Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound

Résumé

Ici nous présentons une méthode de criblage pour la pyrophosphatase membran-liée (de Thermotoga maritima) inhibiteurs basés sur la réaction bleue de molybdène dans un format 96 de plaque de puits.

Résumé

Les pyrophosphatases membranaires (mPPases) sont des enzymes dimériques qui se produisent dans les bactéries, les archées, les plantes et les parasites protistes. Ces protéines censent le pyrophosphate en deux molécules d'orthophosphate, qui est couplée avec le proton et/ou le pompage d'ion de sodium à travers la membrane. Comme aucune protéine homologue ne se produit chez les animaux et les humains, les mPPases sont de bons candidats dans la conception de cibles médicamenteuses potentielles. Ici nous présentons un protocole détaillé pour examiner les inhibiteurs de mPPase utilisant la réaction bleue de molybdène dans un système de plaque de puits 96. Nous utilisons le mPPase de la bactérie thermophile Thermotoga maritima (TmPPase) comme enzyme modèle. Ce protocole est simple et peu coûteux, produisant un résultat cohérent et robuste. Il ne faut qu'environ une heure pour compléter le protocole d'etoile d'activité depuis le début de l'assiduité jusqu'à la mesure de l'absorption. Étant donné que la couleur bleue produite dans cet analyse est stable pendant une longue période de temps, l'analyse ultérieure peut être effectuée immédiatement après le lot précédent, et l'absorption peut être mesurée plus tard pour tous les lots à la fois. L'inconvénient de ce protocole est qu'il est fait manuellement et peut donc être épuisant ainsi que nécessitent de bonnes compétences de pipetage et de temps. De plus, la solution de citrate d'arsenit utilisée dans cet assay contient de l'arsénite de sodium, qui est toxique et doit être manipulée avec les précautions nécessaires.

Introduction

Environ 25 % des protéines cellulaires totales sont des protéines membranaires et environ 60 % d'entre elles sont des cibles médicamenteuses^1,2. L'une des cibles médicamenteuses potentielles³, pyrophosphatases membranaires (mPPases), sont des enzymes dimériques qui pompent le proton et/ou l'ion de sodium à travers la membrane par hydrolyse de pyrophosphate en deux orthophosphates⁴. mPPases peut être trouvé dans divers organismes⁵ tels que les bactéries, archées, plantes, et les parasites protistes, à l'exception des humains et des animaux<....

Protocole

1. Préparation des protéines

REMARQUE: L'expression et la purification de TmPPase a été décrite ailleurs¹³.

1. Préparer 10 ml de la solution tampon de réactivation contenant 20 mM 2-( N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), et 0.05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Préparer 10 ml du mélange de réaction contenant 200 mM Tris-Cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl₂, 333 mM KCl, et 67 mM NaCl.
   REMARQUE : Mg^2est nécessaire pour chélater le pyrophosphate comme substrat de mPPase, K^- est nécessaire pour augmenter l'activité enzymat....

Résultats

Dans ce protocole, huit composés (1 à 8) ont été testés (figure 2A) avec IDP, un inhibiteur commun des pyrophosphatases, comme un contrôle positif. Chaque composé a été testé à trois concentrations différentes (1 M, 5 M et 20 M) en triple. Le flux de travail de la présélection est représenté à la figure 1, à partir de la préparation de l'échantillon et du réactif jusqu'à la mesure de l'absorption à 860 nm.

À la fin de ce protocole, ap.......

Discussion

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage simple des inhibiteurs pour la pyrophosphatase membranaire-liée de T. maritima dans un format 96 de plaque de puits basé sur Vidilaseris et autres¹⁴. Ce protocole est peu coûteux et basé sur l'acide 12-phosphomolybd, qui est formé à partir d'orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides et réduit à des espèces de phosphomolybdène avec une couleur bleue distincte¹². Cette méthode est préférée à .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille d’étanchéité adhésive	Thermo Scientific	AB0558
Heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté	Merck	F1412481 636
Acide ascorbique	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)	Merck	1167431000
Bandelettes de tubes PCR 8 puits 0,2 ml sans bouchons (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodécyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Éthanol	Merck	1009901001
Acide acétique glacial	Merck	1000631011
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodique sel	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-&alpha ;-Phosphatidylcholine issue de la lécithine de soja	Sigma	429415-100GM
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plaques	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrène Boîte de Pétri (taille 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Chlorure de potassium	Logiciel Merck	104936
Prism 6 GraphPad
QBT2 Bloc chauffant	Grant Instruments
Méta-arsénite de sodium	Fisher Chemical
Phosphate de sodium dibasique (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Pyrophosphate de sodium dibasique	Fluka	71501-100G
Citrate trisodique dihydraté	Fluka	71404-1KG

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