Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Détection simple des cils primaires par immunofluorescence

11K vues

⸱

DOI :

10.3791/61155

⸱

15 mai 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiobiology, Faculty of Military Health Sciences in Hradec Kralove, University of Defence, 2Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics, University Hospital, 3Department of Oncology, Thomayer Hospital, Charles University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, Faculty of Medicine, Charles University

Dans cet article

Résumé

Les cils primaires sont des structures extracellulaires associées au centriole. La détection primaire des cils par coloration immunofluorescente est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ce protocole, les fibroblastes exprimant des cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal.

Résumé

Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1 du cycle cellulaire, étant résorbés avant la mitose. Les cils primaires peuvent être visualisés avec des méthodes très sophistiquées, y compris la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou en utilisant un logiciel pour la détection automatique des cils primaires. Cependant, la coloration immunofluorescente des cils primaires est nécessaire pour effectuer ces méthodes. Cette publication décrit un protocole pour la détection facile des cils primaires in vitro en tachant la tubuline alpha acétylée (axoneme) et la tubuline gamma (corps basal). Ce protocole de coloration immunofluorescente est relativement simple et donne des images de haute qualité. Le présent protocole décrit comment quatre lignées cellulaires (C2C12, MEF, NHLF et fibroblastes cutanés) exprimant des cils primaires ont été fixées, immunostainées et imageuses à l’aide d’un microscope fluorescent ou confocal.

Introduction

Les cils primaires sont des structures sensorielles, solitaires, liées à la membrane, non-motiles associées au centriole mère de la cellule. Les cils primaires se trouvent sur la plupart des cellules vertébrées, à l’exception des globules rouges, des adipocytes1et des hépatocytes2. Les cils primaires sont formés sous forme d’axoneme allongé composé de microtubules, dont le principal composant est l’α-tubuline. L’axoneme pousse à partir du corps basal, qui est structuré à partir de γ-tubuline. La longueur des cils primaires varie entre 2 et 10 μm; cependant, ses dimensions peuvent changer pendant la glycylation, la famine, l’hypoxie, le stress cytotoxique, ou après exposition au rayonnement ionisant3,4,5,6,7. Habituellement, les cellules n’ont qu’un seul cilium primaire, qui est impliqué dans la morphogenèse et les voies de signalisation cellulaire importantes pour la prolifération cellulaire et la différenciation8,9.

Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1, et résorbés avant d’entrer dans la mitose dans un processus associé à la déacétylation de tubuline médiée par HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Le moment exact de la résorption primaire des cils dépend du type de cellule et de l’expression des gènes directement impliqués dans ce processus, tels que Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Selon le type de cellule, les cils primaires expriment différents types de récepteurs, canaux ions et voies de signalisation actives. Il s’agit notamment des récepteurs de signalisation les plus importants affectant la prolifération et la survie, EGFR, PDGFR, et FGFR. Sont également inclus quelques-unes des voies de signalisation qui peuvent affecter la fonction d’un ou plusieurs organes, y compris hedgehog, Notch, et Wnt. Grâce à ces récepteurs et voies de signalisation, les cils primaires effectuent également une fonction chimiosensorielle. Cette fonction permet aux cils primaires de détecter des ligands spécifiques pour Notch, les hormones et les substances biologiquement actives comme la sérotonine ou la somatostatine. D’autres fonctions spécifiques exposées par des cils primaires de différentes longueurs incluent la réaction aux changements de température, de gravité et d’osmolalité14.

Les cils primaires peuvent être visualisés par diverses méthodes, telles que la visualisation en direct, la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou par logiciel pour la détection automatique des cils primaires5,15,16,17. Cependant, ces méthodes sont hautement spécialisées et la recherche continue a besoin de méthodes de base, rapides et faciles pour tacher les cils primaires à chaque étape de la recherche. Décrit est une méthode facile et utile pour la détection des cils primaires dans les cellules cultivées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des supports culturels, des solutions et des plats

  1. Autoclavez les couvercles (22 x 22 mm). Préparer 6 assiettes de puits. Décongeler le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline/streptomycine antibiotique et réchauffer la température moyenne à ambiante (RT). Utiliser trypsin-EDTA (0.25%) et 1x PBS (saline tamponnée de phosphate avec calcium et magnésium) pour passer les cellules.
  2. Préparer du paraformaldéhyde frais à 4 % (PFA) en dH2O (800 mg de PFA dans 20 mL de dH2O). La PFA doit être fraîchement préparée pour chaque expérience. Remuer et chauffer la solution à 55 °C pendant 30 min dans le capot. Refroidir à RT. Ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que la solution devienne claire (pH = 7,2–7,4). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
    Note: PFA est toxique; toujours porter un équipement de protection individuelle adéquat et se préparer dans le capot chimique.
  3. Préparer 500 mL de supports de culture, DMEM (le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco) contenant 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, et 2% de glutamine.
  4. Préparer 13 mL de 1% de solution de gélatine en dH stérile2O (130 mg de gélatine dans 13 mL de dH2O). Utilisez 2 mL de gélatine de 1% pour chaque puits dans une assiette de 6 puits. Restez stérile.
  5. Nettoyez le capot d’écoulement laminaire à l’aide de 70 % d’éthanol. Placez le matériau requis à l’intérieur du capot d’écoulement laminaire avant de commencer l’expérience.

2. Culture cellulaire pour la coloration immunocytochimie

  1. Décongeler les cellules (dans cette étude C2C12, MEF, NHLF, et fibroblastes de la peau) en utilisant des techniques standard et les plaquer dans une fiole T75 complétée par ~10–12 mL des médias préparés. Incuber à 37 °C/5% CO2 /90%d’humidité relative (RH) jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% confluence.
  2. Retirez les cellules de l’incubateur et placez-les dans le capot d’écoulement laminaire. Retirez le support de culture et rincez brièvement les cellules 2x avec 1x PBS. Ajouter ~2 ml de 0,25% trypsin-EDTA dans la fiole T75 et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Vérifiez périodiquement sur le microscope inversé pour surveiller le détachement cellulaire.
    REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la ligne cellulaire et doit donc être déterminé empiriquement.
  3. Resuspendez doucement les cellules dans 10 mL de supports de culture, en pipeting soigneusement pour créer une suspension à cellule unique. Rincer à nouveau la fiole si nécessaire.
  4. Placez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et une centrifugeuse pendant 5 min à ~200 x g. Décanter le supernatant, ajouter 10 mL de supports de culture, et resuspender doucement le granulé. Prenez 20 μL de la suspension cellulaire et mélangez-les dans un rapport de 1:1 avec le bleu trypan et comptez dans un cytomètre suivant la méthode standard.
  5. Placez un couvercle à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de 6 puits à l’aide de pinces à épiler. Enrober les couvercles de gélatine en versant ~2 mL dans les puits. Cela aidera les cellules à s’attacher aux couvercles. Retirer la solution de gélatine et laisser sécher à l’air pendant quelques minutes. Les couvercles sont maintenant prêts pour la culture des cellules. Commencez la culture immédiatement.
  6. Détemêlez 100 000 fibroblastes dans chaque puits et ajoutez 2 mL de supports culturels. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C/5% CO2/90% RH. À ce stade, les cellules peuvent être traitées en fonction des besoins de l’utilisateur. Les traitements pour induire la ciliation ont été précédemmentdécrits 4,5.
    REMARQUE : Le nombre initial d’ensemencement dépend du temps de doublement des cellules et doit être déterminé en conséquence.

3. Coloration immunofluorescente des cils primaires in vitro

  1. Chauffer le paraformaldéhyde à 4 % à RT. Préparer les pipettes Pasteur, 1x PBS (RT), le contenant de déchets, les tubes coniques de 15 mL, les micropipettes (0,5–10 μL, 20–200 μL et 100–1 000 μL) et les pointes. Prenez les cellules de l’incubateur et placez-les sur le banc.
    REMARQUE : La procédure de coloration n’a pas besoin d’être effectuée dans des conditions stériles. Toutes les solutions doivent être à RT.
  2. Retirez les supports de chaque puits. Laissez le couvercle à l’intérieur du puits. Laver très doucement les cellules 3x avec 2 mL de 1x PBS. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter 2 mL de 4 % de PFA dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber pendant 10 min à RT. Retirer la PFA et laver 3x avec 1x PBS.
    REMARQUE : Utilisez toujours un volume suffisant pour couvrir l’intégralité du couvercle pendant les périodes d’incubation. Ne laissez jamais sécher les cellules. Ne versez jamais aucune des solutions directement sur le couvercle.
  3. Préparer 0,5% Triton X-100 en 13 mL de 1x PBS 10 min avant utilisation. Ajouter 2 mL dans chaque puits. Incuber pendant 15 min. Laver doucement 4x avec 1x PBS.
    REMARQUE : Triton X-100 est insoluble dans PBS à RT. Chauffer la solution Triton X-100 de 0,5 % à 37 °C dans un bain d’eau pour la dissoudre.
  4. Décongeler le sérum de chèvre 5 min avant utilisation. Diluer le sérum de chèvre en 1x PBS dans un rapport de 1:20 comme solution de blocage. Ajouter 150 μL à chaque couvercle et incuber pendant 20 min à RT.
    REMARQUE : Prolongez la période de blocage jusqu’à 60 min si nécessaire. Ne pas laver les cellules après le blocage avec du sérum de chèvre.
  5. Décongeler les anticorps primaires (c.-à-d. alpha tubuline anti-acétylée et tubuline anti-gamma) 5 min avant utilisation. Diluer les anticorps séparément dans 1x PBS comme suit: souris anti-acétylated alpha tubuline dans un rapport de 1:800 et lapin anti-gamma tubuline dans un rapport de 1:300. Supprimez la solution de blocage. Ne vous lavez pas. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps aux couvercles et incuber pendant 60 min à RT.
    REMARQUE : Si vous couverez pendant la nuit utiliser 500–1 000 μL des solutions d’anticorps primaires, sceller la plaque de 6 puits avec du film de paraffine, et stocker à 4 °C. Sinon, utilisez 150 μL d’anticorps et incuber dans une chambre d’humidité.
  6. Retirez les anticorps primaires. Laver les couvercles très doucement 3x avec 2 mL de 1x PBS. Préparer les anticorps secondaires en 1x PBS en diluant séparément l’anti-souris de mouton Cy3 et l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor488 dans un rapport de 1:300. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps secondaires aux couvercles. Incuber pendant 45 min à RT dans l’obscurité.
    REMARQUE : Incuber dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. D’autres combinaisons d’anticorps secondaires peuvent être utilisées au besoin.
  7. Préparer une solution DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) selon les instructions du fabricant. Conserver l’excédent d’aliquots à -20 °C. Diluer 10 μL à partir d’un aliquot de stock (1:5,000) dans 50 mL de 1x PBS. Ajouter 2 mL de cette dilution aux couvercles. Incuber pendant 5 min à RT dans l’obscurité.
    REMARQUE : Il est important d’incuber les cellules dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. La dilution du DAPI peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  8. Préparez 2 aiguilles, toboggans, pinces à épiler et supports de montage. Étiqueter les diapositives.
  9. Retirez la solution DAPI des puits. Laver 3x avec 1x PBS. Mettez une goutte de support de montage sur chaque diapositive. Utilisez l’aiguille pour soulever doucement le couvercle du fond du puits. Retournez le couvercle à l’aide de la pince à épiler et placez-le doucement sur la goutte de support de montage. Retirez soigneusement les bulles.
  10. Protégez les lames de la lumière et rangez-les toute la nuit à 4 °C.
  11. Utilisez un microscope fluorescent ou confocal avec un grossissement élevé pour visualiser les cils primaires.
    REMARQUE : Les lames peuvent être stockées dans l’obscurité à 4 °C pendant jusqu’à 2 mois.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La coloration immunofluorescente des cils primaires est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ces expériences, les fibroblastes exprimant les cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal suivant le protocole décrit ci-dessus. Le cilium primaire a été détecté à l’aide d’acétylated α-tubuline et γ-tubuline. L’évaluation des cils primaires peut être effectuée à divers niveaux et tout changement à cet égard peut être ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Plusieurs auteurs ont décrit diverses méthodes pour la détection des cils primaires, décrivant parfois également diverses méthodes de fixation qui peuvent affecter leur détection6,20,21,22. Quoi qu’il en soit, il est difficile de trouver un protocole complet et simple pour la détection. La disponibilité immédiate d’une telle méthode serait sans aucun doute d’une grande aide à l’étude de l’étude...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Ministère de la défense de la République tchèque - Plan de développement d’organisations à long terme Aspects médicaux des armes de destruction massive de la Faculté des sciences de la santé militaire de l’Université de la Défense; le Ministère de l’éducation, de la jeunesse et des sports, République tchèque (Projet de recherche spécifique no : SV/ FVZ201703) et PROGRES Q40/06. Merci aussi à Daniel Diaz pour son aimable aide à la révision de la langue anglaise.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 6 puitsTPP92406Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488Jackson ImmunoResearch111-546-047AffiniPure F(ab' ? Fragment de chèvre Anti-Lapin IgG
Anti-Tubuline &gamma ;Sigma-AldrichT5192Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12ATCCCRL-1772Myoblast (souris)
Cy3Sigma-AldrichC2181Anti-Mouse IgG (molécule entière) F(ab&prime ;)2 fragments&ndash ; Anticorps Cy3 produit chez le mouton
Dapi (4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole)Sigma-AldrichD9542
Dulbecco´ ; s Aigle modifié´ ; s moyenThermo Scientific11960044Glycémie élevée, pas de glutamine, Gibco
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphateSigma-AldrichD8662avec MgCl2 et CaCl2, filtrée stérile, adaptée à la culture cellulaire
Sérum de veau fœtalThermo Scientific16000044Filtrée stérile, Gibco
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
MEFATCCSCRC-1039Fibroblaste embryonnaire de souris
Tubuline monoclonale anti-acétyléeSigma-AldrichT7451Anticorps monoclonal anti-acétylé de tubuline produit chez la souris
NHLFLonzaCC-2512Fibroblastes pulmonaires primaires (humain)
Sérum de chèvre normaleJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127-500GPoudre
Pénicilline-StreptomycineSigma-AldrichP078110 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine par mL dans 0,9 % de NaCl, filtré stérilement
ProLong Diamond Antifade MountantThermo ScientificP36961
Fibroblastes cutanésGracieuseté de l’Université Charles, Faculté de médecine de Hradec Krá ; amouré ;.
Couvercles carrésThermo Scientific22X22-1.5Verre borosilicaté, 22x22mm,
Carré Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
Trypsine-EDTA (0.25 %)Thermo Scientific25200072Stérile-Filtré, Gibco

Références

  1. Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
  2. Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
  3. Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
  4. Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
  5. Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
  6. Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
  7. Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
  8. Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
  9. Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
  10. Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
  11. Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
  12. Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
  13. Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
  14. Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
  15. Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
  16. Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
  17. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
  18. Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
  20. Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
  21. Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
  22. Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
  23. Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
  24. Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
  25. DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Marquage par immunofluorescencealpha tubuline ac tyl egamma tubulinefixation cellulairemicroscopie fluorescencemicroscopie confocaleculture cellulairemarquage par anticorpsmilieu de montage
Détection simple des cils primaires par immunofluorescence
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.