L’objectif est de fractionner et d’isoler les petites molécules bioactives, les peptides d’un extrait de plante complexe et les protéines de microbes pathogènes en utilisant la méthode de mise au point isoélectrique (IEF) en phase liquide. En outre, les molécules séparées ont été identifiées et leur bioactivité confirmée.
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Article de méthode
Séparation des petites molécules bioactives, peptides des sources naturelles et des protéines des microbes par la méthode de mise au point isoélectrique préparative (IEF)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les produits naturels dérivés des plantes et des microbes sont une riche source de molécules bioactives. Avant leur utilisation, les molécules actives provenant d’extraits complexes doivent être purifiées pour des applications en aval. Il existe diverses méthodes chromatographiques disponibles à cette fin, mais tous les laboratoires ne peuvent pas se permettre des méthodes de haute performance et l’isolement des échantillons biologiques complexes peut être difficile. Nous démontrons ici que la mise au point isoélectrique en phase liquide préparative (IEF) peut séparer les molécules, y compris les petites molécules et les peptides à partir d’extraits de plantes complexes, en fonction de leurs points isoélectriques (pI). Nous avons utilisé la méthode pour la fractionnement et la caractérisation des échantillons biologiques complexes. Comme preuve de concept, nous avons fractionné un extrait de plante gymnema sylvestre, isolant une famille de petites molécules de saponine terpénoïde et un peptide. Nous avons également démontré une séparation efficace des protéines microbiennes en utilisant le champignon Candida albicans comme système modèle.
Introduction
La purification des biomolécules à partir d’échantillons biologiques complexes est une étape essentielle et souvent difficile dans les expériences biologiques1. La mise au point isoélectrique (IEF) convient bien à la séparation à haute résolution des biomolécules complexes où les ampholytes de transport voyagent selon leur charge et établissent le gradient de pH dans un champ électrique3. Le premier amphlyte de transporteur commercial pour IEF a été développé par Olof Vesterberg en 1964 et breveté4,5. Les amplyantes porteuses sont des molécules d’acide oligo-carb....
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Protocole
1. Installation et prérunning de l’unité IEF standard de phase liquide
- Assemblez les électrodes IEF en phase liquide (bouton anode-rouge et bouton cathode-noir) avec leurs membranes d’échange respectives selon le manuel d’instructions (voir Tableau des matériaux). Équilibrez les membranes d’échange d’anions avec 0,1 M De NaOH et les membranes d’échange de cations avec 0,1 M H3PO4 au moins pendant 16 h lorsque de nouvelles membranes sont utilisées.
- Rangez les membranes dans des électrolytes (0,1 M De NaOH ou 0,1 M H3PO4) entre les pistes et ne laissez pas sécher.
- Assem....
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Résultats
Séparation et purification de petites molécules et peptides de l’extrait de plante de Gymnema sylvestre
En utilisant la méthode préparateur de phase liquide IEF, nous avons fractionné des extraits de plantes médicinales et des protéines de surface cellulaire d’un champignon pathogène humain, C. albicans. Un schéma de ces protocoles de fractionnement est illustré à la figure 1.
À partir de 20 fractions d’extrait de G. sylve.......
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Discussion
Les petites molécules provenant de sources naturelles de produits (p. ex., les plantes) comprennent des métabolites secondaires complexes qui sont très divers dans la structure chimique. On pense qu’ils sont impliqués dans les mécanismes de défense des plantes. En outre, les polypeptides sont également présents dans les tissus végétaux22. Ces petites molécules naturelles sont de riches sources de molécules d’essai pour la découverte et le développement de médicaments. Cependant, les méthodes diffi.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs voudraient ne déclarer aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants pour les sources de financement de la Division de biologie et Johnson Cancer Research Center pour BRIEF et IRA prix, respectivement à GV. Nous remercions également le prix postdoctoral K-INBRE à RV. Ce travail a été soutenu en partie par le Prix de développement institutionnel (IDeA) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20 GM103418. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut national des sciences médicales générales ou des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions les....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,45 et micro ; Filtre à seringue | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Carbonate d’ammonium | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Thermostat basse température compact | Lauda - Brinkmann | RM 6T | Réglez le refroidissement par eau à 4 oC et il peut fonctionner même à 0 oC car lorsqu’il passe à travers le noyau de refroidissement Rotofor, la température de l’eau en circulation sera d’environ 5 ou plus selon la tension. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tube de dialyse (3 500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Poudre d’extrait de feuille de plante Gymnema (>25 % d’acides gymnémiques) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubateur | Compagnon de laboratoire | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protéiforme pH-mètre d’électrophorèse | Bio-Rad | ||
| Mettler Toledo | S20 | Utile pour déterminer le pH des fractions Rotofor (IEF en phase liquide) | |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Mode d’emploi pour le montage de l’unité) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Du ruban d’étanchéité | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape peut également être utilisé. |
| Centrifugeuse Sorvall legend micro 17 | Thermo scientific | 75002432 | |
| Plaque de culture tissulaire TPP -96 puits à fond plat | TPP | TP92696 |
Références
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Poin....
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Réimpressions et autorisations
