Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.
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Article de méthode
Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion
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Résumé
Résumé
L’approche d’assemblage ascendante pour la construction de cellules synthétiques est un outil efficace pour isoler et étudier les processus cellulaires dans un environnement imitant les cellules. En outre, le développement de systèmes d’expression sans cellules a démontré la capacité de reconstituer les processus de production, de transcription et de traduction de protéines (PROTÉINE DNA-ARN) d’une manière contrôlée, en exploitant la biologie synthétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d’un système d’expression sans cellules, y compris la production d’un puissant lysate bactérien et l’encapsulation de ce lysate à l’intérieur des vésicules géantes nonilamellar à base de cholestérol (GUV) (c.-à-d. liposomes stables), pour former des cellules synthétiques. Le protocole décrit les méthodes de préparation des composants des cellules synthétiques, y compris la production de lysates bactériens actifs, suivie d’une préparation détaillée étape par étape des cellules synthétiques basée sur une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile. Ceux-ci facilitent la production de millions de cellules synthétiques d’une manière simple et abordable avec une grande polyvalence pour produire différents types de protéines. Les cellules synthétiques obtenues peuvent être utilisées pour étudier la production et l’activité des protéines/ARN dans un environnement isolé, dans une évolution dirigée, et aussi comme une plate-forme contrôlée de livraison de médicaments pour la production à la demande de protéines thérapeutiques à l’intérieur du corps.
Introduction
Les cellules synthétiques sont des particules artificielles ressemblant à des cellules, imitant une ou plusieurs fonctions d’une cellule vivante, telles que la capacité de diviser, former des interactions membranaires et synthétiser les protéines à partir d’un code génétique1,2,3. Les cellules synthétiques qui enferment les systèmes de synthèse des protéines sans cellules (CFPS) possèdent une modularité élevée en raison de leur capacité à produire diverses protéines et séquences d’ARN suite à des altérations dans le modèle d’ADN. Présentant une alternative attrayante aux approches actuelles de la production de protéines, les systèmes CFPS sont basés sur le lysate cellulaire, les composants purifiés ou les composants synthétiques et comprennent toutes les machines de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines telles que les ribosomes, la polymérase à ARN, les acides aminés et les sources d’énergie (p. ex., 3-phosphoglycerate et triphosphate adénine)4,5,66,7,89.9 L’encapsulation d’un système CFPS à l’intérieur des vésicules lipidiques permet la production simple et efficace de protéines sans dépendre d’une cellule vivante10. En outre, cette plate-forme permet la synthèse des peptides qui peuvent se dégrader à l’intérieur des cellules naturelles, la production de protéines qui sont toxiques pour les cellules vivantes, et de modifier les protéines avec des acides aminés non naturels11,12. Les cellules synthétiques ont été utilisées comme modèle à des fins de recherche sur les composants cellulaires minimaux nécessaires pour permettre la vie cellulaire d’un point de vue évolutif1,13. Les cellules synthétiques ont également été utilisées pour construire et mettre en œuvre le circuit génétique et comme modèles pour l’évolution dirigée14,15,16. D’autres études ont porté sur la capacité des cellules synthétiques à imiter l’activité biologique des cellules naturelles, visant à remplacer les cellules naturelles endommagées, telles que les cellules bêta chez les patients atteints de diabète17. En outre, la capacité de ces CFPS encapsulant des cellules synthétiques à produire une variété de protéines thérapeutiques illustre son potentiel à être incorporé dans l’utilisation clinique18.
Ici, nous décrivons un protocole ascendant à l’échelle de laboratoire(figure 1) pour la production d’ARN et de cellules synthétiques productrices de protéines à partir d’un système CFPS encapsulé dans une vésicule lipidique. Cela montre l’utilisation potentielle de plates-formes cellulaires synthétiques comme nouveaux systèmes de livraison de médicaments pour la production sur place d’un médicament protéique thérapeutique in vivo19. Des études antérieures ont étudié l’optimisation de la réaction du CFPS et des processus de préparation du lysate cellulaire4,8,20. En outre, plusieurs techniques ont été appliquées pour la préparation des liposomes de la taille d’une cellule, telles que les méthodes de stabilisation des gouttelettes microfluidiques et polymères21,22,23, qui diffèrent également dans la composition lipidique des liposomes24,25,26. Dans le protocole présenté, les cellules synthétiques sont produites à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile et le processus d’encapsulation est effectué à basse température (lt;4 'C)5,10,24,27,28. Ces conditions douces se sont avérées favorables pour conserver l’intégrité biofonctionnelle des machines moléculaires, à savoir les ribosomes et les protéines27,29,30. La composition lipidique des particules se compose à la fois de cholestérol et de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Le premier se trouve dans toutes les membranes cellulaires des mammifères et est essentiel pour la stabilité, la rigidité et la réduction de la perméabilité de la membrane, et le second imite la composition des phospholipides mammifères11,13. La base moléculaire de transcription et de traduction cellulaire est extraite de la souche BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), qui est transformée avec la polymérase plasmide pAR1219 pour augmenter la polymérase de l’ARN T7 pour augmenter la puissance du SFC et la synthèse des protéines. Ce système a été utilisé pour produire des protéines diagnostiques et thérapeutiques, avec des poids moléculaires allant jusqu’à 66 kDa in vitro et in vivo19,31. Le protocole suivant fournit une méthode simple et efficace pour la production du système cellulaire synthétique, qui peut répondre à un large éventail de questions fondamentales associées à la synthèse des protéines dans la nature et peut également être utilisé pour les applications d’administration de médicaments.
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Protocole
REMARQUE : L’illustration du protocole complet de production des cellules synthétiques est présentée à la figure 1. Selon les besoins de l’utilisateur, l’expression protéique (article 3.2) et les parties de formation de cellules synthétiques (article 4) du protocole peuvent également être effectuées indépendamment (avec quelques adaptations).
1. Préparation de S30-T7 lysate
- Plaque de stase la bactérie E. coli BL21(DE3) transformée avec la polyméase d’ARN T7 exprimant le plasmide pAR1219 sur une plaque de LB-agar complétée par une ampicilline de 50 g/mL pour obtenir des colonies uniques.
- Préparer une solution de démarrage : Inoculer une colonie simple en 5 ml de LB-média complété par une ampicilline de 50 g/mL dans un flacon Erlenmeyer de 100 ml et pousser toute la nuit à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min et 37 oC. Préparez des doublons.
- Inoculer chaque démarreur de 5 ml séparément en 500 ml de support de tb complété par une ampicilline de 50 g/mL dans un flacon 2 L Erlenmeyer avec des déflecteurs et le faire pousser à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min et 37 oC jusqu’à ce qu’il atteigneOD 600 de 0,8-1. Surveillez périodiquement à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Ajouter 2-3 mL de stock de 100 mM d’IPTG (pour atteindre 0,4 à 0,6 mM) pour l’induction de l’expression T7 RNA polymérasase et continuer à cultiver la culture jusqu’à ce qu’elle atteigneOD 600'4.
- Transférer la solution de chaque flacon Erlenmeyer en deux tubes de centrifugeuse stérilisés de 250 ml.
- Centrifugeuse chacune à 7 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
REMARQUE : À ce stade, la granule bactérienne peut être stockée à -20 oC pendant quelques jours avant de passer aux étapes suivantes. - Suspendre à nouveau chaque granule dans 250 ml de tampon froid (4 oC) S30 lysate et centrifugeuse à 7 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
REMARQUE : Le tampon de lysate S30 est utilisé pour maintenir la stabilité des protéines après l’exécution de la lyse cellulaire à l’aide de l’homogénéisant à l’étape 1.9. De ce pas en avant, toutes les étapes jusqu’à 1.12 doivent être effectuées consécutivement et rapidement.
REMARQUE : Avant de passer à l’étape suivante, pré-refroidir les bouts et les flacons de 1,5 millilitur qui seront nécessaires pour stocker le lysate - Jetez le supernatant et suspendez toutes les granulés ensemble dans 15 ml de tampon froid S30 lysate. Filtrer la suspension à l’aide d’un tampon de gaze.
REMARQUE : 15 ml de solution est due au volume d’homogénéisation min. Il faut noter que la concentration de bactéries est également importante. - Homogénéiser à une pression de travail de 15.000 psi, avec une pression d’air de 4 barre (deux passes) pour la rupture cellulaire. Évitez la dilution de solution pour un lysate plus concentré et actif.
- Ajouter 100 L de 0,1 M TNT (CAUTION) par 10 ml de suspension homogénéisée.
- Centrifuge la suspension à 24 700 x g pendant 30 min à 4 oC.
- Effectuez rapidement l’étape suivante pour préserver l’activité lysate : divisez le supernatant un par un en 200 aliquots de L dans des flacons précoltés de 1,5 ml et accrochez-les immédiatement à l’azote liquide. Conserver à -80 oC pour une utilisation ultérieure.
CAUTION: La TNT est classée comme irritante et nocive et doit donc être traitée avec soin.
2. Préparation des lipides dans la solution d’huile
- Dissoudre le POPC et le cholestérol en chloroforme (CAUTION) séparément, chacun à une concentration finale de 100 mg/mL. Vortex chaque flacon séparément.
- Mélanger les composants dans une fiole en verre de 2 mL : ajouter 50 L de POPC en chloroforme, 50 l de cholestérol en chloroforme et 500 l d’huile minérale. Pour 100 L de cellules synthétiques, 2 flacons de lipides dans l’huile sont nécessaires.
- Vortex, puis chauffer pendant environ 1 h à 80 oC dans une hotte chimique pour évaporer le chloroforme. Assurez-vous que l’évaporation complète s’est produite en suivant le temps/conditions spécifiés et en surveillant le volume de la solution.
REMARQUE : La solution lipidique dans l’huile qui en résulte peut être stockée à température ambiante jusqu’à deux semaines. Pour obtenir de meilleurs résultats, il est recommandé d’utiliser une nouvelle préparation avant chaque expérience. Les rapports lipidiques et de cholestérol peuvent être modifiés en fonction de la composition de la membrane désirée. Une forte concentration de cholestérol peut conduire à la formation d’agrégats dans la solution cellulaire synthétique finale.
CAUTION: Le chloroforme est classé comme irritant et nocif et doit donc être traité avec soin et dans les zones avec l’extraction de fumée.
3. Préparation de solutions extérieures, pré-intérieures et d’alimentation
- Préparation de solutions stock
- Préparer les solutions de stock inscrites dans le tableau 2 à l’aide d’eau ultrapure (UPW).
REMARQUE : Les solutions de stock doivent être préparées à l’avance et stockées à -20 oC jusqu’à nouvel ordre. Le réactif 7 a tendance à former des agrégats. Le chauffage à 37 oC réduira l’agrégation. Une légère agrégation n’affectera pas la réaction de manière significative. La solution Reagent 8 est laiteuse et turbide.
- Préparer les solutions de stock inscrites dans le tableau 2 à l’aide d’eau ultrapure (UPW).
- Solution extérieure
- Dissoudre le glucose dans DNase/RNase-libre H2O à une concentration finale de 200 mM.
- Pour 100 L de solution intérieure, préparez 1,6 mL de solution extérieure.
- Solution pré-intérieure
- Ajouter les réactifs 1-14 selon les montants et la concentration énumérés dans le tableau 2. Par exemple, pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution intérieure.
REMARQUE : L’UPW doit être ajoutée pour compléter le volume final requis. À ce stade, le mélange peut être stocké à 4 oC pendant quelques heures.
- Ajouter les réactifs 1-14 selon les montants et la concentration énumérés dans le tableau 2. Par exemple, pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution intérieure.
- Solution d’alimentation
- Ajouter tous les réactifs en fonction des montants et de la concentration énumérés dans le tableau 3.
REMARQUE : Utilisez le rapport 1:1 de la solution d’alimentation : solution intérieure. Pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution d’alimentation. Il est recommandé de préparer un petit volume excédentaire de solution extérieure, intérieure et alimentaire.
- Ajouter tous les réactifs en fonction des montants et de la concentration énumérés dans le tableau 3.
4. Préparation des cellules synthétiques
REMARQUE : Les volumes suivants sont ajustés pour la préparation de 100 L de cellules synthétiques.
- Cellules synthétiques produisant des protéines
- Dans un tube de 15 ml, placez 12 ml de la solution extérieure et ajoutez lentement, sur une couche, de 500 L de lipides dans la solution d’huile. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Pour finaliser la préparation de la solution intérieure : mélanger les ingrédients de la solution intérieure sur de la glace concassée à un volume final de 100 l en décongelant et en ajoutant le Lysate S30-T7 (réactif 15) et le plasmide d’ADN (réactif 16) au mélange stocké.
- Pour la deuxième fiole de verre de 2 ml avec 500 l de lipides dans la solution d’huile, ajouter 100 l de la solution intérieure. Pipette de haut en bas vigoureusement pendant 1 minute et vortex pour une autre minute au niveau cinq.
- Incuber pendant 10 min sur de la glace concassée et ajouter lentement l’émulsion résultante au-dessus de la phase d’huile dans le tube de 15 mL (à partir de 4.1.1).
- Centrifugeuse pour 10 min à 100 x g et 4 oC, puis centrifugeuse pendant 10 min à 400 x g et 4 oC. À la fin de la centrifugation, une boulette au fond du tube doit être observée.
REMARQUE : L’utilisation d’un rotor de centrifugeuse à seau oscillant est préférée ici pour acquérir une meilleure couverture d’une deuxième couche de lipides pendant le passage des gouttelettes d’eau dans l’huile à travers l’interphase. Dans le cas où il n’y a pas de granule observable, la vitesse de centrifugation peut être augmentée à 1000 x g. Sinon, voir la section Discussion se référant à la gravité spécifique de la solution extérieure. - Extraire la boulette.
- Enlever l’excès de couche d’huile.
- Utilisez une pointe de pipette taillée chargée d’environ 400 l de solution extérieure pour extraire la pastille. Relâchez la solution extérieure en passant par la phase d’huile afin de recueillir uniquement la pastille dans la phase aqueuse.
- Essuyez la pointe après l’extraction de la granule pour éviter de transférer les restes d’huile et transférez la pastille dans un tube propre de 1,5 mL.
- Centrifugeuse pendant 10 min à 1 000 x g et 4 oC, retirez le supernatant et suspendez à nouveau la granule dans 100 l de la solution d’alimentation (1:1 rapport des solutions intérieures : alimentation).
REMARQUE : Un rotor de centrifugeuse à angle fixe peut également être utilisé ici. - Pour l’expression protéique, incuber pendant 2 heures à 37 oC sans trembler.
REMARQUE : Le temps d’incubation optimal varie d’une protéine à l’autre. - Évaluer la quantité de protéines produites en utilisant une méthode appropriée selon les propriétés protéiques cibles.
- Groupes de contrôle recommandés
- Solution intérieure et confirmation d’activité lysate
- Préparer une solution intérieure complète (avec ADN et S30-T7 lysate).
- Incuber immédiatement la réaction ci-dessus à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min ou d’un thermomixer à 1200 tr/min, à une température constante de 37 oC pendant 2 h.
REMARQUE : Ajuster le temps d’incubation pour correspondre au temps d’incubation des cellules synthétiques.
- Cellules synthétiques
- Groupe de contrôle négatif : Préparer le protocole présenté en 4.1 avec la solution intérieure sans ADN.
- Contrôle positif : Préparer le protocole présenté en 4.1 avec une solution intérieure contenant un codage plasmide T7 pour un gène reporter.
REMARQUE : Ajoutez un groupe témoin positif composé d’un gène reporter, tel que le sfGFP, aux côtés des groupes de test pour assurer l’étape d’efficacité de l’encapsulation.
- Solution intérieure et confirmation d’activité lysate
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Résultats
Nous présentons un protocole pour la préparation des cellules synthétiques en encapsulant un système S30-T7 CFPS basé sur BL21 E. coli à l’intérieur des vésicules lipidiques. Une description schématique du processus de préparation qui comprend une image de chaque étape est présentée à la figure 2. Le succès du processus de préparation des cellules synthétiques dépend de la performance appropriée de chaque étape et effectuée par différents paramètres. Le protocole doit être ajusté po...
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Discussion
Ce protocole introduit une méthode simple et abordable pour la production de grandes quantités de cellules synthétiques productrices de protéines. Le rendement des cellules actives dépend de l’exécution soigneuse et précise du protocole en mettant l’accent sur plusieurs étapes critiques. Dans la section de préparation lysate de cette méthode, il est essentiel d’atteindre la densité appropriée de bactéries avant la lyse cellulaire pour obtenir une quantité suffisante de protéines dans le lysate bactérien. Deuxièmement, le...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par ERC-STG-2015-680242.
Les auteurs reconnaissent également le soutien du Technion Integrated Cancer Center (TICC); l’Institut de nanotechnologie Russell Berrie; le Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences and Engineering; le ministère israélien de l’Economie pour une subvention Kamin (52752); le Ministère israélien de la technologie et de l’espace des sciences - Bureau du scientifique en chef (3-11878); la Fondation des sciences israéliennes (1778/13, 1421/17); l’Association israélienne contre le cancer (2015-0116); la Fondation germano-israélienne pour la recherche scientifique et le développement pour une subvention GIF Young (I-2328-1139.10/2012); le programme FP-7 IRG de l’Union européenne pour une subvention d’intégration professionnelle (908049); la subvention du Centre de recherche Phospholipid; une Fondation Rosenblatt pour la recherche sur le cancer, une subvention de la Fondation de la famille Mallat; et la Fondation de la famille Unger. A. Schroeder reconnaît les bourses Alon et Taub. O. Adir reconnaît les bourses Sherman et Gutwirth. G. Chen reconnaît la bourse Sherman. N. Krinsky reconnaît le programme de doctorat pour femmes Ariane de Rothschild de la Fondation Rothschild Caesarea.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| A. nécessaires pour l’étape 1 (préparation du lysat S30-T7) | |||
| E.coli BL21 (DE3) ; | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | Vecteur TargeTron pour la transformation. |
| Solution mère de 50 mg/mL d’ampicilline | Sigma | A9518 | Stockée à -20 °C. |
| 10 g/L de Bacto-tryptone | BD Bioscience ; | 211705 | Pour la préparation de la plaque de gélose Luria Bertani (LB) (1,5 %). |
| 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L d’extrait de levure Bacto | BD Bioscience ; | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purifié | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µ ; g/mL Ampicilline | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience ; | 211705 | Pour la préparation du milieu Luria Bertani (LB) (20 mL). |
| 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L d’extrait de levure Bacto | BD Bioscience ; | 212750 | |
| 50 & micro ; g/mL Ampicilline | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience ; | 211705 | Pour la préparation de milieux de bouillon formidable (TB) (1 L). |
| 24 g/L d’extrait de levure Bacto | BD Bioscience ; | 212750 | |
| 4 % (v/v) Glycérol anhydre | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | Spectre chimique | P1383 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | Spectre chimique | P1380 | |
| ; 50 et micro ; g/mL Ampicilline | Sigma | A9518 | |
| Solution mère de 100 mM d’isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ; | INALCO | INA-1758-1400 | Filtré à l’aide de 0.2 µ ; Filtre à seringue en PVDF hydrophile. |
| Solution mère de 0,1 M de dithiothréitol (DTT) ; | TCI | D1071 | Filtré à l’aide de 0.2 & micro ; Filtre à seringue en PVDF hydrophile. |
| 10 mM Tris-acétate à pH = 7,4 | Sigma | T1503 | Tampon de lysat S30 (1,5 L) |
| 14 mM d’acétate de magnésium | Merck | 1,05819.0250 | |
| 60 mM d’acétate de potassium | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM | TTC TCI | D1071 | |
| 0,5 mL/L 2-mercaptoéthanol | Sigma | M6250 | |
| Équipement requis pour l’étape 1Erlenmeyer stérilisé | |||
| 100 mL | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flacons |
| Erlenmeyer stérilisés de 2 L avec chicanes | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flacons |
| Agitateur au sol | MRC | TOU-120-2 | Incubateur de laboratoire 450x450mm, 400rpm, 70 ° ; C |
| Centrifugeuse | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotor à angle fixe. Doit permettre au moins 13 000 x g. ; ; ; ; * Pré-refroidi à 4 ° ;C. |
| Homogénéisateur haute pression | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | pré-refroidi à 4 &d� ;C. |
| -Congélateur 80oC | SO-LOW | U85-18 | |
| Tubes en plastique stérilisés de 1,5 mL | Eppendorf | 30120086 | De préférence pré-refroidis à -20 °C. |
| Spectrophotomètre | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| Plaque transparente à 96 puits | Thermo Scientific | 167008 | |
| Cylindre gradué stérilisé | Corning | ||
| Tubes à centrifuger stérilisés | Eppendorf | 30120086 | De préférence pré-refroidis à -20 ° ;C. |
| Pointes de pipette stérilisées | Corning | De préférence pré-refroidies à -20 ° ;C. | |
| Seau à glace pilée | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Petit réservoir d’azote liquide | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Réactifs nécessaires pour l’étape 3 (lipides dans la préparation de la solution huileuse) : | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | |
| Poudre Cholestérol | Sigma | C8667 | Poudre |
| Chloroforme | Bio-Lab | 3082301 | |
| Huile minérale | Sigma | M5904 | Huile légère |
| Equipement nécessaire pour l’étape 2 | |||
| Mélangeur Vortex | Industries scientifiques | SI-0256 | |
| Bloc chauffant | TECHNE | FDB03AD | Préchauffé à 80 °C Devrait permettre une température contrôlée. |
| Flacons en verre à col vissé de 2 mL CSI | Analytical Innovations | VT009M-1232 | Pour une plus grande échelle, utilisez des faucons de 50 mL et évaporez le chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif. |
| Bouchon à vis | 9mm CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| strong>C. Réactifs nécessaires pour l’étape 3 (mélanges réactionnels internes et d’alimentation) : | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - Tampon de pH |
| Hydroxyde de potassium (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Acétate de magnésium | Merck | 1.05819.0250 | Cofacteur et stabilisateur de charge négative. |
| 1 M Acétate de potassium | Carlo Erba | 470147 | Stabilisateur à charge négative. |
| 5.2 M Acétate d’ammonium | Merck | 1.01116.1000 | Stabilise la charge négative. |
| 50 % (p/v) Polyéthylène glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Augmente la concentration des macromolécules. |
| 0,5 M 3-phosphoglycérate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Source d’énergie secondaire. |
| 50 mM Mélange d’acides aminés I | Sigma | LAA21-1KT | Additif d’acides aminés. Contient : 50 mM de chacun des 17 acides aminés naturels suivants - alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystéine, glutamine, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, proline, sérine, thréonine et valine. |
| 50 mM Mélange d’acides aminés II | Sigma | LAA21-1KT | Additif d’acides aminés. Contient : 50 mM de chacun des 3 acides aminés naturels suivants - tryptophane, phénylalanine et tyrosine. |
| 100 mM Adénine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucléotides et source d’énergie. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucléotides et source d’énergie. |
| 100 mM d’uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Additif nucléotidiques. |
| 100 mM Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Induction de l’expression des gènes. |
| 2 M Saccharose | J.T. Baker | 1933078 | Génération d’un gradient de densité. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Génération d’un gradient de densité. |
| H2O Eau UltraPure (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & |
| Lysat de S30-T7 libre de RNase | _ | _ | Préparé à l’étape 1. ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Source de transcription & traduction components. Stocker à -80 ° ; c, dégeler sur de la glace écrasée juste avant l’utilisation. |
| Stock de plasmide d’ADN au choix | _ | _ | Contient la séquence de la protéine demandée. Promoteur sous T7 |
| D. Équipement requis pour l’étape 4 (préparation des cellules synthétiques) | |||
| Incubateur au sol ou Thermomixeur | MRC | TOU-120-2 | Incubateur de laboratoire 450x450mm, 400rpm, 70 ° ; |
| C Biographie de la subvention PHMT ; | PSC18 | Thermomixeur | |
| Centrifugeuse Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor à godets oscillants. Convient pour les tubes de 15 ml. De préférence godets oscillants. Doit permettre au moins 1000 x g. Pré-refroidis à 4 ° ;C. | |
| Centrifugeuse de table | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 rotors de 1,5/2,0 ml avec ClickSeal. Convient pour les flacons Eppendorf. Pré-refroidis à 4 ° ;C. |
| Mélangeur vortex | Scientific industries | SI-0256 | |
| Seau à glace pilée | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Flacons en verre à col vissé 2 mL CSI | Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Tubes en plastique stériles de 15 mL Thermo | Scientific | 339651 | |
| Tubes en plastique stérilisés de 1,5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Pointes de pipette stérilisées | Corning | Stérilisé par autoclave. |
Références
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