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Article de méthode

Induire Hairy Roots par Agrobacterium rhizogenes-Transformation médiatisée dans le sarrasin tartarié (Fagopyrum tataricum)

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DOI :

10.3791/60828

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11 mars 2020

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1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode d’induire des racines poilues par Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée dans le sarrasin tartarinaire (Fagopyrum tataricum). Ceci peut être employé pour étudier des fonctions de gène et la production des métabolites secondaires dans le sarrasin de tartari, être adopté pour n’importe quelle transformation génétique, ou employé pour d’autres usines médicinales après amélioration.

Résumé

Le sarrasin tartari (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possède diverses activités biologiques et pharmacologiques parce qu’il contient d’abondantes métabolites secondaires comme les flavonoïdes, en particulier la rutine. Les rhizogenes agrobacterium ont été progressivement utilisés dans le monde entier pour induire des racines poilues dans les plantes médicinales afin d’étudier les fonctions génétiques et d’augmenter le rendement des métabolites secondaires. Dans cette étude, nous avons décrit une méthode détaillée pour générer des racines poilues A. rhizogenes-négociéesdans la tuberculose. Les cotyledons et l’axe hypocotyledonaire à 7-10 jours ont été sélectionnés comme explants et infectés par A. rhizogenes portant un vecteur binaire, qui a induit des racines poilues aventieuses qui sont apparues après 1 semaine. La transformation de racine poilue générée a été identifiée basée sur la morphologie, la sélection de résistance (kanamycine), et l’expression de gène de reporter (protéine fluorescente verte). Par la suite, les racines poilues transformées ont été auto-propagées au besoin. Pendant ce temps, un facteur de transcription de myéloblastose (MYB), FtMYB116, a été transformé en génome de la tuberculose à l’aide des racines poilues A. rhizogenespour vérifier le rôle de FtMYB116 dans la synthèse des flavonoïdes. Les résultats ont montré que l’expression des gènes liés aux flavonoïdes et le rendement des composés flavonoïdes (rutin et quercetine) étaient significativement (p-lt; 0,01) promues par FtMYB116, ce qui indique que les racines poilues À médiation de A. rhizogenespeuvent être utilisées comme un outil alternatif efficace pour étudier les fonctions génétiques et la production de métabolites secondaires. Le protocole détaillé étape par étape décrit dans cette étude pour générer des racines poilues peut être adopté pour toute transformation génétique ou d’autres plantes médicinales après ajustement.

Introduction

Le sarrasin tartari (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) est un type de dicotyledon appartenant au genre Fagopyrum et à la famille Polygonaceae1. Comme un type de médecine chinoise aliments homologues, la tuberculose a reçu un intérêt considérable en raison de sa composition chimique distinctive et diverses bioactivités contre les maladies. La tuberculose est principalement riche en glucides, protéines, vitamines et caroténoïdes ainsi que dans les polyphénols tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes1. Diverses activités biologiques et pharmacologiques de flavonoïdes, y compris antioxydatif, antihypertenseur2, et anti-inflammatoire ainsi que les propriétés anticancéreuses et antidiabétiques, ont été démontrées3.

Agrobacterium rhizogenes est une bactérie du sol qui contribue au développement de la maladie des racines poilues dans plusieurs plantes supérieures, en particulier les dicotyledons, en infectant les sites de blessures4,5. Ce processus est initié par le transfert de l’ADN T dans le plasmide5,6 et est généralement accompagné par l’intégration et l’expression d’un gène exogène du plasmide Ri et les étapes suivantes de la génération du phénotype racinepoilue 7. A. rhizogenes- racines poilues transgéniques négociées, comme un outil puissant dans le domaine de la biotechnologie végétale, ont été les plus largement utilisés en raison de leur productivité stable et élevée et l’obtention facile dans une courte période. En outre, les racines poilues induites par A. rhizogenes se distinguent efficacement par leur développement de racine plagiotropic et la croissance très ramifiée dans un milieu sans hormones8. Ils peuvent être utilisés dans plusieurs domaines de recherche, y compris la production de semences artificielles, la recherche sur les nodules racines, et dans l’étude des interactions avec d’autres organismes tels que les champignons mycorrhiziens, les nématodes et les agents pathogènes racinaires7,9. En outre, les cultures de transformation des racines poilues ont été largement utilisées comme un système expérimental pour étudier les voies biochimiques et la signalisation chimique et pour produire des métabolites secondaires végétaux qui sont utilisés comme produits pharmaceutiques, cosmétiques et additifs alimentaires8,10. Les précieux métabolites secondaires, y compris les alcaloïdes indole, les aconites, les alcaloïdes tropanes, les terpenoïdes et les flavonoïdes, synthétisés dans des racines poilues de type sauvage ont été étudiés pendant plusieurs décennies chez de nombreuses espèces, telles que le ginsenoside dans Panax ginseng11, coumarine à Ammi majus12, et les composés phénoliques TBs en2,13.

Des racines poilues ont été produites à l’aide de rhizogenes A. chez 79 espèces végétales de 27 familles14. Par exemple, A. rhizogenes-médiaté transformation des racines poilues a été signalé dans le soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, et chicorée (Cichorium intybus L.) 20. La transformation des racines poilues de la tuberculose a également fait l’objet d’une enquête2. Peu de protocoles détaillés sont disponibles concernant le développement de racines poilues médiées par A. rhizogenes portant un vecteur binaire ou non. Par exemple, Sandra et coll.21 ont introduit une méthode de production de racines poilues transgéniques de pommes de terre soutenues dans les pousses de type sauvage. Les racines poilues entièrement développées pourraient être visualisées 5-6 semaines après l’injection de A. rhizogenes portant le gène de journaliste de gus dans les internodes de tige des usines de pomme de terre. Une autre étude avait également rapporté un système transgénique racine poilue induit par A. rhizogenes hébergeant le gène gusA journaliste en jute (Corchorus capsularis L.) 22. En outre, Supaart et coll.23 ont obtenu des racines poilues transgéniques de tabac utilisant1 A. rhizogenes transformés avec le vecteur d’expression pBI121 portant le gène de la synthase d’acide tétrahydrocannabinolic (THCA) pour produire THCA.

Cependant, un processus étape par étape pour une génération efficace de transformation des racines poilues, en particulier dans la tuberculose, a été relativement moins démontré. Dans cette étude, nous avons décrit un protocole détaillé utilisant A. rhizogenes portant le gène reporter (GFP), un marqueur sélectif (Kan), et un gène d’intérêt (b4, un gène identifié de notre groupe mais un gène non publié de base helix-boucle-helix (bHLH) famille) pour générer la transformation génétique de racine poilue dans la tuberculose. L’expérience a duré 5-6 semaines, de l’inoculation des graines à la génération de racines poilues, impliquant la préparation expling, l’infection, la coculturation, la sous-culture, et la propagation subséquente. En outre, A. rhizogenes contenant un plasmide binaire portant le transgénique de la tuberculose du facteur de transcription de myéloblastose 116 (FtMYB116) a été employé pour déterminer si FtMYB116 peut favoriser l’accumulation de flavonoïdes, particulièrement la rutine, dans la tuberculose au niveau génétique et métabolique par la transformation de racine poilue de la tuberculose. FtMYB116, qui est un facteur transcriptionnel induit par la lumière, régule la synthèse de la rutine dans différentes conditions de lumière5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3'-hydroxylase (F3'H), et flavonol synthase (FLS)24 sont des enzymes clés impliquées dans la voie métabolique de la biosynthèse de rutine. Par conséquent, cette étude démontre la surexpression de FtMYB116 dans les racines poilues de la tuberculose et l’expression de gènes enzymatiques clés ainsi que le contenu de la rutine et d’autres flavonoïdes tels que la quercétine.

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Protocole

La tuberculose utilisée dans cette étude a été nommée BT18, qui provenait de la race de "JinQiao No.2" cultivée par le Centre de recherche de petits grains divers de l’Académie Shanxi des sciences agricoles. Les principales étapes de ce protocole sont illustrées dans la figure 1.

REMARQUE : Utilisez rapidement la manipulation liée aux explantations et, si possible, gardez les plats Petri fermés pour éviter le flétrissement et la contamination. Sauf indication contraire, toutes les incubations explantées ont été effectuées sous l’état d’une lumière de 14 h et d’un photopériod foncé de 10 h à 25 oC. Sauf indication contraire, toutes les explants ou les opérations liées aux bactéries ont été effectuées dans des conditions aseptiques dans un capot de flux laminaire. Tous les ingrédients médiatiques des rhizogènes A. et des cultures végétales in vitro sont fournis dans le tableau 1. Après ajustement du pH, tous les supports ont été autoclaved à 120 oC pendant 20 min. Les médias solidifiés ont été préparés en remplissant 25 ml de milieu dans un plat Petri de 9 cm de diamètre et en lui permettant de se solidifier.

CAUTION : Déposez toutes les bactéries et les plantes génétiquement modifiées dans le conteneur de déchets approprié. Utilisez tous les produits chimiques dangereux dans un placard à fumée et déposez-les dans le conteneur de déchets dangereux.

1. Préparation des explants de la tuberculose

  1. Préparation des graines de tuberculose
    1. Sélectionnez des graines tuberculeuses dodues et intactes(figure 1A1) qui ont été conservées à une température inférieure à 20 oC depuis au plus deux ans.
    2. Faire tremper les graines dans l’eau à 28 oC pendant environ 20 minutes afin que la couche de graines puisse être facilement décollée(figure 1A2). Si nécessaire, utilisez des ciseaux pour couper une fente sur les graines pour faciliter l’épluchage.
  2. Stérilisation des graines tuberculeuses
    1. Placer les graines pelées de 100 à 200 mL dans un flacon conique stérilisé de 100 ml.
    2. Désinfecter les graines à l’aide de 75 % d’éthanol pour 30 s.
    3. Remplacer l’éthanol par 5 % d’hypochlorite de sodium et désinfecter 15 min.
      REMARQUE : La désinfection à l’aide du bichlorure de mercure à une concentration de 1 g/L pendant 8 min peut être utilisée comme stérilisateur alternatif pour remplacer l’hypochlorite de sodium dans tous les cas de stérilisation inadéquate.
      CAUTION : Le bichlorure de mercure est dangereux et non un matériau respectueux de l’environnement. Faites-le fonctionner dans l’armoire fumante et déposez-la dans le conteneur de déchets dangereux, si le bichlorure de mercure est utilisé dans tous les cas.
    4. Verser l’hypochlorite de sodium.
    5. Laver les graines à l’aide d’eau déionisée stérile 5 fois.
    6. Blot les graines sèches avec un papier bibulous stérile.
  3. Préparation des semis de la tuberculose
    1. Préparer 50 ml de milieu basal Murashige et Skoog (MS) (1962) complété par 30 g/L de saccharose et de poudre d’agar de 7 g/L (MSSA) (tableau 1) dans une bouteille de culture des tissus végétaux de 300 ml.
    2. Ajuster le pH à 5,8 avant de le faire.
    3. Distribuer 10 graines uniformément par bouteille de milieu MSSA.
    4. Germer les graines dans une salle de culture à 25 oC à 1 oC sous la légère condition pendant 7-10 jours.
  4. Préparation d’explants stériles
    1. Sélectionnez des semis robustes de la tuberculose(figure 1C), lorsque les 2 morceaux de cotyledons sont dépliés.
    2. Couper les semis des racines(figure 1C pointes de flèche rouge),éviter tout contact avec le milieu.
    3. Placez-les dans un plat stérile Petri.
    4. Couper les hypocotyls en segments de 0,8 à 1 cm et tondre les cotyledons en morceaux d’environ 0,5 cm.
    5. Préculture ces explants sur le milieu MSSA sous l’état de lumière pendant 24 h.
    6. Transférez-les dans un flacon conique stérilisé de 100 ml, qui sont maintenant prêts pour l’infection.

2. Préparation de A. rhizogenes pour la transformation

REMARQUE : La souche A. rhizogenes ACCC10060 a été gentiment fournie par l’Institut de développement de plantes médicinales et conservée à 80 oC. A. rhizogenes a été transformé avec le vecteur binaire pK7GWIWG2D (II) qui abrite un ADN T portant le gène b4 accompagnant un GFP comme gène indicateur et le gène de résistance Kan comme marqueur sélectionnable. Le gène b4 est un membre du facteur de transcription de la famille bHLH, qui n’a pas encore été publié. Pour évaluer le potentiel des racines poilues de la tuberculose, A. rhizogenes a été transformé avec le vecteur binaire pK7WG2D contenant le gène MYB116 pour étudier son effet sur la production de métabolites secondaires tels que les flavonoïdes au niveau de l’expression des gènes et par des analyses métaboliques. Les rhizogenes A. activés doivent être bien préparés en même temps avec les explants.

  1. Activation de A. rhizogenes
    1. Dégeler A. rhizogenes sur la glace
    2. Trempez les bactéries et alignez-les uniformément sur le milieu de mannitol de levure (YEB) complété avec la poudre d’agar de 15 g/L, la rifampicine de 50 mg/L, et la spectinomycine de 50 mg/L (YEBARS, pH 7.0).
    3. Incuber la bactérie à 28 oC pour 12-16 h.
    4. Choisissez une colonie monoclonale et la culture dans un autre plat Petri de la même manière décrite ci-dessus.
    5. Sélectionnez les colonies monoclonales et les culturez-les dans un flacon conique stérilisé de 100 ml contenant 20 ml de milieu YEB complété par 50 mg/L rifampicin et spectinomycine de 50 mg/L (YEBRS, pH 7.0) à 28 oC et 200 tr/min pour 16-18 h jusqu’à ce que la valeur OD600 atteigne 2,0.
    6. Incuber 2% à 4% de la culture susmentionnée dans un autre flacon conique de 100 ml contenant 20 ml de milieu YEBRS à 28 oC et 200 tr/min pour 4-5 h jusqu’à ce que la valeur OD600 atteigne environ 0,5(figure 1D).

3. Infection et dépistage des explants de la tuberculose

REMARQUE : L’objectif de ce protocole est d’obtenir des racines poilues génétiquement transformées. Les racines de type sauvage ont été utilisées comme contrôle négatif pour évaluer l’expression transgénique. Dans ce protocole, A. rhizogenes a été transformé avec le vecteur binaire pK7WG2D portant le gène de FtMYB116 ou pK7GWIWG2D (II) portant le gène de b4 à l’avance.

  1. Résuspension de A. rhizogenes
    1. Transférer la culture obtenue à l’étape 2.1.6 dans un tube centrifuge stérilisé de 50 ml.
    2. Tourner à 4 000 x g pendant 10 min à 20 oC.
    3. Retirez le supernatant et réutilisez la granule bactérienne avec un milieu de MS complété par un saccharose de 30 g/L et un astosyringone de 300 M (ASS) (MSSAS, pH 5,8) à600 OD 0,2.
  2. Infection des explants
    1. Infuser la suspension bactérienne obtenue à l’étape 3.1.3 dans un flacon conique contenant les explants préparés à l’étape 1.4.6 pour 10 min (figure 1E).
    2. Sortez les explants et les tachez à sec à l’aide d’un papier bibuleux stérile.

4. Coculture d’explants avec A. rhizogenes

  1. Placez un papier filtre stérile de 9 cm de diamètre sur le milieu de la MS, qui est solidifié à l’aide de poudre d’agar de 7 g/L complétée par un saccharose de 30 g/L et un AS de 100 M (moyen MSSAAS, pH 5,2).
  2. Superposer les explants sur le papier filtre à 25 oC pendant 3 jours dans l’obscurité(figure 1F).

5. Induction et culture sélective

  1. Placez environ 20 explants infectés sur le milieu MSSA complété par 500 mg/L de cefotaxime et 50 mg/L kanamycine (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (figure 1G).
  2. Incuber verticalement sous l’état de lumière à 25 oC à 1 oC. Les racines poilues se produisent environ 1 semaine après l’incubation (les pointes de flèchenoir-dash de la figure 1H indiquent l’apparition de racines poilues).
    REMARQUE : Remplacez le support MSSACK tous les 15 jours si nécessaire.

6. Sous-culture des racines poilues de la tuberculose

REMARQUE : Cette procédure vise à récolter des racines poilues vigoureuses. Observez régulièrement la croissance des racines poilues pendant la propagation et enlevez les racines contaminées et inactivées en temps opportun. Si nécessaire, répétez les étapes suivantes pour propager des racines plus poilues. Il faut environ 10 à 14 jours de sous-ciblage à la récolte.

  1. Sélectionnez les racines poilues montrant l’apparence blanche et la croissance rapide.
  2. Coupez-les en morceaux de 2 à 3 cm.
  3. Il est clair de les numérorer sur un banc propre.
  4. Subculturez-les dans un flacon conique stérilisé de 100 ml contenant 5 ml de MS moyen complété par 30 g/L de saccharose et de 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5,8) à une vitesse rotative de 80 tr/min à 25 oC dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils surséquent au fond du flacon(figure 1I).

7. Identification des racines poilues transformées et conservation

REMARQUE : Les racines poilues transformées peuvent être identifiées en fonction des aspects de la morphologie et du niveau génétique. L’identification peut également être effectuée en fonction du génome et de la résistance des racines poilues, qui ne sont pas couverts par ce protocole. Cette procédure se concentre principalement sur l’identification des gènes des reporters et des gènes cibles.

  1. Enlevez les racines poilues fauve et contaminées et sélectionnez celles à l’apparence blanche.
  2. Évaluez s’il y a fluorescence verte sous un transilluminateur double ultraviolet bleu/lumière.
  3. Sélectionnez les racines poilues présentant un signal de fluorescence fort dans les tubes numérotés ou enveloppés à l’aide d’un papier d’aluminium marqué après les avoir séchés avec un papier absorbant.
  4. Lyophilize eux dans l’azote liquide, suivie par le stockage de toute la récolte à 80 oC pour une enquête plus approfondie.
  5. Identification des gènes
    1. Triturer 0,1 g des racines poilues en poudre fine dans l’azote liquide.
    2. Préparer l’ADN génomique des lignées transgéniques indépendantes de la tuberculose à l’aide de laméthode modifiée de bromure de céylméthylammonium (CTAB) selon l’instruction du fabricant de la trousse d’ADN génomique végétal.
    3. Effectuez la réaction en chaîne de polymérase (PCR) à l’aide de 100 ng de modèle d’ADN génomique et d’amorce énumérés dans le tableau 2.
    4. Effectuer le cycle d’amplification comme suit: prédenaturation à 94 oC pendant 5 minutes, dénaturation à 94 oC pour 30 s, amorce annealing à 55 oC pour 30 s, et extension d’apprêt à 72 oC pour 30 s. Après 36 cycles et une dernière étape d’extension à 72 oC pendant 10 minutes, analysez les produits d’amplification sur des gels d’agarose de 1%.
    5. Tacher les gels avec la coloration d’acide nucléique et les visualiser sous la lumière UV.

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Résultats

Agrobacterium rhizogenes- transformation des racines poilues de la tuberculose médiée
Cette étude décrit le protocole étape par étape qui a été établi pour obtenir des racines poilues génétiquement transformées à l’aide de A. rhizogenes. Il a fallu environ 5-6 semaines de l’inoculation des graines tuberculeuses à la récolte des racines poilues identifiées, et certaines étapes clés sont représentées dans la figure 1 (A-H). En bref, des gr...

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Discussion

La tuberculose a été utilisée dans plusieurs études liées aux métabolites secondaires aux niveaux génétique et métabolique1,2,5,27,28. La culture des racines poilues, comme source unique pour la production de métabolites, joue un rôle central dans l’ingénierie métabolique29 et peut être utilisée pour modifier les voies métaboliques en i...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par les Fonds de recherche fondamentale pour les instituts centraux de recherche sur le bien-être public ZXKT17002.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 * Taq PCR MasterMixAidlab, ChinePC0901
Poudre d’agarSolarbio Life Science, Pékin, ChineA8190
Applied Biosystems 2720 thermocycleurThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Pékin, ChineA8110Dilué dans DMSO, 100
mM vecteurs binairesThermoFisher Scientific (invitrogen), États-Unis/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Céfotaxime, sodiumSolarbio Life Science, Pékin, ChineC8240Dilué dans l’eau, 200 mg/mL
CF15RXII micro grande vitesseHitachi, Japonn° 90560201
Boîte de Pétri diposableGuanghua usine d’instruments médicaux, Yangzhou, Chine/
DYY-6C appareil d’électrophorèseBjliuyi, Pékin ChineECS002301
EASYspin Plus Kit d’ARNvégétal Aidlab, ChineRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, Royaume-Uni82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR enzyme de réactionThermoFisher Scientific (invitrogen), États-Unis11789100/11791110
Agitateur multifonction HYG-CSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. Chine/
KanSolarbio Life Science, Pékin, ChineK8020Dilué dans l’eau, 100 mg/mL
MLS-3750 Stérilisateur autoclaveSanyo, Japon/
MS sels avec vitaminesSolarbio Life Science, Pékin, ChineM8521
NaClSolarbio Life Science, Pékin, ChineS8210
Autres produits chimiques non déclarésBeijing Chemical Works, Chineéthanol, bichlorure de mercure, etc.
PHS-3C pH-mètreShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinea008
Kit d’ADN génomique végétalTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampicineSolarbio Life Science, Pékin, ChineR8010Dilué dans du DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Pékin, ChineS8040Dilué dans de l’eau, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Pékin, ChineS8270
Marqueur d’ADNTrans2K TransGen Biotech, Pékin, ChineBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Pékin, ChineLP0042
Whatman diamètre 9 cm Papier filtreHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Pékin, ChineLP0021
(en anglais)

Références

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