Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

Résumé

Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.

Résumé

L’approche d’assemblage ascendante pour la construction de cellules synthétiques est un outil efficace pour isoler et étudier les processus cellulaires dans un environnement imitant les cellules. En outre, le développement de systèmes d’expression sans cellules a démontré la capacité de reconstituer les processus de production, de transcription et de traduction de protéines (PROTÉINE DNA-ARN) d’une manière contrôlée, en exploitant la biologie synthétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d’un système d’expression sans cellules, y compris la production d’un puissant lysate bactérien et l’encapsulation de ce lysate à l’intérieur des vésicules géantes nonilamellar à base de cholestérol (GUV) (c.-à-d. liposomes stables), pour former des cellules synthétiques. Le protocole décrit les méthodes de préparation des composants des cellules synthétiques, y compris la production de lysates bactériens actifs, suivie d’une préparation détaillée étape par étape des cellules synthétiques basée sur une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile. Ceux-ci facilitent la production de millions de cellules synthétiques d’une manière simple et abordable avec une grande polyvalence pour produire différents types de protéines. Les cellules synthétiques obtenues peuvent être utilisées pour étudier la production et l’activité des protéines/ARN dans un environnement isolé, dans une évolution dirigée, et aussi comme une plate-forme contrôlée de livraison de médicaments pour la production à la demande de protéines thérapeutiques à l’intérieur du corps.

Introduction

Les cellules synthétiques sont des particules artificielles ressemblant à des cellules, imitant une ou plusieurs fonctions d’une cellule vivante, telles que la capacité de diviser, former des interactions membranaires et synthétiser les protéines à partir d’un code génétique^1,2,3. Les cellules synthétiques qui enferment les systèmes de synthèse des protéines sans cellules (CFPS) possèdent une modularité élevée en raison de leur capacité à produire diverses protéines et séquences d’ARN suite à des altérations dans le modèle d’ADN. Présentant une alternative attrayante aux appr....

Protocole

REMARQUE : L’illustration du protocole complet de production des cellules synthétiques est présentée à la figure 1. Selon les besoins de l’utilisateur, l’expression protéique (article 3.2) et les parties de formation de cellules synthétiques (article 4) du protocole peuvent également être effectuées indépendamment (avec quelques adaptations).

1. Préparation de S30-T7 lysate

1. Plaque de stase la bactérie E. coli BL21(DE3) transformée avec la polyméase d’ARN T7 exprimant le plasmide pAR1219 sur une plaque de LB-agar complétée par une ampicilline de 50 g/mL pour obtenir des colonies uniques.
....

Résultats

Nous présentons un protocole pour la préparation des cellules synthétiques en encapsulant un système S30-T7 CFPS basé sur BL21 E. coli à l’intérieur des vésicules lipidiques. Une description schématique du processus de préparation qui comprend une image de chaque étape est présentée à la figure 2. Le succès du processus de préparation des cellules synthétiques dépend de la performance appropriée de chaque étape et effectuée par différents paramètres. Le protocole doit être ajusté po.......

Discussion

Ce protocole introduit une méthode simple et abordable pour la production de grandes quantités de cellules synthétiques productrices de protéines. Le rendement des cellules actives dépend de l’exécution soigneuse et précise du protocole en mettant l’accent sur plusieurs étapes critiques. Dans la section de préparation lysate de cette méthode, il est essentiel d’atteindre la densité appropriée de bactéries avant la lyse cellulaire pour obtenir une quantité suffisante de protéines dans le lysate bactérien. Deuxièmement, le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A. nécessaires pour l’étape 1 (préparation du lysat S30-T7)
E.coli BL21 (DE3)  ;	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	Vecteur TargeTron pour la transformation.
Solution mère de 50 mg/mL d’ampicilline	Sigma	A9518	Stockée à -20 °C.
10 g/L de Bacto-tryptone	BD Bioscience  ;	211705	Pour la préparation de la plaque de gélose Luria Bertani (LB) (1,5 %).
10 g/L de chlorure de sodium (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L d’extrait de levure Bacto	BD Bioscience  ;	212750
15 g/L Agar agar purifié	Merck	1.01614.5007
50 µ ; g/mL Ampicilline	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience  ;	211705	Pour la préparation du milieu Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L de chlorure de sodium (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L d’extrait de levure Bacto	BD Bioscience  ;	212750
50 & micro ; g/mL Ampicilline	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience  ;	211705	Pour la préparation de milieux de bouillon formidable (TB) (1 L).
24 g/L d’extrait de levure Bacto	BD Bioscience  ;	212750
4 % (v/v) Glycérol anhydre	Bio-Lab	7120501
2,32 g/L K2HPO4	Spectre chimique	P1383
12,54 g/L KH2PO4	Spectre chimique	P1380
; 50 et micro ; g/mL Ampicilline	Sigma	A9518
Solution mère de 100 mM d’isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  ;	INALCO	INA-1758-1400	Filtré à l’aide de 0.2 µ ; Filtre à seringue en PVDF hydrophile.
Solution mère de 0,1 M de dithiothréitol (DTT)  ;	TCI	D1071	Filtré à l’aide de 0.2 & micro ; Filtre à seringue en PVDF hydrophile.
10 mM Tris-acétate à pH = 7,4	Sigma	T1503	Tampon de lysat S30 (1,5 L)
14 mM d’acétate de magnésium	Merck	1,05819.0250
60 mM d’acétate de potassium	Carlo Erba	470147
1 mM	TTC TCI	D1071
0,5 mL/L 2-mercaptoéthanol	Sigma	M6250
Équipement requis pour l’étape 1Erlenmeyer stérilisé
100 mL	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flacons
Erlenmeyer stérilisés de 2 L avec chicanes	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flacons
Agitateur au sol	MRC	TOU-120-2	Incubateur de laboratoire 450x450mm, 400rpm, 70 ° ; C
Centrifugeuse	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotor à angle fixe. Doit permettre au moins 13 000 x g.  ;   ;   ;   ; * Pré-refroidi à 4 ° ;C.
Homogénéisateur haute pression	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	pré-refroidi à 4 &d� ;C.
-Congélateur 80oC	SO-LOW	U85-18
Tubes en plastique stérilisés de 1,5 mL	Eppendorf	30120086	De préférence pré-refroidis à -20 °C.
Spectrophotomètre	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
Plaque transparente à 96 puits	Thermo Scientific	167008
Cylindre gradué stérilisé	Corning
Tubes à centrifuger stérilisés	Eppendorf	30120086	De préférence pré-refroidis à -20 ° ;C.
Pointes de pipette stérilisées	Corning		De préférence pré-refroidies à -20 ° ;C.
Seau à glace pilée	Bel-Art	M18848-4001
Petit réservoir d’azote liquide	NALGENE	4150-4000
B. Réactifs nécessaires pour l’étape 3 (lipides dans la préparation de la solution huileuse) :
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400
Poudre Cholestérol	Sigma	C8667	Poudre
Chloroforme	Bio-Lab	3082301
Huile minérale	Sigma	M5904	Huile légère
Equipement nécessaire pour l’étape 2
Mélangeur Vortex	Industries scientifiques	SI-0256
Bloc chauffant	TECHNE	FDB03AD	Préchauffé à 80 °C Devrait permettre une température contrôlée.
Flacons en verre à col vissé de 2 mL CSI	Analytical Innovations	VT009M-1232	Pour une plus grande échelle, utilisez des faucons de 50 mL et évaporez le chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif.
Bouchon à vis	9mm CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
strong>C. Réactifs nécessaires pour l’étape 3 (mélanges réactionnels internes et d’alimentation) :
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - Tampon de pH
Hydroxyde de potassium (KOH)	Frutarom	55290
1 M Acétate de magnésium	Merck	1.05819.0250	Cofacteur et stabilisateur de charge négative.
1 M Acétate de potassium	Carlo Erba	470147	Stabilisateur à charge négative.
5.2 M Acétate d’ammonium	Merck	1.01116.1000	Stabilise la charge négative.
50 % (p/v) Polyéthylène glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Augmente la concentration des macromolécules.
0,5 M 3-phosphoglycérate (3-PGA)	Sigma	P8877	Source d’énergie secondaire.
50 mM Mélange d’acides aminés I	Sigma	LAA21-1KT	Additif d’acides aminés. Contient : 50 mM de chacun des 17 acides aminés naturels suivants - alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystéine, glutamine, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, proline, sérine, thréonine et valine.
50 mM Mélange d’acides aminés II	Sigma	LAA21-1KT	Additif d’acides aminés. Contient : 50 mM de chacun des 3 acides aminés naturels suivants - tryptophane, phénylalanine et tyrosine.
100 mM Adénine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucléotides et source d’énergie.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucléotides et source d’énergie.
100 mM d’uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Additif nucléotidiques.
100 mM Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Induction de l’expression des gènes.
2 M Saccharose	J.T. Baker	1933078	Génération d’un gradient de densité.
2 M Glucose	Sigma	16301	Génération d’un gradient de densité.
H2O Eau UltraPure (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase &
Lysat de S30-T7 libre de RNase	_	_	Préparé à l’étape 1.   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Source de transcription & traduction components. Stocker à -80 ° ; c, dégeler sur de la glace écrasée juste avant l’utilisation.
Stock de plasmide d’ADN au choix	_	_	Contient la séquence de la protéine demandée. Promoteur sous T7
D. Équipement requis pour l’étape 4 (préparation des cellules synthétiques)
Incubateur au sol ou Thermomixeur	MRC	TOU-120-2	Incubateur de laboratoire 450x450mm, 400rpm, 70 ° ;
C Biographie de la subvention PHMT  ;	PSC18	Thermomixeur
	Centrifugeuse Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor à godets oscillants. Convient pour les tubes de 15 ml. De préférence godets oscillants. Doit permettre au moins 1000 x g. Pré-refroidis à 4 ° ;C.
Centrifugeuse de table	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - 24 rotors de 1,5/2,0 ml avec ClickSeal. Convient pour les flacons Eppendorf. Pré-refroidis à 4 ° ;C.
Mélangeur vortex	Scientific industries	SI-0256
Seau à glace pilée	Bel-Art	M18848-4001
Flacons en verre à col vissé 2 mL CSI	Analytical Innovations	VT009M-1232
Tubes en plastique stériles de 15 mL Thermo	Scientific	339651
Tubes en plastique stérilisés de 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Pointes de pipette stérilisées	Corning		Stérilisé par autoclave.