dérivés sont employés pour évaluer le transport mitochondrique et la morphologie dans HSP. Cette méthode fournit un paradigme unique pour examiner la dynamique mitochondriale des axones neuronaux dans les cultures vivantes.

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Protocole

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1. Génération de neurones glutamatergiques téencéphaliques à partir d’iPSC

REMARQUE : Le protocole détaillé pour maintenir des iPSC s’est différencié dans les neurones glutamatergiques telencephalic sont semblables à ceux décrits précédemment18. Ici, le processus critique lors de la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines est introduit et mis en évidence.

  1. IPSCs de culture sur les mangeurs embryonnaires de fibroblaste de souris (MEF) dans le milieu humain de cellules souches embryonnaires (hESC) complétés avec le facteur de croissance de fibroblaste (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Après l’incubation avec la dispase (1 mg/mL) pendant 3 min, dissocier les iPSC en petits touffes. Ensuite, la culture des agrégats iPSC en suspension dans le milieu hESC pendant 4 jours. Reportez-vous à ce point de temps, lorsque les iPSC commencent comme la culture de suspension, comme le jour 1 (D1). Changer le milieu tous les jours pendant 4 jours.
  3. À D5, recueillir les agrégats iPSC après centrifugation à 200 x g pendant 2 min et la culture dans les supports d’induction neuronale (NIM) pendant 3 jours. Culture les agrégats cellulaires en suspension pendant 3 jours en changeant la moitié des médias tous les 2 jours. Ajouter Le dMH-1 (2 M) et le SB431542 (2 M) au milieu NIM pour augmenter l’efficacité de l’induction neuronale.
  4. À D8, recueillir les agrégats iPSC après centrifugation à 200 x g pendant 2 min et les laisser adhérer à 6 plaques de puits (environ 20 à 30 agrégats par puits de la plaque) en faisant la culture dans LE NIM avec 10% de FBS (ou avec des plaques enduites de laminin) pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’ancien médium et changez de NIM tous les 2 jours jusqu’à D17.
    REMARQUE : La génération des cellules neuroépithéliales, qui est indiquée par la formation des cellules colonneaires avec des structures de rosette, est observée dans cette période.
  5. À D17, isoler mécaniquement les cellules neuroépithéliales au centre des colonies (se soulevant directement en appliquant une petite pression au centre des colonies) ou enzymatiquement (traitées avec dispase). Transférer les cellules neuroépithéliales isolées sur un flacon T25 de culture tissulaire non traité contenant 8 ml de NIM avec l’ajout de B27 (1x), de cAMP (1 M) et d’IGF (10 ng/mL).
    REMARQUE : La culture de suspension permet aux cellules de former des neurosphères qui sont enrichies avec des progéniteurs neuronaux de projection corticale.
  6. Après D35, plaquez les neurosphères sur la matrice de membrane de membrane de sous-sol de facteur de croissance réduite de facteur de poly-ornithine et de Facteur de LDEV(Table of Materials)-enduit 35 mm des plats de fond en verre pour produire des neurones glutamatergiques telencéphaliques (neurones de projection corticale). Avant le placage, dissocier les neurosphères en petits groupes en couve avec une solution de détachement cellulaire de 1 mg/mL pendant 2 min à 37 oC.
  7. Retirez la solution de détachement cellulaire par centrifugation et suspendez-la en 1 ml de milieu de différenciation neuronale (NDM). Plaques de cellules sur le plat en verre (environ cinq grappes dans 100 'L de milieu par plat) pour les laisser attacher. Ensuite, ajouter NDM (1 mL par plat) et la culture des cellules dans NDM contenant B27 (1x), cAMP (1 M), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL), et GDNF (10 ng/mL).
    REMARQUE : Les petits amas sont plaqués parce qu’ils survivent bien et donnent lieu à de longs neurones de projection. Alternativement, les cellules peuvent être dissociées et plaquées à une densité d’environ 20.000 cellules par plat pour une meilleure séparation.
  8. Caractériser les neurones glutamatergiques telencéphaliques en immunostaining les marqueurs Tbr1 et III-tubulin.

2. Examen du transport mitochondrial le long des axones des neurones glutamatergiques telencéphaliques

  1. Réchauffer le NDM et allumer l’incubateur pour le microscope à fluorescence fixé à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Pour visualiser les mitochondries le long des axones des neurones du cerveau, incubez les neurones avec un colorant fluorescent rouge de 50 nM pour tacher les mitochondries dans les cellules vivantes (p. ex. MitoTracker CMXRos) en NDM pendant 3 min à 37 oC. Ensuite, lavez les cellules 2x avec NDM réchauffé. Les neurones sont incubés dans NDM.
  3. Afin d’enregistrer le transport mitochondrial le long des axones, prenez des images en time-lapse du mouvement mitochondrial en utilisant l’objectif 40x avec un microscope à fluorescence.
    REMARQUE : Pour stabiliser la culture, effectuez l’imagerie cellulaire vivante lorsque les cellules sont incubées dans l’incubateur pendant 20 min après coloration mitochondriale.
  4. Sous le champ de phase, identifier les axones en fonction des caractéristiques morphologiques (émergent directement du corps neuronal de cellules, longues neurites minces constantes sans ramification). Les mitochondries se déplacent dans les sens antérogrades (du corps cellulaire à l’axone distal) et les directions rétrogrades (du terminal axonal au corps cellulaire). Pour distinguer la direction du mouvement mitochondrial le long des axones, identifiez clairement les corps cellulaires des neurones. Dans cette étape, concentrer les axones sous le champ de phase pour réduire le photoblanchiment.
  5. Après avoir distingué le corps cellulaire et l’axone, ajuster le temps d’exposition et la mise au point des mitochondries dans les axones. Ensuite, capturez le transport des mitochondries dans les axones tous les 5 s pour une durée totale de 5 min, donnant 60 images. Capturez au hasard au moins cinq emplacements pour chaque plat et répétez 3x pour chaque groupe.

3. Analyse des données du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones corticaux

REMARQUE : Analyser les données recueillies sur le transport mitochondrial à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (p. ex., ImageJ ou MetaMorph19). Étant donné que ImageJ est facilement disponible, effectuez l’analyse du transport mitochondrial et de la morphologie à l’aide d’ImageJ avec le MultiKymograph, Macros, et Analyze particules plugins.

  1. Analyse du transport mitochondrial à l’aide d’ImageJ
    1. Après avoir capturé les images en time-lapse de la motilité mitochondriale, analyser la vitesse et le mouvement des mitochondries à l’aide du plugin MultiKymograph. Les images sont enregistrées sous forme de fichiers format .tiff, qui sont analysés par le logiciel Fidji suivant une méthode précédemmentrapportée 20.
    2. Téléchargez le logiciel Fidji. Téléchargez des plugins qui seront nécessaires pour analyser la vitesse de déplacement mitochondriale des kymographes. Téléchargez le forfait Bio-formats et Kymograph Plugin avec ces quatre plugins .class, y compris: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, et WalkingAverage.class (Table of Materials). Déplacez ces fichiers vers le dossier de plugins Fidji. Téléchargez des plugins "tsp050706.txt" dans le dossier des plugins. Redémarrez le logiciel Fidji lorsque les fichiers sont déplacés vers le dossier plugins.
    3. Logiciel Open Fiji. Choisissez des plugins, puis importer des images de la série .tiff par Bio-Formats Importer sous Bio-Formats. Assurez-vous de choisir Standard ImageJ dans Stack visualisation, choisissez Ouvrez toutes les séries, vérifier Autoscale, puis cliquez sur OK. Prenez note du nombre d’images et de la taille des images en pixels, qui sont affichées en haut de l’image.
      REMARQUE: Prenez 60 images par image.
    4. Envisagez de rendre les images plus claires en ajustant la luminosité/contraste sous le menu Image pour les 60 images.
    5. Cliquez à droite sur l’outil de ligne pour choisir la ligne segmentée et dessiner une ligne segmentée à partir du corps cellulaire et se terminant à l’axone terminal. Générer le kymographe en choisissant MultipleKymograph sous Plugins. Le choix de la largeur de la ligne est invité après avoir choisi le MultipleKymograph. Assurez-vous qu’il s’agit d’un nombre impair. Choisissez 1 pour la largeur de la ligne. Un kymographe est généré après cette étape.
      REMARQUE : Plusieurs éléments d’information importants peuvent être lus à partir du kymographe. L’axe y du kymographe est le temps de durée (5 min) pour les 60 images. L’axe X représente la position des axones sélectionnés.
    6. Utilisez une ligne diagonale dans le kymographe pour déterminer la direction de mouvement des mitochondries (antérogrades, rétrogrades ou stables). Par exemple, une ligne descendant vers la droite le long de l’axe y indique un mouvement antérograde, et une ligne descendant vers la gauche le long de l’axe y indique un mouvement rétrograde. Une ligne verticale indique qu’il n’y avait aucun mouvement dans la mitochondrie.
    7. Mesurez la distance, les valeurs temporelles et la vitesse des mitochondries en mouvement à l’aide du logiciel Macros plugin in Fiji. Aller à Plugins (fr) Macros - France Installation de l’ire du monde tsp050607.txt. Dessiner une ligne segmentée sur la trace du mouvement mitochondrial sur le kymographe, et toujours tracer la ligne de la région supérieure à inférieure (y-axe).
    8. Après avoir tracé la ligne, rendez-vous chez Plugins. Macros - France lire les vitesses des c. à thé. Étant donné qu’une ligne segmentée le long de la trace est tracée, le plugin indique des vitesses segmentées correspondant à la ligne.
      REMARQUE : L’unité pour toutes les données est pixels. dy sum est le temps consommé à partir du point de départ, et dx sum indique la distance de la mitochondrie se déplaçant dans l’axe x. dy now et dx affiche maintenant la distance de temps et de mouvement de période pour chaque segment, respectivement. vitesse réelle montre la vitesse pour chaque segment (dx maintenant / dy maintenant). la vitesse moyenne indique la vitesse moyenne pour le déplacement mitochondrial (dx sum/dy sum).
    9. Changez l’unité de dx maintenant de pixel à 'm comme le rapport de pixel en 'm en mesurant la barre d’échelle. Convertissez l’appareil pour la distance de pixel à 'm en mesurant les barres d’échelle dans les images. Utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne le long de la barre d’échelle et mesurer la longueur de la ligne en choisissant Mesure » sous « Analyser. Changez l’heure de pixel en secondes, en tant que 1 pixel et 5 secondes dans cette expérience.
    10. Dans le fichier de feuille de calcul, calculez la vitesse moyenne et étiquetez en conséquence le mouvement rétrograde ou antérograde. Moyenne de la vitesse de mouvement antérograde ou rétrograde.
    11. Déterminez le pourcentage de mitochondries fixes et motiles du kymographe. Les mitochondries en mouvement antérogrades ou rétrogrades sont définies comme se déplaçant à 5 m vers l’avant ou vers l’arrière de l’origine pendant toute la période21. Les mitochondries sont considérées comme stationnaires si elles ne se sont pas déplacent de plus de 5 m pendant les 5 min.
  2. Analyse de la morphologie mitochondriale à l’aide d’ImageJ
    REMARQUE : Déterminer la morphologie mitochondriale en mesurant la longueur, la surface et le rapport d’aspect mitochondriaux à l’aide d’ImageJ. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Afin d’analyser la longueur et la zone mitochondriales dans les axones, téléchargez le plugin Straighten_.jar à partir du site Web d’ImageJ (voir Tableau des matériaux) et déplacez-le vers le dossier des plugins. Redémarrer le logiciel ImageJ.
    2. Ouvrez l’image à travers la fonction ouverte sous Fichier et convertissez l’image 32 bits en 8 bits en utilisant Type sous Image.
    3. Tracez une ligne segmentée le long des axones. Choisissez Straighten sous Plugins et définir 50 pixels pour largeur de Filament / Wide Line. Cela générera un axone redressé.
    4. Ajuster le seuil sous Image et définir la mesure sous Analyse en choisissant "Zone Périmètre de l’année Fit ellipse Descripteursde forme .
    5. Mesurez la barre d’échelle à l’aide de la fonction de ligne et définir l’échelle sous Analyze en remplissant la distance en pixel, connaître la distance, et l’unité de longueur. Ensuite, choisissez Global pour définir ce paramètre d’échelle.
    6. Utilisez Analyze Particles under Analyze pour déterminer la zone. Les paramètres rapides sont la taille (pixel 2) ' 0.20'infini, la circularité '0.00'1.00, et le spectacle 'ellipses' . Choisissez les résultats d’affichage.
      REMARQUE : La mesure donnera les résultats de plusieurs paramètres de morphologie mitochondriale, y compris la zone, les périmètres, la longueur (majeur), la largeur (mineur) et le rapport d’aspect (AR). Le nombre mitochondrial correspondant est également répertorié.
    7. Calculer le nombre mitochondrial par axone (m) à l’aide du nombre mitochondrial divisé par longueur axonale.

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Résultats

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Ici, les iPSC humains ont été différenciés en neurones glutamatergiques telencéphaliques, qui ont été caractérisés par l’immunostaining avec des marqueurs de tubuline de Tbr1 et iii (figure 1A). Pour examiner le transport axonal des mitochondries, ces cellules ont été souillées avec le colorant fluorescent rouge, et la formation image de time-lapse a été exécutée. Étant donné que L’ImageJ est facilement disponible et plus facile à obtenir, le transport mitochondrial a été an...

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Discussion

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Cet article décrit une méthode pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie dans les axones neuronaux utilisant le colorant fluorescent rouge et le logiciel d’ImageJ, qui fournissent tous deux une plate-forme unique pour étudier la dégénérescence axonale et la morphologie mitochondriale dans la maladie neurodegenerative. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, y compris la coloration des mitochondries, l’imagerie cellulaire vivante, et l’analyse des images. Dans cette méthode, un colorant fluor...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Spastic Paraplegia, la Fondation Blazer et les NIH (R21NS109837).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de détachement de cellules d’accutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Capot de biosécuritéThermo Scientific1300 SERIES A2
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA-7906
Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeuseThermo ScientificSorvall Legend X1R/
lamellesChemiglass Life Sciences1760-012
Amp cyclique (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec mélange de nutriments F12 (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Supplément sans sérumGemini400-160
Plats à fond en verreMatTekP35G-0.170-14-C
Pipettes en verre 9''VWR14673-043
Facteur neurotrophique dérivé de la glie (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
l’insuline 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Milieu neurobasalGibco21103-049
Acides aminés non essentielsGibco11140-050
N2 NeuroPle Sans sérum SupplémentGemini400-163
Microscope Olympus IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Microscope à contraste de phaseOlympusCKX41/ IX2-SLP
Plaques 6 puitsCorning353046
24 plaquesà puits Corning353047
Bromhydrate de poly-L-ornithine (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Système de filtration sous vide jetable stérile 50ml 0.22 &mu ; m Millipore Express® ; Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &mu ; Anticorps M PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 (1:2000)ChemiconAB9616
Inhibiteur de trypsineGibco17075029
tubes de 50 mlPhenixSS-PH50R
Tubes de 15 mlFlacons PhenixSS-PH15R
T25 (non traités)VWR10861-572
Plugins pour les logiciels
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261Facteur de croissance de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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