Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Hirofumi Nishizono; Mohamed Darwish; Hideki Uosaki; Nanami Masuyama; Motoaki Seki; Hiroyuki Abe; Nozomu Yachie; Ryohei Yasuda

doi:10.3791/60808

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Article de méthode

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

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DOI :

10.3791/60808

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2 avril 2020

Hirofumi Nishizono^*¹^,²^,³ , Mohamed Darwish^*⁴^,⁵ , Hideki Uosaki⁶^,⁷ , Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰ , Motoaki Seki⁸^,¹¹ , Hiroyuki Abe³ , Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³ , Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Résumé

L’utilisation de souris génétiquement modifiées (GM) est devenue cruciale pour comprendre la fonction génétique et déchiffrer les mécanismes sous-jacents des maladies humaines. Le système CRISPR/Cas9 permet aux chercheurs de modifier le génome avec une efficacité, une fidélité et une simplicité sans précédent. Exploitant cette technologie, les chercheurs sont à la recherche d’un protocole rapide, efficace et facile pour générer des souris GM. Ici, nous introduisons une méthode améliorée pour la cryoconservation des embryons à une cellule qui conduit à un taux de développement plus élevé des embryons gongés. En le combinant avec des conditions d’électroporation optimisées, ce protocole permet la génération de souris knock-in et knock-in avec une efficacité élevée et de faibles taux de mosaïque dans un court laps de temps. De plus, nous montrons une explication étape par étape de notre protocole optimisé, couvrant la préparation des réactifs CRISPR, la fécondation in vitro, la cryoconservation et le dégel des embryons à une cellule, l’électroporation des réactifs CRISPR, la génération de souris et le génotypage des fondateurs. Grâce à ce protocole, les chercheurs devraient être en mesure de préparer les souris GM avec une facilité, une vitesse et une efficacité inégalées.

Introduction

Le système de répétitions palindromiques courtes et interpatiales groupées régulièrement interpatial (CRISPR)/CRISPR-associé à la protéine 9 (Cas9) est une percée scientifique qui apporte une modification ciblée sans précédent dans le génome¹. Le système CRISPR/Cas9 est composé de protéines Cas9 et d’ARN guide (ARN) avec deux composants moléculaires : un ARN CRISPR (crRNA) spécifique à la cible et un ARN CRISPR (tracrRNA) transactivant² . Un ARN dirige la protéine Cas9 vers le locus spécifique du génome, 20 nucléotides complémentaires au crRNA et adjacents au motif adjacent au protoespacer (PAM). La protéine Cas9 se lie ....