Ce protocole décrit un système de culture dynamique pour produire des agrégats de taille contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines et stimuler davantage la différenciation des organoïdes cérébellaires dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation à l’aide d’un bioréacteur à usage unique.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cervelet joue un rôle critique dans le maintien de l’équilibre et de la coordination motrice, et un défaut fonctionnel dans différents neurones cérébellaires peut déclencher un dysfonctionnement cérébelleux. La plupart des connaissances actuelles sur les phénotypes neuronaux liés à la maladie sont basées sur des tissus post mortem, ce qui rend difficile la compréhension de la progression et du développement de la maladie. Des modèles animaux et des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisés comme modèles pour les troubles neurodégénératifs. Cependant, ils ne récapitulent pas complètement la maladie humaine. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation des maladies et fournissent une source précieuse pour les approches régénératrices. Ces dernières années, la génération d’organoïdes cérébraux à partir d’iPSC dérivés du patient a amélioré les perspectives de modélisation des maladies neurodégénératives. Cependant, les protocoles qui produisent un grand nombre d’organoïdes et un rendement élevé de neurones matures dans les systèmes de culture 3D font défaut. Le protocole présenté est une nouvelle approche pour la production reproductible et évolutive d’organoïdes humains dérivés de l’iPSC dans des conditions chimiquement définies à l’aide de bioréacteurs évolutifs à usage unique, dans lesquels les organoïdes acquièrent l’identité cétebelaire. Les organoïdes générés sont caractérisés par l’expression de marqueurs spécifiques à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. L’analyse de groupes spécifiques de protéines permet la détection de différentes populations de cellules cérebelaires, dont la localisation est importante pour l’évaluation de la structure organoïde. La cryosection organoïde et l’immunostaining supplémentaire des tranches organoïdes sont utilisés pour évaluer la présence de populations spécifiques de cellules cérebelaires et leur organisation spatiale.
Introduction
L’émergence de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) représente un excellent outil pour la médecine régénérative et la modélisation des maladies, parce que ces cellules peuvent être différenciées dans la plupart des lignées cellulaires du corps humain1,2. Depuis leur découverte, la différenciation psc utilisant diverses approches a été rapportée pour modéliser différentes maladies, y compris les désordres neurodégénératifs3,4,5,6.
Récemment, il y a....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Passage et entretien des iPSCs humains dans la culture monocouche
- Préparation des plaques
- Décongeler la matrice membranaire du sous-sol (voir tableau des matériaux)à 4 °C et préparer 60 aliquots μL. Congeler les aliquots à -20 °C.
- Pour recouvrir les puits d’une plaque de 6 puits, décongeler un aliquot de la matrice de membrane du sous-sol sur la glace. Une fois décongelé, ajouter 60 μL à 6 mL de DMEM-F12. Resuspendez doucement en faisant des pipes de haut en bas.
- Ajouter 1 mL de solution diluée de matrice de membrane de sous-sol à chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à RT pendant au moins 1 h avant....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le protocole a été initié en favorisant l’agrégation cellulaire à l’aide des bioréacteurs de 0,1 L (figure 1A). L’inoculation à cellule unique des iPSC a été effectuée, avec 250 000 cellules/mL ensemencées dans 60 mL de milieu avec une vitesse d’agitation de 27 tr/min. Cela a été défini comme le jour 0. Après 24 h, les cellules ont formé efficacement des agrégats en forme de sphéroïde (jour 1, figure 1B),et la morphologie a été bien entretenue jusqu’au jour 5, a.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La nécessité d’un grand nombre de cellules ainsi que de conditions de culture définies pour générer des types de cellules spécifiques pour le dépistage des médicaments et les applications de médecine régénérative a été le moteur du développement de systèmes de culture évolutive. Ces dernières années, plusieurs groupes ont signalé la génération évolutive de progéniteurs neuronaux et de neurones fonctionnels32,33,34, fournissant d.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs YH et SJ sont employés de PBS Biotech. L’auteur BL est PDG et co-fondateur de PBS Biotech, Inc. Ces auteurs collaborateurs ont participé au développement des bioréacteurs utilisés dans le manuscrit. Cela ne modifie pas l’adhésion des auteurs à toutes les politiques de la revue sur le partage de données et de documents. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 par l’intermédiaire de Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projet N. 007317, PD/BD/105773/2014 à T.P.S et PD/BD/128376/2017 à D.E.S.N.), projets cofinancés par FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) et FCT par le biais de la subvention PAC-PRECIS LISBOA-01-0145-FEDER-016394 et CEREBEX Génération d’Organoïdes cérébellaires pour la subvention de recherche sur l’ataxie LISBOA-0145-FEDER-029298. Le financement a également été reçu du Programme de recherche et d’innovation....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Papier 3MM | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Milieu de détachement de cellules | Sigma |
| Anticorps anti-BARHL1 Anticorps | HPA004809 | Atlas | |
| Anti-Calbindin D-28k Anticorps | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 | Anticorps M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadhérine Anticorps | 610921 | à transduction | |
| MAB1259-SP | R& D | ||
| Anticorps anti-OLIG2 | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Anticorps | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 | MAB2018 | R& D | |
| Anticorps anti-TBR1 | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Anticorps | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Anticorps | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrine | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Cellules souches Concentré de | |
| lipides chimiquement défini | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Purifié par cristallisation BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Sérum fœtal bovin | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gélatine de peau bovine | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham' s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Episomal Humain iPSC | Line A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insuline | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T. B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| Acide L-ascorbique | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Matrice de membrane basale | Corning |
| Monothioglycérol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Milieu de montage | Millipore |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | pour technologies | |
| 17502048 | ThermoFisher | ||
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldéhyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Récipient à usage unique | SKU : IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Unité de base | UGS : IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant humain BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant humain bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant humain FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant humain GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant humain SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibiteur Y-27632 | 72302 | Technologies des | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Lames de microscope | 12372098 | ThermoFisher Lames de microscope à adhésion | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Références
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
