Activation optogénétique des voies afférentes dans les tranches de cerveau et modulation des réponses par des anesthésiques volatils

Summary

Les tranches de cerveau ex vivo peuvent être utilisées pour étudier les effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées aux entrées afférentes. L’optogénétique est utilisée pour activer indépendamment les afférences thalamocorticales et corticocorticales au néocortex non primaire, et les réponses synaptiques et réseau sont modulées avec l’isoflurane.

Abstract

Les anesthésiques influencent la conscience en partie via leurs actions sur les circuits thalamocorticaux. Cependant, la mesure dans laquelle les anesthésiques volatils affectent les composants cellulaires et de réseau distincts de ces circuits reste incertaine. Les tranches de cerveau ex vivo fournissent un moyen par lequel les chercheurs peuvent sonder des composants discrets de réseaux complexes et démêler les mécanismes potentiels sous-jacents aux effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées. Pour isoler les effets potentiels des médicaments spécifiques au type cellulaire et à la voie dans les tranches de cerveau, les chercheurs doivent être en mesure d’activer indépendamment les voies des fibres afférentes, d’identifier les populations de cellules qui ne se chevauchent pas et d’appliquer des anesthésiques volatils sur le tissu en solution aqueuse. Dans ce protocole, des méthodes pour mesurer les réponses évoquées optogénétiquement à deux voies afférentes indépendantes vers le néocortex dans des coupes de cerveau ex vivo sont décrites. Les réponses extracellulaires sont enregistrées à l’activité du réseau de dosage et des enregistrements ciblés de patch cellulaire entier sont effectués dans les interneurones positifs à la somatostatine et à la parvalbumine. L’administration de concentrations physiologiquement pertinentes d’isoflurane par le liquide céphalo-rachidien artificiel pour moduler les réponses cellulaires et de réseau est décrite.

Introduction

Les anesthésiques volatils sont utilisés partout dans divers milieux cliniques et universitaires depuis plus d’un siècle. Des classes distinctes d’anesthésiques ont des cibles moléculaires uniques, souvent sans chevauchement ^1,2,3, mais presque toutes produisent une perte de conscience. Bien que leurs effets comportementaux soient assez prévisibles, les mécanismes par lesquels les anesthésiques induisent une perte de conscience sont largement inconnus. Les anesthésiques peuvent finalement influencer à la fois le niveau et le contenu de la conscience via des actions sur les circuits corticothalamiques, perturbant l’intégration de l’information dans toute la hiérarchie corticale 4,5,6,7,8,9. Plus largement, la modulation des circuits corticothalamiques peut jouer un rôle dans expérimentalement 10 ou pharmacologiquement 11 états altérés de conscience, et peut également être impliquée dans le sommeil¹² et dans les troubles physiopathologiques de la conscience ^13,14.

Le caractère insaisissable des mécanismes sous-jacents à la perte et au retour de conscience pendant l’anesthésie peut être attribué en partie aux actions synergiques non linéaires des anesthésiques aux niveaux cellulaire, du réseau et des systèmes¹⁵. L’isoflurane, par exemple, supprime l’activité dans les régions cérébrales sélectionnées 16,17,18, altère la connectivité entre les régions cérébrales distantes ^{19,20,21,22,23} et diminue les réponses synaptiques d’une manière spécifique à la voie ^24,25 . Les effets des anesthésiques, du niveau moléculaire au niveau systémique, sont nécessaires ou suffisants pour provoquer une perte de conscience restent incertains. En plus des recherches cliniques substantielles de la conscience utilisant des techniques non invasives 19,20,26^, il est important que les expérimentateurs cherchent à démêler les interactions cellulaires et de réseau distinctes qui sous-servent l’expérience consciente.

En simplifiant les interactions complexes trouvées dans le cerveau intact, les tranches de cerveau ex vivo permettent l’étude de composants isolés des systèmes dynamiques du cerveau⁹. Une préparation en tranches réduites combine les avantages des structures anatomiques relativement intactes des circuits neuronaux locaux avec la polyvalence des manipulations in vitro. Cependant, jusqu’à récemment, des contraintes méthodologiques ont empêché l’étude des propriétés synaptiques et des circuits des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau^27,28; Le chemin tortueux des voies fibreuses corticothalamiques rendait l’activation des voies afférentes indépendantes pratiquement impossible par stimulation électrique.

L’étude des effets des agents anesthésiques sur les préparations de tranches de cerveau présente des défis supplémentaires. En l’absence d’un système respiratoire et circulatoire intact, les agents anesthésiques doivent être appliqués au bain et les concentrations doivent être soigneusement adaptées aux concentrations estimées au site d’effet. Pour de nombreux anesthésiques intraveineux, la lenteur de l’équilibre dans le tissu rend les investigations pharmacologiques traditionnelles laborieuses^29,30. L’étude des effets des anesthésiques gazeux volatils dans les préparations ex vivo est plus facile à traiter, mais présente également des défis. Il s’agit notamment de convertir les doses de pression partielle inhalées en concentrations aqueuses et de la nécessité d’un système d’administration modifié du médicament dans les tissus par le liquide céphalo-rachidien artificiel³¹.

Ici, des méthodes sont décrites par lesquelles les chercheurs peuvent capitaliser sur les propriétés physico-chimiques bien documentées de l’isoflurane anesthésique volatil pour l’administration de médicaments à des tranches de cerveau ex vivo, activer des entrées spécifiques à la voie et à la couche dans une zone d’intérêt corticale avec une résolution spatio-temporelle élevée, et effectuer simultanément des enregistrements laminaires et des enregistrements ciblés de pinces patch à partir de populations sélectionnées de neurones. Combinées, ces procédures permettent aux chercheurs de mesurer les changements volatils induits par l’anesthésique dans plusieurs propriétés de réponse électrophysiologique observables, du niveau synaptique au niveau du réseau local.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’École de médecine de l’Université du Wisconsin-Madison et le Comité de soin et d’utilisation des animaux de santé publique.

1. Des souris reproductrices pour exprimer une protéine rapporteur fluorescente dans des sous-populations interneuronales

1. Associez une souris mâle tdTomato homozyoge dépendante de Cre à une souris femelle SOM-Cre homozygote ou à une souris femelle PV-Cre homozygote.
   REMARQUE: D’autres populations neuronales spécifiques peuvent être ciblées en utilisant les lignées Cre appropriées.
2. Laissez la progéniture hétérozygote mûrir jusqu’à l’âge d’au moins 3 semaines avant de procéder. Pour les expériences décrites ici, le génotypage n’est pas nécessaire, car les parents homozygotes produisent une progéniture qui est hétérozygote pour la recombinase Cre recombinase spécifique au type cellulaire et les allèles rapporteurs Cre-dépendants.

2. Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale de construction virale

1. Réglez les réglages de l’extracteur de micropipettes pour les pipettes d’injection comme indiqué dans le manuel d’utilisation de l’instrument (voir le tableau 1 pour les réglages recommandés). Tirez sur la micropipette en verre.
2. Casser l’extrémité de l’extrémité tranchante de la pipette de telle sorte que le diamètre de l’embout soit d’environ 30 μm avec une conicité minimale sur plusieurs millimètres.
3. À l’aide de procédures documentées précédemment, décider du titre et du volume appropriés de virus à injecter. Dans les expériences décrites ici, 1,0 μL (titre: 3,1-5,7 TU / mL) injecté unilatéralement a donné de bons résultats.
4. Remplissez le volume complet de la pipette avec de l’huile minérale. Chargez la pipette sur la microseringue et faites couler une petite quantité d’huile minérale à travers l’embout pour vous assurer que l’embout n’est pas bouché.
5. Remplir au début au moins 1,0 μL de construction virale. Le vecteur viral adéno-associé recombinant utilisé dans ces expériences était AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Disposez un champ stérile dans une zone chirurgicale. Stérilisez les outils pour la procédure stéréotaxique et placez-les sur le rideau.
7. Anesthésier SOM-tdTomate ou PV-tdTomate hétérozygote animal en utilisant de l’isoflurane (3% pour l’induction, 1,5-2% pour l’entretien) et un mélange d’oxygène. Confirmer périodiquement le niveau chirurgical de l’anesthésie avec pincement des orteils tout au long de la chirurgie. Assurez-vous que l’animal ne va pas au-delà du plan chirurgical de l’anesthésie en surveillant les respirations toutes les 10 à 15 minutes.
8. Rasez le haut de la tête de l’animal. Appliquez généreusement de l’alcool isopropylique à 70% et une solution à base d’iode sur la zone chirurgicale et une pommade ophtalmique sur les orbites pour éviter le dessèchement de la membrane. Administrer bupivacaïne/lidocaïne (rapport 1:1, 1,0 mg/kg) par voie sous-cutanée au site chirurgical pour l’anesthésie locale.
9. Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique.
10. Utilisez le scalpel pour faire une incision le long de l’axe sagittal de la peau recouvrant la surface dorsale du crâne. Rétractez la peau à l’aide d’une pince. Hydrater le crâne avec une solution saline à 0,9% si nécessaire.
11. Sur la surface du crâne, marquez légèrement l’intersection des coordonnées antérieures et latérales avec une croix au crayon. Percer un trou aux coordonnées appropriées dans le plan transversal (en mm par rapport à Bregma, pour l’injection du cortex cingulaire (Cg) : antérieure 0,2, latérale 0,3 ; pour l’injection postérieure du thalamus (Po) : postérieure 2,25, latérale 3,4).
    NOTA : Les marquages doivent s’étendre au-delà des limites du trou de bavure pour fournir des indications pour le placement précis de la pipette.
12. Allumez et équilibrez la table d’air.
13. Repositionner le manipulateur d’électrode du cadre stéréotaxique à 0° pour les injections dans Cg, ou à 45° dans le plan coronal pour les injections dans Po.
14. Fixez la pompe à seringue au manipulateur d’électrodes. Fixez le contrôleur de la pompe à microseringue à la pompe à seringue.
15. Naviguez à l’extrémité de la pipette près (mais sans toucher) la surface du cerveau, à l’intersection des marques créées à l’étape 2.11. Faire avancer la pipette d’environ 1 mm/s le long de son axe longitudinal dans le cerveau soit 0,9 mm (injection en Cg) ou 3,1 mm (injection en Po). Attendez 10 minutes avant de continuer.
16. Injecter 1,0 μL de construction virale sur une période de 10 minutes (100 nL/min). Si l’on observe un écoulement du virus à partir du site d’insertion de la pipette, ralentir le débit d’injection à 50 nL/min.
17. Après l’injection, attendez 10 minutes avant de rétracter lentement la pipette d’injection.
18. Suture pour fermer l’incision du cuir chevelu et administrer 2-5 mg / kg de méloxicam par voie sous-cutanée.
19. Arrêter l’isoflurane et surveiller l’animal pendant l’émergence de l’anesthésie. Laisser reposer selon les procédures décrites par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement, y compris l’administration ultérieure d’analgésiques.

3. Préparation de tranches de cerveau aiguës

1. Attendez au moins 3 semaines pour l’expression de la construction virale avant de prélever du tissu.
2. Préparer 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel pour la procédure de tranchage (tranchage du liquide céphalo-rachidien artificiel, sACSF). Voir le tableau 2 pour les ingrédients.
3. Tout au long de la procédure de tranchage, fournir au sACSF un mélange dissous à 95 % d’O, 2/5 % de CO₂, livré par tube de dispersion de gaz.
4. Préparez un bain glacé pour le microtome à lame vibrante. Montez le stade d’échantillon glacé sur microtome et fixez la lame de saphir en place pour la section des tissus.
5. Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane et d’oxygène jusqu’à perte du réflexe de redressement.
6. Décapitater la souris à l’aide d’une guillotine et immerger immédiatement la tête dans 4°C sACSF. Pour préserver la santé du tissu, effectuez les étapes suivantes le plus rapidement possible.
7. Ouvrez la cavité du crâne en faisant une petite incision à la base du crâne et en retirant doucement chaque plaque crânienne. Retirez délicatement la dure-mère sous-jacente.
8. Pendant que le cerveau est encore dans la cavité du crâne, utilisez la lame de rasoir pour enlever le cervelet. Faites une deuxième coupe verticale le long du plan sagittal dans l’hémisphère gauche, juste latéralement à la ligne médiane.
9. Préparer le bloc de tissu pour la section.
   1. Soulevez doucement le cerveau de la cavité crânienne. Placez le cerveau sur le papier filtre avec le plan plat et sagittal vers le bas. Guidez le papier filtre sur le gabarit de blocage et alignez le cerveau sur le contour du modèle sous-jacent (Figure supplémentaire 1).
   2. Faites deux coupes parallèles dans le plan coronal comme indiqué par les lignes sur le gabarit. Ajouter une petite goutte de sACSF pour garder le papier filtre humide, si nécessaire.
   3. Placer brièvement le bloc tissulaire dans un sACSF à 4°C pendant que l’étape 3.8.4 est effectuée.
   4. Appliquez une petite quantité de super colle sur le stade de l’échantillon glacé.
   5. Soulevez le bloc tissulaire du sACSF froid. Utilisez le coin d’une serviette absorbante pour évacuer l’excès de sACSF. Collez le plan coronal postérieur du bloc tissulaire au stade de l’échantillon, avec la surface dorsale du cerveau face à la lame de saphir.
10. Recueillir des tranches de cerveau coronal de 500 μm d’épaisseur. Placer les tranches d’intérêt sur un treillis de nylon (figure supplémentaire 2) à 34 °C sACSF et laisser le récipient atteindre la température ambiante.
    NOTE: Pour les expériences décrites ici, des enregistrements électrophysiologiques ont été recueillis à partir d’une section coronale centrée à environ 2,25 mm en arrière du bregma pour étudier une aire sensorielle non primaire, le cortex visuel secondaire médian (V2MM).

4. Préparation de poches expérimentales de liquide céphalo-rachidien artificiel (eACSF) contenant de l’isoflurane anesthésique volatil dissous

1. Préparer 300 mL d’un mélange de bouillon d’isoflurane à 3,0 %.
   1. Dans un sac de gaz en polytétrafluoroéthylène scellé, ajouter ~100 mL de mélange gazeux O 2/5% CO₂ à 95% à 20-30 mL d’isoflurane liquide et une petite quantité de solution saline à 0,9%. Attendre au moins 30 minutes pour permettre l’équilibrage de l’isoflurane entre les phases liquide et gazeuse.
   2. Déterminer la quantité d’isoflurane saturé gazeux, V_sat, à ajouter au sac de stock à l’aide de l’équation suivante :
      
      où P%stock est la composition cible du gaz stock (3% dans ce cas), V_stock est le volume final du sac de gaz _stock, P isoflurane est la pression partielle de_{l’isoflurane} à température ambiante (~240 mmHg) et P_total est la pression atmosphérique (~760 mmHg).
   3. Ajouter la quantité calculée de gaz saturé dans un sac de gaz vide et remplir le sac avec un volume de mélange gazeux O 2/5% CO₂ à 95% pour porter le volume total du sac de stock à 300 mL.
2. Préparer 2 L de liquide céphalo-rachidien artificiel pour la perfusion de la tranche pendant l’expérience (ACSF expérimental, eACSF). Voir le tableau 2 pour les ingrédients. Dissoudre le mélange gazeux à 95 %_O-2/5 % de CO₂ dans la solution.
3. Préparer deux sacs séparés de solutions de contrôle et d’isoflurane.
   1. Dans un sac de gaz polytétrafluoroéthylène vide, ajouter 600 mL d’eACSF et 600 mL de mélange gazeux à 95 % O 2/5 % CO₂. Étiquetez ce sac comme Contrôle.
   2. Dans un autre sac de gaz en polytétrafluoroéthylène vide, ajouter 300 mL d’eACSF. Étiquetez ce sac comme Isoflurane.
   3. Choisissez une concentration en phase gazeuse équilibrée physiologiquement pertinente de l’isoflurane. Des expériences ont été menées en utilisant des concentrations de gaz équivalant à 1,3% d’isoflurane. Les souris perdent le réflexe de redressement, et probablement la conscience, à 0,9% d’isoflurane inhalé.
   4. Utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration équivalente en phase gazeuse à température ambiante, P%(T_pièce)³¹ :
      
      où P%_{(corps T}) est la concentration en phase gazeuse physiologiquement pertinente choisie à l’étape 4.3.3, la_pièce T est de 25 °C et la_teneur en T est de 37 °C.
   5. Utilisez l’équation suivante pour déterminer le volume de gaz du sac de gaz stock, V_stock, à ajouter à la solution d’isoflurane.
      
      où_{solution V} est le volume d’eACSF dans le sac ISOFLURANE (300 mL), P%_{(salle T}) est entré à partir de l’équation (2), λ est le coefficient de partage Ostwald salin/gaz de l’isoflurane (λ = 1,2³²), et P%stock est la concentration en phase gazeuse du sac de gaz stock (P%_stock = 3,0%).
   6. Dans le sac de solution d’isoflurane, ajouter le volume de gaz du sac de gaz stock, V_stock, calculé à l’étape 4.3.5.
   7. Dans le sac de solution d’isoflurane, ajouter un volume de mélange gazeux à 95 % O 2/5 % CO₂ pour porter le volume total de gaz dans le sac de solution d’isoflurane à 300 mL.
4. Agiter les sacs de contrôle et d’isoflurane sur l’agitateur pendant au moins 1 h pour permettre l’équilibrage de la phase isoflurane.
5. Une fois que toutes les données ont été recueillies, la concentration correcte peut être vérifiée à l’aide d’un moniteur de gaz anesthésique pour mesurer la concentration équilibrée d’isoflurane dans le gaz au-dessus de la solution restante dans le sac.
6. Déclarez les concentrations expérimentales de gaz volatils dans les unités aqueuses, car les concentrations millimolaires sont plus résistantes aux changements de température. Utiliser l’équation suivante pour convertir la concentration en phase gazeuse à température ambiante, P%(T_pièce), en concentration aqueuse équivalente (C_aqueuse, en mM)³¹ :
   
   où α est le coefficient de partage salin/gaz Bunsen pour l’isoflurane à 25 °C³².

5. Préparation du matériel et des logiciels pour les enregistrements multicanaux

1. Configurez un système d’acquisition de données à 16 canaux conformément aux instructions du fabricant.
   REMARQUE: Plusieurs amplificateurs et systèmes d’acquisition de données disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour collecter des enregistrements multicanaux. Dans les expériences décrites ici, les signaux analogiques sont délivrés via un panneau de référence d’électrodes à deux amplificateurs, où ils sont amplifiés (2000x) et filtrés (0,1-10 kHz). Les entrées analogiques du système d’acquisition de données sont numérisées à 40 kHz.
2. Fixez l’adaptateur de coiffe à 16 canaux approprié à un micromanipulateur de microscope. Orientez l’adaptateur de manière à ce que les ports du connecteur femelle soient orientés vers le bas.
3. Réglez l’angle de fonctionnement de ce micromanipulateur de manière à ce qu’il soit orienté vers le bas vers la chambre d’enregistrement, à un angle d’environ 70° par rapport à l’horizontale.
4. Connectez l’entrée de la tête à une sonde 16 x 1 pour l’électrophysiologie in vitro via l’adaptateur de la tête ancré au micromanipulateur.
5. Connectez le connecteur de sortie de la scène de tête au système d’acquisition de données.
6. Installez le logiciel approprié pour l’acquisition de données. Configurez 15 canaux d’entrée pour qu’ils correspondent aux signaux d’entrée des 15 premiers contacts de sonde multicanaux. Configurez le canal restant pour recevoir l’entrée de l’électrode intracellulaire.
   REMARQUE: Prenez soin de tenir compte des cartes d’électrodes et d’adaptateurs lors de la collecte et de l’analyse des données, afin de vous assurer que le signal approprié correspond au contact de l’électrode à partir duquel il a été recueilli.

6. Configuration des protocoles de stimulation lumineuse

1. Configurez le système de distribution de lumière et installez le logiciel qui l’accompagne.
2. Ouvrez le logiciel. Choisissez une configuration de câblage matériel dans laquelle une source de déclenchement (sortie numérique/TTL) fournit un signal de déclenchement au système de distribution de lumière et le système de distribution de lumière fournit un signal de déclenchement à une LED de 470 nm.
3. Montez un objectif haute puissance. À l’aide d’un appareil photo numérique, calibrez l’objectif haute puissance pour une utilisation avec le système de distribution de lumière.
4. Créez une nouvelle séquence de profils de stimulation lumineuse.
   1. Créez un modèle de choix. Dans les expériences décrites ici, un cercle de diamètre 150 μm est utilisé pour permettre l’activation spécifique de la couche des terminaisons axonales.
   2. Pour construire une séquence de profils, copiez et collez ce profil pour chacun des essais.
   3. Créez une liste de formes d’onde contenant des formes d’onde de n’importe quelle intensité lumineuse, durée d’impulsion ou nombre d’impulsions.
   4. Attribuez aléatoirement des formes d’onde à chaque profil. Chaque profil avec sa forme d’onde assignée correspond à une impulsion de déclenchement d’une entrée TTL numérique, ou à un essai.
   5. Enregistrez la séquence de profils.
5. Dans le logiciel d’acquisition de données, créez un nouveau protocole.
   1. Définissez le nombre d’essais pour qu’il soit égal au nombre de profils dans la séquence de profils qui vient d’être créée.
   2. Choisissez des entrées de signal correspondant à celles configurées à l’étape 5.6. Configurez un protocole qui fournit une seule sortie TTL numérique, enregistrant à partir de ces 16 canaux d’entrée pendant une durée appropriée avant et après le déclenchement numérique.

7. Mise en place d’une sonde multicanal dans une tranche de tissu cérébral ex vivo

1. Perfuse bulle eACSF (pas dans des sacs scellés) à 3-6 mL/min.
2. Transférer la tranche de cerveau contenant la zone d’intérêt sur une grille de maillage dans une chambre de perfusion au microscope. Ancre avec harpe en platine (voir la figure supplémentaire 3).
3. Faire pivoter la grille de maillage de telle sorte que la ligne de contacts des électrodes à l’extrémité distale de la sonde multicanal soit approximativement perpendiculaire à la surface piale.
4. Sous éclairage à grand champ et sous contrôle fin du micromanipulateur, abaissez la sonde multicanal vers la surface de la tranche.
5. Faire pivoter la tourelle du cube filtrant pour engager le cube filtrant approprié pour la visualisation de la protéine rapporteur fluorescente exprimée dans les terminaisons axonales des afférences corticales. Si nécessaire, faites pivoter la tranche pour aligner plus précisément la sonde avec la surface piale.
6. Positionner la sonde juste au-dessus du plan de la tranche, à ~200 μm de la position finale de la cible le long de l’axe des abscisses, laissant au moins un canal à l’extérieur de la limite de la zone de tissu enregistrée
7. Insérez lentement la sonde dans la tranche en déplaçant le manipulateur le long de son axe longitudinal. Pour minimiser les dommages au tissu, n’avancez la sonde que dans la mesure où les pointes tranchantes sont juste visibles sous la surface du tissu. Cela minimisera les dommages au tissu tout en s’assurant que les contacts de l’électrode sont en contact avec le tissu.

8. Patch clampant les neurones ciblés et obtenant une configuration de cellule entière

1. Basculez la source eACSF vers la solution de contrôle en sac.
2. Identifiez la cellule marquée par fluorescence pour l’enregistrement ciblé de la pince patch.
   1. Limitez le diaphragme du diaphragme de diaphragme de l’iris d’ouverture au plus petit diamètre. Engagez une lentille d’objectif de faible puissance et mettez le tissu au point.
   2. Centrez la lumière sur une zone de tissu adjacente (mais ne se chevauchant pas) à la sonde multicanaux.
   3. Engagez l’objectif d’immersion dans l’eau haute puissance (40x ou 60x), en faisant preuve de prudence pour éviter tout contact entre la sonde multicanal et la lentille de l’objectif.
   4. Faites pivoter la tourelle du cube filtrant pour engager le jeu de filtres approprié afin de permettre l’imagerie des cellules exprimant le marqueur fluorescent Cre-dépendant.
   5. Identifiez une cellule marquée par fluorescence comme cible pour l’enregistrement de la pince patch. Soulevez la lentille de l’objectif pour créer suffisamment d’espace pour abaisser une pipette de brassage.
3. Chargez une pipette brassicole (voir Tableau 1) avec une solution interne (Tableau 2) et montez la pipette dans le support d’électrode. À l’aide d’une seringue de 1 mL, appliquer une pression positive correspondant à ~0,1 mL d’air.
4. Abaissez la pipette patch dans la solution. Mettez la pointe de la pipette au point sous guidage visuel.
5. Obtenir l’enregistrement des cellules entières à partir de la cellule ciblée en suivant les étapes précédemment démontrées³³.
6. Si vous prévoyez évaluer les changements apportés aux propriétés intrinsèques de la cellule (p. ex. résistance à l’entrée, vitesse de tir du potentiel d’action en réponse aux étapes actuelles), effectuez ces enregistrements. Sinon, passez au protocole de stimulation axonale ci-dessous.

9. Activation optogénétique spécifique à la couche des terminaisons axonales

1. Manipulez le champ de vision dans le plan x-y pour aligner le profil de stimulation lumineuse avec l’emplacement souhaité sur la tranche.
2. Chargez le protocole de stimulus lumineux et préparez le système de distribution de lumière à recevoir une impulsion TTL numérique.
3. Activer optogénétiquement les terminaisons axonales tout en enregistrant simultanément les potentiels de champ extracellulaire et les fluctuations de la membrane intracellulaire.
4. Remplacer la source eACSF par une solution d’isoflurane et laver le médicament pendant 15 min. Si nécessaire, collectez les enregistrements spontanés pendant le lavage.
5. Répétez les étapes 9.2-9.3.
6. Basculer la source eACSF sur Solution de contrôle et laver le médicament pendant 20 min. Si nécessaire, recueillir les enregistrements spontanés pendant le lavage.
7. Répétez les étapes 9.2-9.3.

Results

Une chronologie des étapes décrites dans le protocole est illustrée à la figure 1. Les entrées corticales provenant de zones corticales d’ordre supérieur ou de noyaux thalamiques non primaires ont des champs terminaux qui se chevauchent partiellement dans la couche 1 du cortex visuel non primaire²⁴. Pour isoler les voies afférentes thalamocorticales ou corticocorticales indépendantes, un vecteur viral contenant ChR2 et un rapporteur fluorescent eYFP dans Po ou Cg a ét...

Discussion

Dans ce manuscrit, un protocole d’évaluation des réponses intra- et extracellulaires aux voies afférentes activées sélectivement dans des tranches de cerveau ex vivo est décrit.

L’utilisation d’outils optogénétiques et de schémas d’enregistrement parallèles permet aux chercheurs de sonder les réponses des populations locales aux entrées afférentes provenant de régions cérébrales éloignées, tout en enregistrant simultanément des populations ciblées d’interneurones. L’utilisation de la technolog...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Objectif à champ large 2,5x	Objectif	Olympus MPLFLN2,5X
40x Objectif à immersion dans l’eau	Olympus	LUMPLFLN40XW
95 % O2/5 % CO2 Mélange	Airgas	Z02OX95R2003045
A16 Sonde	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	Sonde 16 canaux
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Moniteur
(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, Sel de magnésium	Sigma Aldrich	A9187	solution intracellulaire
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Laboratory	007914	souris tdTomato dépendante
de Cre B6 ; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre souris Belly
Dancer Shaker	Thomas Scientific	1210H86-TS	pour l’équilibrage de sacs de gaz scellés Solution de
bétadine	Marque générique
	Marque		pour l’argent chlorure patch clamp électrode
Bupivicaine
Chlorure de calcium (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Verre capillaire (enregistrements par patch clamp)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Borosilicate, ID : 1,1 mm, Diamètre extérieur : 1,7 mm, Longueur : 90,0 mm
Verre capillaire (injections virales)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5"
Contrôle du micromanipulateur junior	Luigs and Neumann	SM8	pour le contrôle du micromanipulateur junior
Contrôle des manipulateurs et de la table de déplacement	Luigs and Neumann	SM7	pour le contrôle de l’électrode multicanal et Table mobile
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Numériseur et logiciel
E-3603 Tube	Fisher Scientific	14171208	pour l’administration d’un mélange gazeux 95 % O2/5 % CO2 dans la chambre d’incubation + application de pression pendant le serrage du patch
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	solution intracellulaire
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel	Neuralynx	Retiré
Aiguille de remplissage	World Precision Instruments	50821912	pour le remplissage de patchs Pince de pipettes
Cube de filtre pour l’imagerie EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Papier filtre	Fisher Scientific	09801E	pose sur le modèle de tranche pendant la préparation du bloc de tissu
Extracteur de micropipette flamboyant/brun	Sutter Instrument	P-1000	2.5x2.5 Box filament
Tube à dispersion gazeuse	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Seringue en verre (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	pour le remplissage de sacs scellés au gaz
Acide gluconique, Sel de potassium (K-gluconate)	Dot Scientific	DSG37020	solution intracellulaire
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Sel de sodium	Sigma Aldrich	G8877	solution intracellulaire
Adaptateur de sonde de tête Adaptateur de sonde	NeuroNexus	A16-OM16	pour connecter une sonde à 16 canaux à l’entrée de scène de tête
Pince hémostatique	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, solution intracellulaire
HS-16 Headstage	Neuralynx	Retraité
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Alcool isopropylique (70 %)	VWR International	101223-746
Micromanipulateur junior	Luigs and Neumann	210-100 000 0090-R	pour la manipulation de l’électrode patch clamp Module de contrôle de
source lumineuse LED	Mightex	BLS-PL02_US	contrôle de la source lumineuse optogénétique
Lidocaine
Lynx-8 Amplifier	Neuralynx	Retired
Lynx-8 Power Supply	Neuralynx	Retired
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Cube de filtre rouge	Chroma	49008	pour l’imagerie tdTomato fluorescent reporter
Meloxicam
Porte-micropipette	Fisher Scientific	NC9044962
Pompe à microseringue	World Precision Instruments	UMP3-4
Huile minérale	Marque
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Amplificateur
Azote (pour table d’air)	Airgas	NI200
Maille en nylon	Fisher Scientific	501460083	tendue sur un fer à cheval de fil de platine aplati, une tranche repose sur ce dessus pendant les enregistrements
Nylon, coupé dans des collants	Marque générique		petite pièce pour créer une plate-forme de tranche dans la chambre d’incubation, fibres simples pour créer une harpe en platine
Pommade ophtalmique	Fisher Scientific	NC1697520
Pipette	Dot Scientific	307	Pour le transfert de tissu vers le montage Fil
platine	VWR International	BT124000	2 cm, aplati, pour fabriquer une harpe en platine
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	système de distribution de lumière optogénétique, livré avec le logiciel PolyScan2
Chlorure de potassium (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Phosphate de potassium (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Lame de rasoir	Fisher Scientific	12-640
Lame saphir (pour vibratome)	VWR International	100492-502
Lame de scalpel	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Sac à gaz scellé	Fisher Scientific	109236
Table mobile pour microscope	Luigs et Neumann	380FMU
Bicarbonate de sodium (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Chlorure de sodium (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, solution intracellulaire
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	Le Jackson Laboratory	013044	souris SOM-Cre
Instrument stéréotaxique	Kopf	Modèle 902	Dual Small Animal
Super colle	Agrafes	886833	pour fixer le bloc de tissu à l’étape de l’échantillon pendant la préparation de la tranche
Perceuse chirurgicale	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Seringue Microtorque II
(1 mL) avec embout LuerLock	Fisher Scientific	309628	pour l’application de pression pendant le serrage du patch
Seringue (1 mL) avec embout coulissant	WW Grainger, Inc.	19G384	pour le remplissage patch pince pipettes
Seringues Filtres	VWR International	66064-414
Microscope droit	Olympus	BX51
Microtome vibrant	Leica Biosystems	VT1000S
Wypall serviettes	Fisher Scientific	19-042-427