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Article de méthode

Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound

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DOI :

10.3791/60619

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23 novembre 2019

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1Research Program in Molecular and Integrative Biosciences, University of Helsinki, 2Drug Research Program, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, 3School of Biomedical Sciences and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici nous présentons une méthode de criblage pour la pyrophosphatase membran-liée (de Thermotoga maritima) inhibiteurs basés sur la réaction bleue de molybdène dans un format 96 de plaque de puits.

Résumé

Les pyrophosphatases membranaires (mPPases) sont des enzymes dimériques qui se produisent dans les bactéries, les archées, les plantes et les parasites protistes. Ces protéines censent le pyrophosphate en deux molécules d'orthophosphate, qui est couplée avec le proton et/ou le pompage d'ion de sodium à travers la membrane. Comme aucune protéine homologue ne se produit chez les animaux et les humains, les mPPases sont de bons candidats dans la conception de cibles médicamenteuses potentielles. Ici nous présentons un protocole détaillé pour examiner les inhibiteurs de mPPase utilisant la réaction bleue de molybdène dans un système de plaque de puits 96. Nous utilisons le mPPase de la bactérie thermophile Thermotoga maritima (TmPPase) comme enzyme modèle. Ce protocole est simple et peu coûteux, produisant un résultat cohérent et robuste. Il ne faut qu'environ une heure pour compléter le protocole d'etoile d'activité depuis le début de l'assiduité jusqu'à la mesure de l'absorption. Étant donné que la couleur bleue produite dans cet analyse est stable pendant une longue période de temps, l'analyse ultérieure peut être effectuée immédiatement après le lot précédent, et l'absorption peut être mesurée plus tard pour tous les lots à la fois. L'inconvénient de ce protocole est qu'il est fait manuellement et peut donc être épuisant ainsi que nécessitent de bonnes compétences de pipetage et de temps. De plus, la solution de citrate d'arsenit utilisée dans cet assay contient de l'arsénite de sodium, qui est toxique et doit être manipulée avec les précautions nécessaires.

Introduction

Environ 25 % des protéines cellulaires totales sont des protéines membranaires et environ 60 % d'entre elles sont des cibles médicamenteuses1,2. L'une des cibles médicamenteuses potentielles3, pyrophosphatases membranaires (mPPases), sont des enzymes dimériques qui pompent le proton et/ou l'ion de sodium à travers la membrane par hydrolyse de pyrophosphate en deux orthophosphates4. mPPases peut être trouvé dans divers organismes5 tels que les bactéries, archées, plantes, et les parasites protistes, à l'exception des humains et des animaux4. Chez les parasites protistes, par exemple Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii et Trypanosoma brucei, mPPases sont essentiels pour la virulence parasite6 et KO de cette expression dans les parasites conduire à l'échec dans le maintien du pH intracellulaire lors de l'exposition au pH de base externe7. En raison de leur importance et du manque de protéines homologues présentes chez les vertébrés, les mPPases peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour les maladies protistales3.

Le dépistage in vitro des inhibiteurs du mPPase dans ce travail est basé sur un système de modèle TmPPase. TmPPase est un pompage d'ion de sodium et de potassium ion dépendant mPPase de T. maritima et a son activité optimale à 71 c8. Les avantages de cette enzyme sont par exemple sa facilité de production et de purification, une bonne stabilité thermique et une activité spécifique élevée. TmPPase montre à la fois une forte similitude en plus de la conservation complète de la position ainsi que l'identité de tous les résidus catalytiques à la mPPases protiste3,9 et à la structure résolue de Vigna radiata10 mPPase. Les structures disponibles de TmPPase dans différentes conformations sont également utiles pour l'expérience de conception de médicaments basée sur la structure (comme le dépistage virtuel et la conception de novo).

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage des inhibiteurs de TmPPase dans un format de plaque de puits 96 (figure 1). Le protocole est basé sur la méthode colorimétrique de la réaction bleu molybdène, qui a d'abord été développé par Fiske et Subbarow11. Cette méthode implique la formation d'acide phosphomolybdique 12-phosphomolybd à partir d'orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides, qui est ensuite réduite pour donner des espèces caractéristiques de phosphomolybdène de couleur bleue12.

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Protocole

1. Préparation des protéines

REMARQUE: L'expression et la purification de TmPPase a été décrite ailleurs13.

  1. Préparer 10 ml de la solution tampon de réactivation contenant 20 mM 2-( N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), et 0.05% dodecyl maltoside (DDM).
  2. Préparer 10 ml du mélange de réaction contenant 200 mM Tris-Cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl, et 67 mM NaCl.
    REMARQUE : Mg2est nécessaire pour chélater le pyrophosphate comme substrat de mPPase, K- est nécessaire pour augmenter l'activité enzymatique car TmPPase est un mPPase dépendant du potassium, et Naest nécessaire pour l'activité enzymatique pendant la translocation d'ion de sodium par TmPPase.
  3. Préparer des liposomes de 30 mg/mL pour la réactivation des enzymes.
    1. Ajouter 10 ml de 20 mL de tris-HCl pH 8,0 avec 1 mM DTT à 0,3 g de L-phosphatidylcholine du soja à 10 ml de 20 mM Tris-HCl pH 8,0 avec 1 mM DTT.
    2. Mettre le liposome sur la glace, et sonicate avec 1 seconde d'intervalle d'impulsion pendant 1 minute, pause pendant 1 minute, et répéter jusqu'à ce que la solution devienne jaune transparent.
    3. Aliquot les liposomes, congeler dans l'azote liquide et stocker à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient utilisés.
  4. Réactiver l'enzyme.
    1. Mélanger 40 L de la solution liposomes avec 22,5 'L de 20% DDM.
    2. Chauffer le mélange à 55 oC pendant 15 min et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Ajouter 36,5 L de la solution tampon de réactivation, mélanger et ajouter 1 l de protéines concentrées (13 mg/mL) pour obtenir une concentration totale de 0,13 mg/mL.
      REMARQUE : Les protéines sont habituellement congelées dans des aliquots de 10 l après la purification et décongelées sur la glace avant utilisation.
  5. Prendre 20 ll de l'enzyme réactivée et ajouter à 1 480 l l du mélange de réaction, puis mélanger doucement.
    REMARQUE : L'ajout de l'enzyme réactivée au mélange de réaction doit être effectué juste avant qu'il ne soit utilisé.

2. Préparation composée

  1. Dissoudre les composés dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire des solutions de stock de 25 à 100 mm dans 50'200 'L, en fonction de la disponibilité des composés.
    REMARQUE: Tous les composés utilisés ici (Figure 2A) ont été publiés précédemment9. Si la solubilité composée est faible, la concentration du stock peut être ajustée en conséquence.
  2. Préparer trois concentrations différentes de chaque composé dans l'eau.
    REMARQUE : Les concentrations finales dans le mélange de réaction seront 1, 5, et 50 micromolaires ou 1, 5, et 20 micromolar pour les composés solubles et avec parcimonie soluble, respectivement.
    1. Diluer la solution de bouillon avec de l'eau à 1 ml dans des microtubes pour donner 2 M, 10 M et 100 M pour les composés solubles, ou alternativement 2 M, 10 M et 40 M pour les composés solubles avec parcimonie.
    2. Vortex la solution composée instantanément après dilution de la solution de stock pour un bon mélange.
  3. Vérifiez l'agrégation composée à l'aide d'un néphélomètre.
    REMARQUE : Ceci a été étudié sous forme de triplitaux en trois concentrations (1 M, 5 M et 20 M) et normalisé au blanc dans une plaque de puits de 96.
    1. Distribuer 75 l de mélange de réaction dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
    2. Ajouter 75 lde de chaque composé (pour le blanc, utiliser 75 l'eau à la place) et mélanger par pipetting de haut en bas de 5 degrés.
    3. Mesurer chaque puits à 300 V à l'aide d'un néphélomètre microplaque.

3. Réactifs pour la préparation de l'essai

  1. Préparer la solution arsenit-citrate.
    1. Peser 5 g d'arsénite de sodium et 5 g de dihydrate de citrate trisodique.
      CAUTION: L'arsénite de sodium est toxique, donc utiliser un équipement de protection approprié et manipuler avec un soin particulier. Par mesure de précaution, ne pas gérer avant que toutes les précautions de sécurité nécessaires ont été lus et compris. Manipuler uniquement dans un capot de fumée afin de ne pas inhaler la poussière / vapeurs du composé ou de sa solution. En cas d'inhalation, passer à l'air frais et obtenir des soins médicaux. Portez des lunettes de sécurité chimiques appropriées, des gants de protection et des vêtements pour éviter l'ingestion et le contact entre les yeux et la peau. S'il est avalé, appelez immédiatement un centre antipoison ou un médecin/médecin. Si elle obtient sur la peau ou dans les yeux, laver avec beaucoup d'eau et obtenir des soins médicaux.
    2. Dissoudre dans 100 ml d'eau.
    3. Ajouter 5 ml d'acide acétique glaciaire, mélanger et ajouter de l'eau à 250 ml.
    4. Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière.
      REMARQUE : La solution est stable depuis plus d'un an.
  2. Préparer la solution A et la solution B.
    1. Pour la solution A, ajouter 10 ml de glace froide de 0,5 M HCl à 0,3 g d'acide ascorbique. Dissoudre l'acide ascorbique par vortexing.
    2. Pour la solution B, ajouter 1 ml d'eau glacée à 70 mg d'hélimonium d'hélimolygène tétrahydrate et vortex pour se dissoudre.
      REMARQUE : Conservez les deux solutions sur la glace jusqu'à l'utilisation. Pour la cohérence du résultat d'analyse, les deux solutions peuvent être stockées sur la glace pendant un maximum d'une semaine.
  3. Préparer la norme de phosphate (Pi) avec la concentration de 0 M, 62,5 M, 250 M et 500 M pour l'étalonnage.
    1. Ajouter 0 l, 25 l, 50 'L et 100 'L de 5 mM Na2HPO4 dihydrater à quatre microtubes contenant 370 'L du mélange de réaction.
    2. Garnir jusqu'à 1 ml d'eau.

4. Suivi d'activité pour une plaque de puits de 96

REMARQUE : Voir la figure 1 pour le flux de travail schématique de l'assay.

  1. Ajouter 1 ml de solution B à 10 ml de solution A, mélanger par vortex et stocker la solution sur la glace.
    REMARQUE : Cette solution doit être transparente et jaune. Conserver la solution A et B sur la glace pendant au moins 30 minutes avant l'utilisation. Cependant, utilisez la solution dans les 3 h car elle ira mal après stockage à long terme.
  2. Ajouter 40 'L de 0 'M, 62,5 'M, 250 'M et 500 'MP i standard aux bandes de tube en tripler à l'aide d'une pipette multicanal.
    REMARQUE: Le mélange de réaction sans Pj'ai ajouté sera utilisé comme un blanc.
  3. Ajouter 25 l de solution composée aux bandes de tube à l'aide d'une pipette multicanal.
    REMARQUE : Chaque composé a trois concentrations différentes dans le triplicate qui est assez pour l'estimation initiale de la concentration inhibitrice moitié maximale (IC50). Pour une détermination IC50 plus précise, huit concentrations composées différentes peuvent être utilisées. Pour l'enzyme décomplexée, la solution composée est remplacée par une quantité égale d'eau. Comme contrôles positifs 2,5 M, 25 m, et 250 M de sel de sodium imidodiphosphate (IDP) ont été utilisés.
  4. Ajouter 15 ll de mélange de solution mPPase aux bandes de tube (sauf aux tubes contenant la norme Pi) à l'aide d'une pipette multicanal.
  5. Scellez les bandes tubulaires à l'effile d'étanchéité adhésive. Couper la feuille d'étanchéité pour séparer chaque bande tubulaire.
  6. Pré-incuber les échantillons pendant 5 min à 71 oC. Placez les échantillons sur le bloc de chauffage avec un intervalle de 20 s entre chaque bande afin de minimiser la consommation de temps pendant les étapes suivantes.
  7. Pour chaque bande, ouvrir l'étanchéité adhésive. Ajouter 10 l de 2 mm de dibasic pyrophosphate de sodium à l'aide d'une pipette multicanal et mélanger en pipetting de haut en bas pour 5 degrés. Scellez à nouveau la bande tubulaire en utilisant le même scellement.
    REMARQUE: Cette étape pourrait initialement être difficile à accomplir en 20 s; cependant, il deviendra plus facile après quelques essais.
  8. Incuber à 71 oC pendant 5 min.
  9. Placer les échantillons sur l'appareil de refroidissement avec un intervalle de 20 s entre chaque bande. Laisser refroidir pendant 10 min, mais centrifuger chaque bande peu après 5 min de refroidissement, pour décander les gouttes d'eau sous la feuille d'étanchéité, puis le remettre à l'appareil de refroidissement et enlever l'étanchéité.
    REMARQUE : L'appareil de refroidissement peut simplement être fabriqué en plaçant une plaque PCR de 96 puits sur un plat Petri en polystyrène (taille 150 mm et 15 mm) rempli d'eau et congelé pendant au moins 1 h. L'appareil doit être retiré du congélateur environ 5 minutes avant le début de l'assidu. Ne pas sortir l'appareil de refroidissement juste avant le refroidissement de l'échantillon car il va geler le mélange de réaction et entraver le développement des couleurs.
  10. Après 10 min de refroidissement, ajouter 60 l de la solution A et B, mélanger par pipetting de haut en bas pendant 5 degrés et garder les bandes de tube sur l'appareil de refroidissement pendant 10 min.
  11. Ajouter 90 oL de la solution de citrate d'arsénite et conserver à température ambiante pendant au moins 30 min pour produire une couleur bleue stable.
    CAUTION: En raison de sa toxicité, toutes les solutions contenant de l'arsénite de sodium doivent être manipulées avec une attention supplémentaire en tout temps. Ainsi, l'ajout de la solution de citrate d'arsénite devrait être fait dans une hotte de fumée.
  12. Distribuer 180 l de chaque mélange de réaction dans une microplaque claire de 96 puits de polystyrène.
  13. Mesurer l'absorption de chaque puits à 860 nm à l'aide d'un spectrophotomètre microplaque.

5. Analyse des résultats

  1. Moyenne des tripliques de chaque échantillon et des normes Pi. Ensuite, soustrayez avec le blanc pour éliminer le signal d'arrière-plan.
  2. Faire une courbe d'étalonnage en traçant les valeurs d'absorption (A860) par rapport à la quantité de norme Pi (nmol) et effectuer une régression linéaire pour obtenir la fonction trendline en utilisant la formule suivante :
    figure-protocol-1
  3. Calculez la quantité de phosphate (nmol) libérée de la réaction enzymatique en fonction de la formule de régression linéaire ci-dessus.
  4. Calculez l'activité spécifique à l'aide de la formule suivante :
    figure-protocol-2
    où nPi est la quantité de phosphate libérée par la réaction (nmol), t est le temps de réaction (min), et mTmPPase est la quantité de TmPPase pur utilisé dans l'assay (mg).
  5. Calculez l'activité en pourcentage pour chaque concentration d'inhibiteurs à l'aide de la formule suivante :
    figure-protocol-3
    où SAiis l'activité spécifique d'un échantillon avec inhibiteur et SAun est l'activité spécifique de l'échantillon décomplexé.
  6. Calculez le logIC50 (estimation) et ic50 (estimation) avec un ajustement de régression non linéaire de la courbe dose-réponse à quatre paramètres en utilisant la formule suivante :
    figure-protocol-4
    où X est log de concentration (M), Y est activité (%), Top et Bottom sont des plateaux dans la même unité que Y (100% et 0%, respectivement), logIC50 a les mêmes unités de notation que X, et HillSlope - facteur de pente ou pente de colline, qui est unitaire.
    REMARQUE: Logiciel (Tableau des Matériaux) est utilisé pour le montage. Utilisez la concentration de 0,01 M (au lieu de 0,00 M) pour l'échantillon sans inhibiteur car le logarithme de zéro n'est pas défini.

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Résultats

Dans ce protocole, huit composés (1 à 8) ont été testés (figure 2A) avec IDP, un inhibiteur commun des pyrophosphatases, comme un contrôle positif. Chaque composé a été testé à trois concentrations différentes (1 M, 5 M et 20 M) en triple. Le flux de travail de la présélection est représenté à la figure 1, à partir de la préparation de l'échantillon et du réactif jusqu'à la mesure de l'absorption à 860 nm.

À la fin de ce protocole, ap...

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Discussion

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage simple des inhibiteurs pour la pyrophosphatase membranaire-liée de T. maritima dans un format 96 de plaque de puits basé sur Vidilaseris et autres14. Ce protocole est peu coûteux et basé sur l'acide 12-phosphomolybd, qui est formé à partir d'orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides et réduit à des espèces de phosphomolybdène avec une couleur bleue distincte12. Cette méthode est préférée à ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation Jane et Aatos Erkko et du BBSRC (BB/M021610) à Adrian Goldman, l'Académie de Finlande (no 308105) à Keni Vidilaseris, (no 310297) à Henri Xhaard, et (no 265481) à Jari Yli-Kauhaluoma, et les fonds de recherche de l'Université d'Helsinki à Gustav Boije af Genns. Les auteurs remercient Bernadette Gehl pour son aide technique pendant le projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille d’étanchéité adhésiveThermo ScientificAB0558
Heptamolybdate d’ammonium tétrahydratéMerckF1412481 636
Acide ascorbiqueSigma-Aldrich95212-250G
BioLite 96Well MultidishThermo Scientific130188
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)Merck1167431000
Bandelettes de tubes PCR 8 puits 0,2 ml sans bouchons (120)Nippon geneticsFG-028
Dodécyl maltoside (DDM)MelfordB2010-100G
ÉthanolMerck1009901001
Acide acétique glacialMerck1000631011
Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich258148-500ML
Imidodiphosphate sodique selSigma-AldrichI0631-1G
L-&alpha ;-Phosphatidylcholine issue de la lécithine de sojaSigma429415-100GM
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich8147330500
Multiplate 96-Well PCR PlaquesBio-RadMLL9651
MultiSkan GoThermo Scientific10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)Labsystems
Polystyrène Boîte de Pétri (taille 150 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5981-100EA
Chlorure de potassiumLogiciel Merck104936
Prism 6 GraphPad
QBT2 Bloc chauffantGrant Instruments
Méta-arsénite de sodiumFisher Chemical
Phosphate de sodium dibasique (Pi)SigmaS0876-1KG
Pyrophosphate de sodium dibasiqueFluka71501-100G
Citrate trisodique dihydratéFluka71404-1KG
12897692

Références

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