Article de méthode

Production microfluidique de liposomes sensibles à la température contenant des lysolipides

DOI :

10.3791/60907

⸱

3 mars 2020

 ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

Dans cet article

Résumé

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Le protocole présente les paramètres optimisés pour la préparation des liposomes thermosensibles à l’aide du dispositif microfluidique micromélangeur d’os de hareng décalé. Cela permet également la co-encapsulation de la doxorubicine et de l’indocyanine vert dans les liposomes et la libération photothermique déclenchée de doxorubicine pour la libération contrôlée / déclenchée de médicaments.

Résumé

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Le protocole présenté permet une préparation continue à haut débit de liposomes sensibles à basse température (LTSL), qui sont capables de charger des médicaments chimiothérapeutiques, tels que la doxorubicine (DOX). Pour ce faire, un mélange de lipides éthanoliques et une solution de sulfate d’ammonium sont injectés dans un micromélangeur à chevrons décalé (SHM) dispositif microfluidique. Les solutions sont rapidement mélangées par le SHM, offrant un environnement solvant homogène pour liposomes auto-assemblage. Les liposomes collectés sont d’abord annealed, puis dialysés pour enlever l’éthanol résiduel. Un pH-gradient de sulfate d’ammonium est établi par l’échange tampon de la solution externe en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille. DOX est ensuite chargé à distance dans les liposomes avec une efficacité d’encapsulation élevée (-gt; 80%). Les liposomes obtenus sont homogènes en taille avec un diamètre moyen Z de 100 nm. Ils sont capables de libérer de DOX encapsulés en rafale séchage à température en présence d’une légère hyperthermie (42 oC). Le vert endocyanine (ICG) peut également être co-chargé dans les liposomes pour la libération de DOX laser-déclenché par l’infrarouge proche. L’approche microfluidique assure une préparation à haut débit, reproductible et évolutive des LTSL.

Introduction

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La formulation de LTSL est un produit liposomique cliniquement pertinent qui a été développé pour délivrer la doxorubicine de drogue chimiothérapeutique (DOX) et permet la libération efficace de drogue d’éclatement à l’hyperthermie douce médicalement accessible (T - 41 c)1. La formulation LTSL se compose de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), le lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (MSPC; M signifie "mono") et plébisémie PEGylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000). En atteignant la température de tr....

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Protocole

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1. Configuration de l’équipement

  1. Assembler les pompes à seringues et SHM comme suit.
    1. Connectez le port « À l’ordinateur » de la pompe à seringues secondaire (pompe 02, pour une solution aqueuse) au port « To Network » de la pompe à seringues principale (pompe 01, pour la solution lipidique d’éthanol) à l’aide du câble de réseau Pump to Pump (Figure 1, jaune).
    2. Connectez le port "To Computer" de la pompe principale au port "RS232 Serial" de l’ordinateur à l’aide de PC pour pomper le câble réseau (Figure 1, bleu).
    3. Connectez les tubes à cha....

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Résultats

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La préparation des LTSL par microfluidique nécessite la composition lipidique de DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, rapport molaire; LTSL10). La figure 7A (à gauche) montre l’apparition du LTSL10 préparé à partir de l’étape 2.9, comme un liquide clair et non visqueux. La formulation LTSL10 est développée à partir de la formulation conventionnelle, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, rapport molaire) puisque LTSL4 form.......

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Discussion

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Le protocole présenté décrit la préparation de liposomes sensibles à basse température (LTSL) à l’aide d’un micromélangeur à chevrons décalé (SHM). La formulation LTSL10 permet la libération de doxorubicine déclenchée par la température dans les 5 minutes à une température hyperthermique cliniquement atteignable de 42 oC. Indocyanine vert (ICG) peut également être co-chargé pour le chauffage photothermique déclenché la libération de DOX. La méthode repose sur : (i) l’auto-assemblage de phospholipides en liposomes dans un.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous remercions Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) et le Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) pour leur financement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC)LipoïdePC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)LipoïdePE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stéaroyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholine (MSPC)Avanti Polar Lipid855775P-500MGDistribué par Sigma-Adrich ; également connu sous le nom de Lyso 16:0 PC
(à ne pas confondre avec le PC 14:0/18:0, également appelé MSPC)
4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)Sigma-AldrichH3375-100G
Adaptateurs, Luer Lock femelle à 1/4"-28UNFIDEX Santé & ScienceP-624Nécessite 2 unités. Pour les adaptateurs d’entrées
, assemblage union, 1/4"-28UNFIDEX Santé & ScienceP-630Nécessite 2 unités. (Une unité comprend 2 écrous et 2 embouts)
Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4)Sigma-Aldrich31119-1KG-M
Flacon BijouVWR216-09807 mL, transparent, flacon en polystyrène
Unité de filtre centrifugeSigma-AldrichUFC80100810 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Unité de filtre centrifuge
ThermoFisherScientificHeraeus Megafuge 8Ravec rotor
à angle fixe HIGHConic IIICuvetteFisher Scientific11602609Cuvette jetable en polystyrène, faible volume, pour mesure DLS
Kit de dialyse - Pur-A-Lyzer MaxiSigma-AldrichPURX12015-1KT12-14 kDa MWCO
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich34943-1L-M
DLS InstrumentMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS90
Chlorhydrate de Doxorubicine (DOX)Apollo ScientificBID0120
DSC InstrumentTA InstrumentsTA Q200 DSC
DSC Tzero Couvercles hermétiquesTA Instruments901684.901Pour la mesure
DSC Tzero PansTA Instruments901683.901Pour la mesure DSC
DSC Tzero Sample Press KitTA Instruments901600.901Pour la mesure
ÉthanolVWR20821.330Absolute, &ge ; 99,8 %
FC-808 Système laser couplé à fibreCNI Optoelectronics TechFC-808-8W-181315FOC-01-B Collimateur à fibre inclus.
Ferrule, 1/4 »-28UNF à 1/16 » ODIDEX Santé & ScienceP-200Pour la sortie
Sonde de température à fibre optiqueOsensaPRB-G40
Micromélangeur à chevrons décalés en verre (SHM)Mélangeur à chevrons Darwin Microfluidics-
de verre OmegaDHT052020LDPeut être remplacé par d’autres réchauffeurs de seringue tels que « HTC » ou « série SRT » pour un chauffage plus lent. Câblage manuel à une prise à 3 broches requis pour les modèles 240V
Indocyanine GreenAdooqA10473-100Distribué par Bioquote Limited (Royaume-Uni)
Seringue Luer-lock, 5 mLVWR613-2043Hanke Sass Wolf SOFT-JECT Seringues 3 pièces, D.E. 12,45 mm
Lecteur de microplaquesBMG LabtechFLUOstar Omega Installéavec des filtres de 485 nm (exictation) et 590 nm (émission)
Microplaque, 96 puits, noir, à fond platThermoFisher Scientific611F96BKPour la mesure de fluorescence dans le lecteur
de microplaques Microplaques, 96 puits, Transparent, à fond platGrenier655101Pour mesure d’absorbance Lecteur de microplaques
Écrou, 1/4 »-28UNF à 1/16 » ODIDEX Santé & ScienceP-245Pour la sortie
PC à Pump Câble réseau pour Aladdin, 7ftWorld Precision InstrumentsNE-PC7En option : Les pousse-seringues peuvent être actionnés manuellement
Logiciel de contrôle de pompe - Licence du logiciel SyringePumpPro pour 2World PrecisionInstruments SYRINGE-PUMP-PRO-02En option : Les pousse-seringues peuvent être actionnés manuellement
Câble réseau de pompe à pompe pour Aladdin, 7 ftWorld Precision InstrumentsNE-NET7En option : Les pousse-seringues peuvent être actionnés manuellement Colonne
chromatographie d’exclusion stérique (SEC) RésineGE Life Science17085101 Sephadex G-25 dans des colonnes de dessalage-10
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-Aldrich31434-1KG-M
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-AldrichS5881-500G
Pousse-seringues & Câble (DUAL-PUMP-NE-1000)World Precision InstrumentsALADDIN2-220/AL1000-220
Thermostat Contrôleur de températureInkbirdITC-308Peut être remplacé par un autre kit de chauffage de seringue/thermostat
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Tube, ETFE (1/16" OD)IDEX Health & Science1516
Convertisseur USB vers RS-232World Precision InstrumentsCBL-USB-232En option : Pour ordinateur sans port RS-232
Bain d’eauGrant Instruments Ltd.JB Nova 12
DSC Ruban chauffant à puce de

Références

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  1. Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
  2. Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham....

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Mots-clés

Microfluidic Liposome ProductionTemperature Sensitive LiposomesLysolipid Containing LiposomesDoxorubicin Remote LoadingIndocyanine Green Co loadingStaggered Herringbone MicromixerSize Exclusion ChromatographyAmmonium Sulfate GradientDynamic Light ScatteringNear Infrared Laser Triggered Release

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