Article de méthode

Préparation des microenvironnements de matrice extracellulaire tunable pour évaluer les spécifications du phénotype de cellules de Schwann

DOI :

10.3791/61496

⸱

2 juin 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthodologie vise à illustrer les mécanismes par lesquels les signaux de matrice extracellulaire tels que la rigidité du substrat, la composition des protéines et la morphologie cellulaire régulent le phénotype des cellules Schwann (SC).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les blessures du système nerveux périphérique traumatique (PNS) manquent actuellement de traitements appropriés pour retrouver le rétablissement fonctionnel complet. Les cellules schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, jouent un rôle vital dans la promotion de la régénération du PNS en dédifférantiant en un phénotype de cellules régénératrices à la suite d’une blessure. Cependant, l’état dédifférencié des SC est difficile à maintenir pendant la période de temps nécessaire à la régénération et est affecté par les changements dans la matrice extracellulaire environnante (ECM). Par conséquent, il est essentiel de déterminer l’interaction complexe entre les CSC et les DIFFÉRENTS CPE pour fournir des indices de potentiel régénérateur des SC. Pour remédier à cette situation, une stratégie a été créée où différentes protéines ECM ont été adsorées sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) tunable qui a fourni une plate-forme où la rigidité et la composition des protéines peuvent être modulées. Les SC ont été ensemencés sur les substrats tunables et des fonctions cellulaires critiques représentant la dynamique du phénotype sc ont été mesurées. Pour illustrer l’interaction entre l’expression des protéines SC et la morphologie cellulaire, les différentes densités d’ensemencement des SC en plus des modèles cellulaires imprimés individuels de microcontact ont été utilisées et caractérisées par la coloration d’immunofluorescence et la tache occidentale. Les résultats ont montré que les cellules avec une plus petite zone de propagation et une plus grande étendue de l’élongation cellulaire ont favorisé des niveaux plus élevés de marqueurs phénotypiques régénératifs de SC. Cette méthodologie commence non seulement à démêler la relation significative entre l’ECM et la fonction cellulaire des SC, mais fournit également des lignes directrices pour l’optimisation future des biomatériaux dans la réparation des nerfs périphériques.

Introduction

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Les blessures du système nerveux périphérique (PNS) demeurent un défi clinique majeur dans les soins de santé en compromettant la qualité de vie des patients et en créant un impact significatif à travers une multitude de facteurs socio-économiques1,2. Les cellules de Schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, fournissent les indices moléculaires et physiques nécessaires pour induire la régénération de PNS et aident aux rétablissements fonctionnels dans les blessures à court écart. Cela est dû à la capacité remarquable des SC de dédifférentier dans un phénotype cellulaire de « éparatio » à partir d’un phénotype myélin ou remak3. La réparation SC est un phénotype cellulaire distinctif de plusieurs façons. Après dommage, les SC augmentent leur taux de prolifération en réintant le cycle cellulaire et commencent l’expression de plusieurs facteurs transcriptionnels pour faciliter la réinnervation. Ces facteurs, tels que c-Jun et p75 NTR, sont upregulated tandis que les marqueurs de SC myélinants, tels que la protéine de base de myéline (MBP), sont downregulated4,5. En outre, les SC changent de morphologie pour qu’ils s’allongent et s’alignent les uns avec les autres pour former des bandes de Büngner sur le site de la blessure6. Cela fournit un mécanisme de guidage physique pour les axones à s’étendre à la cible distale correcte7. Cependant, en dépit de la capacité que les SC possèdent pour favoriser la régénération de nerf dans les dommages courts d’écart, le résultat de la récupération fonctionnelle reste pauvre dans les dommages graves. Cela est dû en partie à la perte de signaux d’orientation de matrice extracellulaire (ECM), ainsi qu’à l’incapacité des SC à maintenir le phénotype régénératif sur de longues périodes de temps8.

Le processus de régénération et de récupération des nerfs sont intimement liés à l’état de la lamina basale suite à une blessure. La lamina basale est une couche d’ECM autour du nerf qui facilite l’orientation et fournit des indices liés à l’ECM pour les axones et les SC dans les cas où il reste intact à la suite d’une blessure9. L’état de l’ECM et sa capacité à fournir des signaux liés à la matrice aux cellules est d’une importance vitale et a déjà été exploré dans une variété de contextes différents10,11,12,13,14. Par exemple, il a été démontré que la rigidité de l’ECM peut guider les fonctions cellulaires telles que la prolifération et la différenciation11,15,16. La composition de l’ECM peut également conduire à une réponse cellulaire distincte et réguler les comportements cellulaires tels que la migration et la différenciation par les voies de signalisationintracellulaires 17,18. En outre, la morphologie cellulaire, y compris la zone d’épandage et l’allongement cellulaire, jouent un rôle majeur dans la régulation de la fonction et peuvent être régies par des signaux liés à l’ECM19,20. De nombreuses études antérieures se sont concentrées sur les cellules souches différenciant en lignées définies, mais les SC possèdent une capacité similaire de modifier le phénotype d’un SC homéostatique et adulte dans un nerf sain, à un SC de réparation capable de sécréter des protéines et des facteurs de croissance tout en remodelant l’ECM suite à une lésion nerveuse5,21. Par conséquent, il est particulièrement crucial d’identifier les mécanismes sous-jacents à la relation entre la capacité régénératrice innée sc et les indices liés ECM pour la perspicacité d’exploiter en fin de compte cette capacité de régénération nerveuse.

Pour remédier à cette situation, nous avons développé une méthodologie détaillée pour produire un substrat de culture cellulaire où la rigidité mécanique et le type de ligand peuvent être facilement réglés dans des gammes physiologiquement pertinentes. Polydiméthyl siloxane (PDMS) a été choisi comme substrat en raison de sa mécanique très tunable par rapport au gel polyacrylamide, où le module maximum de Young est d’environ 12 kPa contrasté à PDMS à environ 1000 kPa22,23,24. Ceci est bénéfique pour le travail à portée de main, comme des études récentes ont montré le module du jeune d’un nerf sciatique lapin peut dépasser 50 kPa pendant le développement, ce qui suggère que la gamme de rigidité des nerfs dans le PNS est plus large que précédemment examiné. Différentes protéines sont capables d’adsorption sur les substrats PDMS pour analyser la régulation combinatoire de la mécanique et des ligands sur le comportement SC. Cela permet d’enquêter sur plusieurs indices microenvironnementaux présents dans le processus de régénération du PNS et de comparer un degré élevé de thonilité au travail axé uniquement sur la rigidité du substrat25. De plus, ces substrats de culture cellulaire conçus sont compatibles avec une multitude de méthodes d’analyse quantitative telles que l’immunohistochimie, la tache occidentale et la réaction quantitative en chaîne de polymérase (q-PCR).

Cette plate-forme de culture cellulaire conçue est très appropriée pour analyser les voies mécanistes en raison du niveau élevé de thonabilité individuelle de chaque signal lié à l’ECM. En outre, des méthodes populaires pour le micropatternage cellulaire, y compris l’impression de microcontacts, peuvent être réalisées sur les substrats pour permettre l’adhérence cellulaire contrôlée pour analyser la forme cellulaire par rapport à d’autres signaux liés ECM24. Ceci est essentiel parce que les substrats à motifs de lignée, qui favorisent l’allongement dans les populations cellulaires, fournissent un outil pour imiter et étudier les SC allongés et régénératifs dans les bandes de Büngner pendant la régénération nerveuse. En outre, la morphologie cellulaire est un puissant régulateur des fonctions cellulaires multiples et peut potentiellement introduire des résultats expérimentaux confondants si elle n’est pas contrôlée26,27. Une attention particulière est maintenant accordée aux mécanismes régissant le phénotype régénératif sc tel que réglementé par les indices ECM28,29,30. Ceci est essentiel pour fournir un aperçu de la conception des biomatériaux qui peuvent être appliqués comme conduits d’orientation nerveuse pour l’aide dans la régénération des nerfs PNS. Ces protocoles détaillés peuvent finalement être appliqués comme un outil potentiel pour déchiffrer les mécanismes de sc et d’autres fonctions de type de cellule telles que réglées par les indices liés ecm.

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Protocole

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1. Préparation et caractérisation du substrat de culture cellulaire tunable

  1. Préparation du substrat
    1. Mélanger vigoureusement l’élastomère de base PDMS et les agents de durcissement à l’aide d’une pointe de pipette à un rapport compris entre 10:1 et 60:1 jusqu’à ce que les bulles soient dispersées de façon homogène dans le mélange. Enlever les bulles à l’aide de la dessiccation sous vide jusqu’à ce que les bulles soient dissipées.
      REMARQUE : Pendant la polymérisation de PDMS, l’agent de durcissement croise avec l’élastomère de base pour fournir les propriétés mécaniques désirées par le polymère final. Les rapports crosslink peuvent être ajustés pour modifier la rigidité du PDMS.
    2. Déposer une goutte (~0,2 mL) de mélange PDMS desséché sur une couverture carrée ou circulaire (p. ex., 22 mm x 22 mm) et faire pivoter la lame sur un coacker à 2500 tr/min pendant 30 s.
    3. Incuber le couvercle dans un four à 60 °C pendant 1-2 h ou à température ambiante pendant la nuit pour que le PDMS se solidifie.
    4. Traiter la couverture à l’aide d’un nettoyant UV-Ozone pendant 7 min (longueur d’onde UV : 185 nm et 254 nm) pour augmenter l’hydrophilicité de surface. Placez-le dans une assiette stérilisée de 6 puits.
    5. Avant d’utiliser pour la culture cellulaire, incuber les substrats dans 70% d’éthanol pendant au moins 30 min.
      ATTENTION : Le nettoyant UV-Ozone peut générer de l’ozone nocif pour l’homme. Travailler dans une hotte de fumée chimique ou avec une certaine forme de ventilation.
    6. Immerger les couvercles dans la solution protéique (collagène I 10 μg/mL, fibronectine ou laminine) pendant 60 min dans un incubateur stérile à 37 °C.
      REMARQUE : Après le traitement UV-Ozone, la surface du PDMS peut encore être hydrophobe. Faites pivoter la plaque de puits pour vous assurer que chaque couvercle est recouvert de la solution protéique.
    7. Apirate la solution protéique et laver la couverture avec phosphate tamponné saline (PBS) 3x.
    8. Re-suspendre rt4-D6P2T schwann ligne de cellules (SC) de passer à plat en utilisant la solution EDTA disponible dans le commerce (1x) avec 2,5% trypsine et compter les cellules avec l’hémocytomètre. Scs de semences sur la surface tunable PDMS à la densité cellulaire souhaitée. Les densités d’ensemencement sc peuvent varier pour chaque application.
    9. Maintenir les cellules dans les paramètres de culture cellulaire souhaité (90% d’humidité, 5% de CO2,37 °C, etc.) pour la durée de l’expérience. Utilisez le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine comme milieu de culture cellulaire.
  2. Préparation du substrat micropatterné
    1. Dessiner les zones de géométrie et d’adhésif cellulaire souhaitées (900 μm2, 1 600 μm2 et 2 500 μm2) à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Créez un masque photocomme chromé basé sur ces modèles auprès d’un fournisseur commercial.
    2. Dans une pièce propre ou un environnement sans poussière, utilisez des techniques standard de photolithographie pour fabriquer des plaquettes de silicium (les protocoles sont détaillés ailleurs31). Les paramètres critiques pour cette application particulière sont les suivants: Photoresist: SU-8 2010; Profil de rotation pour disperser le photorésiste : 500 tr/min pour 10 s avec une accélération de 100 tr/min/s, puis 3500 tr/min pour 30 s avec une accélération de 300 tr/min/s; Énergie d’exposition de la lumière UV : 130 mJ/cm2.
      REMARQUE : La hauteur des motifs sur les plaquettes de silicium est d’environ 10 μm suivant ces paramètres. Les fissures potentielles autour du bord à l’extérieur des motifs rectangulaires ou triangulaires peuvent être vues à l’aide d’un microscope léger après l’étape 1.2.2. La cuisson de la plaquette de silicium à 190 °C pendant 30 min aide à éliminer les fissures.
    3. Placez la plaquette de silicium à motifs à l’intérieur d’une boîte de Pétri circulaire de 150 mm de diamètre x 15 mm de hauteur et versez le PDMS dét gazé (rapport de mélange 10:1) tel qu’il est préparé à l’étape 1.1.1 sur la plaquette de silicium.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’épaisseur du PDMS est d’au moins 5 mm pour faciliter la manipulation pendant les étapes d’impression de microcontact.
    4. Solidifier le PDMS sur la plaquette de silicium dans un four à 60 °C pendant la nuit. Laisser refroidir le PDMS à température ambiante. Timbres coupés avec précision de carrés de 30 mm x 30 mm contenant les motifs corrects de la plaquette de silicium à l’aide d’un scalpel chirurgical. N’endommagez pas la plaquette de silicium.
      REMARQUE : Les plaquettes de silicium peuvent être réutilisées plusieurs fois à ce stade pour produire plus de timbres après le nettoyage avec de l’isopropanol.
    5. Stériliser les timbres PDMS et les couvercles tunables (préparés à l’étape 1.1.1 à 1.1.3) en les immergeant dans 70% d’éthanol pendant 30 min.
    6. Pour confirmer l’efficacité des micropatternes par les timbres PDMS après l’impression de microcontacts, séchez la surface des timbres PDMS à l’aide d’un flux d’air filtré et d’une solution de pipette 50 μg/mL BSA (Texas Red conjugué) pour couvrir tout le côté à motifs du timbre PDMS.
    7. Incuber les timbres PDMS avec la solution BSA pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption protéique.
    8. Sécher la surface des couvercles tunables à l’aide d’un flux d’air filtré, augmenter l’hydrophilicité de surface telle que décrite à l’étape 1.1.5.
    9. Sécher à l’air les timbres PDMS pour enlever la solution BSA restante.
      REMARQUE : Veillez à ce que la solution BSA soit complètement retirée du timbre, car toute solution restante fera glisser les timbres sur le couvercle pendant l’impression de microcontact.
    10. Mettre le côté à motifs du timbre en contact conformal avec le couvercle tunable pour l’adsorption BSA sur la surface de couverture. Appuyez doucement sur le timbre contre le couvercle pendant 5 min.
      REMARQUE : N’appliquez pas une force excessive sur le timbre puisqu’il se pliera et provoquera un contact non spécifique entre le timbre et le couvercle. La force appropriée appliquée sur le timbre est essentielle pour l’impression réussie de microcontact.
    11. Examiner le micropattern à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’aide d’un filtre FITC (Fluorescein isothiocyanate).
    12. Pour imprimer des zones adhésives cellulaires plutôt que des motifs fluorescents, remplacez la laminine par la protéine BSA et répétez l’étape 1.2.5 à 1.2.10.
    13. Retirer les timbres des couvercles, transférer les couvercles dans une plaque stérilisée de 6 puits. Ajouter 2 mL de 0,2% w/v Solution Pluronic F-127 dans chaque puits pour couvrir la surface du couvercle et incuber pendant 1 h à température ambiante.
      REMARQUE : Le Pluronic F-127 peut être adsorbé à la surface de PDMS augmentant l’hydrophobicité de la surface de PDMS pour bloquer les cellules de l’adhérence.
    14. Apirate pluronic F-127 solution et laver 5x avec PBS et 1x avec le milieu de culture cellulaire avant l’ensemencement des cellules. Une densité d’ensemencement typique pour les SC est de 1 000 cellules/cm2.
    15. 45 min après l’ensemencement cellulaire, retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les couvercles avec PBS 2x pour empêcher plusieurs SC d’adhérer au même modèle. Maintenir les cellules dans l’environnement de culture cellulaire souhaité pendant 48 h avant la quantification.
    16. Pour créer des substrats de culture cellulaire à motifs de ligne pour examiner les cellules alignées, suivez l’étape 1.2.1 à 1.2.4 pour créer des timbres pour l’impression de microcontacts.
      REMARQUE : Les dimensions de la rainure/crête des motifs doublés sur le timbre sont de 50 μm x 50 μm pour les cellules décrites. Les dimensions totales du timbre sont de 10 mm x 10 mm.
    17. Couper les timbres en dimensions contenant uniquement les motifs de ligne souhaités.
      REMARQUE : Lors de la création de timbres en CAO, la zone non patternée du timbre autour des motifs de ligne correspondra à la zone adhésive cellulaire suivant l’impression de microcontact. Ainsi, il est nécessaire d’éliminer les zones nonpatrées lors de la coupe du timbre pour s’assurer que chaque SC ensemencé sur la surface suit les modèles.
    18. Suivez l’étape 1.1.1 à 1.1.3 pour préparer le revêtement de surface de PDMS tunable de deux plats de Petri.
      REMARQUE : Il s’agira de PDMS couvrant la surface de la boîte de Pétri elle-même et non sur un couvercle.
    19. Suivez l’étape 1.2.5 à 1.2.10 pour effectuer l’impression de microcontact pour imprimer des zones d’adhésif cellulaire à motifs de ligne sur l’un des plats de Petri enduits de PDMS.
      REMARQUE : La surface d’une boîte de Pétri de 60 mm x 15 mm peut contenir des zones à motifs de ligne à partir de 6 timbres PDMS.
    20. Retirer les timbres et remplir la boîte de Pétri de 4 mL de 0,2% w/v Pluronic F-127 solution et incuber pendant 1 h.
    21. Après l’impression de microcontact, rincer chaque côté des timbres PDMS avec 70% d’éthanol 3x et sécher avec de l’air. Faites pivoter les timbres PDMS et suivez l’étape 1.2.5 à 1.2.10 pour imprimer la zone adhésive de cellules nonpatternées en utilisant le côté nonpatterné du timbre sur la deuxième boîte de Pétri. Répétez l’étape 1.2.13.
    22. Aspirate F-127 solution de vaisselle, laver 3x avec PBS suivi avec 1x lavage en utilisant le milieu de culture cellulaire fraîche. Scs de semence sur les plats.
      REMARQUE : La densité d’ensemencement d’un plat à motifs de ligne est de 5 000 cellules/cm2 et pour un plat non patterné est de 10 000 cellules/cm2.
    23. Maintenir les SC aux conditions souhaitées pendant 48 h et suivre les protocoles pour préparer les lysates SC32.
      REMARQUE : La densité d’ensemencement cellulaire pour les plats non patternés est 2 fois plus élevée que celle des plats à motifs en ligne, car le plat à motifs de ligne n’a que la moitié de la zone adhésive cellulaire du plat non patterned.
      1. Pour préparer des lysates, transférer un tampon d’essai de radioimmunoprécipitation adéquat (RIPA) dans un tube de centrifugeuse conique de 10 mL. Diluer la protéase et l’inhibiteur de la phosphatase (100x) à un rapport de 1:100 dans le tampon RIPA, bien mélanger par pipetage.
      2. Laver les cellules avec pbs glacé (1x) pendant 2 min, ajouter 80 μL de la solution préparée à partir de l’étape 1.2.23.1 sur chaque zone adhésive cellulaire (la zone qui a contacté avec des timbres PDMS et des protéines adsorbées) dans les plats de Petri. Incuber les cellules avec la solution sur un bloc de glace pendant 15 min.
        REMARQUE : La solution ne restera que sur la zone adhésive cellulaire en raison de l’hydrophobicité de l’adsorption Pluronic F-127 ailleurs. Cette fonctionnalité permet une extraction de protéines réussie et suffisante pour les SC à motifs de ligne.
      3. Gratter les SC à l’aide d’un grattoir cellulaire pendant 5 min. Recueillir le lysate dans un tube de microcentrifuge étiqueté de 1,5 mL.
      4. Microcentrifuge lysate à 12 000 x g pendant 15 min à 4°C. Recueillir le supernatant avec une pipette de 1 000 μL et transférer dans un tube de microcentrifuge propre. Conserver le lysate cellulaire à -20 °C.
  3. Caractérisation du substrat
    REMARQUE : Pour caractériser la mécanique du polymère sur le couvercle, plusieurs méthodes sont généralement utilisées, y compris les essais de compression en vrac11,,33 ou les essais de microscopie à force atomique34. Ce protocole décrit les tests de compression en bloc.
    1. Verser le précurseur PDMS du rapport de mélange souhaité (étape 1.1) dans une boîte de Pétri de 30 mm, assurez-vous que l’épaisseur de la couche PDMS dans la boîte de Petri est d’au moins 20 mm.
    2. Retirer la boîte de Pétri avec le PDMS solidifié du four à 60 °C après 1 h et laisser refroidir à température ambiante. Couper le polymère en carrés de 10 mm x 10 mm. Mesurer l’épaisseur du PDMS à l’aide d’étriers.
    3. Placez le PDMS sur le stade de la machine de mesure de force de compression. Branchez le capteur de force de compression (modèle : 112C) pour le port du capteur et fixez le capteur à l’axe de la machine d’essai.
    4. Réglez la hauteur du capteur à environ 0,5 cm au-dessus du timbre PDMS à l’aide d’un contrôle « jog » sur le panneau avant de l’instrument.
    5. Ouvrez le logiciel associé à l’aide de la fenêtre «Test Setup», sélectionnez «Profil Servo» et ouvrez la fenêtre «Segment». Dans la fenêtre «Segment», l’entrée souhaitée «Taux de contrôle» et « Montantfinal» pour le test.
      REMARQUE : La vitesse de contrôle détermine la vitesse à laquelle le capteur se déplace vers le PDMS. Le montant final détermine la distance totale parcourue par le capteur.
    6. Utilisez le bouton "Z" situé sur le panneau de configuration du logiciel pour réinitialiser toutes les mesures à ce stade.
    7. Déplacez le capteur vers le bas pour contacter légèrement PDMS jusqu’à ce que 1-2 newtons (N) sont chargés. Le chargement et la distance parcourue par le capteur seront affichés dans le logiciel.
    8. Après avoir utilisé le bouton "Z« , exécutez la mesure à l’aide de "Play« , et enregistrez la force d’enregistrement du fichier et la distance.
    9. Répétez les étapes 1.3.3 à 1.3.8 pour chaque condition expérimentale de PDMS.
    10. Ouvrez le fichier et utilisez la formule suivante pour calculer le module (E) du Young de PDMS pour chaque ratio. (F = force de compression, A = zone du timbre PDMS,L = distance de déplacement du capteur, et L0 = épaisseur originale du timbre PDMS).
      figure-protocol-1

2. Quantification des propriétés cellulaires sur les substrats tunables

  1. Test de prolifération
    1. Scs de semence sur des substrats préparés à partir de l’étape 1.1.9 à une densité de 5.000 cellules/cm2 dans une plaque de 6 puits. Permettre aux SC d’incuber pendant 48 h dans des conditions de culture cellulaire standard (37 °C et 5 % de CO2).
    2. Diluer 12 μL de 10 mM de la solution de stock de bromodeoxyuridine (BrdU) en 12 mL de 37 °C de culture cellulaire moyenne, bien mélanger avec la pipette pour faire 10 μM BrdU solution d’étiquetage.
    3. Retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les SC 2x avec PBS.
    4. Ajouter 2 mL de solution d’étiquetage BrdU dans chaque puits et incuber les SC pendant 2 h.
      REMARQUE : Le temps d’incubation de la solution d’étiquetage BrdU dépend du taux de prolifération cellulaire spécifique. La ligne RT4-D6P2T SC a un taux de prolifération élevé, de sorte que 2 h de temps d’incubation a été utilisé.
    5. Retirez la solution d’étiquetage BrdU et lavez les SC 3x avec PBS. Ajouter 1 mL de 3,7% de formaldéhyde dans pbs à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min pour la fixation cellulaire.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est un cancérogène humain; par conséquent, effectuer tous les travaux à l’intérieur d’une hotte de fumée chimique avec une protection appropriée.
      REMARQUE : Lorsque vous lavez avec pbs, il n’y a pas de milieu de culture cellulaire dans le puits, et donc la surface du PDMS peut être hydrophobe. Prenez des précautions pour ne pas sécher complètement la surface du substrat pour éviter les dommages cellulaires.
    6. Aspirate solution de formaldéhyde et laver 3x avec PBS (3 min chacun). Retirez pbs et ajoutez 1 mL de 0,2% Triton X-100 dans PBS à chaque puits pour permeabiliser la membrane cellulaire. Incuber les SC avec la solution Triton X-100 pendant 20 min à température ambiante.
    7. Retirez la solution Triton X-100 et lavez les SC 3x avec pbs (3 min chacun).
    8. Ajouter 1 mL de 1 N HCl dans chaque puits et incuber sur la glace pendant 10 min. Retirer 1 N HCl et ajouter 1 mL de 2 N HCl dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 min. Le traitement HCl est pour l’hydrolyse de l’ADN.
    9. Mélanger 182 mL de 0,2 mM Na2HPO4 et 18 mL d’acide citrique de 0,1 mM pour produire un tampon phosphate/acide citrique pour la récupération d’antigènes. Retirer 2 N HCl et ajouter 1 mL de phosphate/tampon d’acide citrique dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    10. Laver les SC 3x avec 0,2% Triton X-100 en PBS. Ajouter 2 mL d’albumine de sérum bovin (BSA) à 3% dans pbs dans chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante pour horloger la liaison non spécifique de l’anticorps.
    11. Diluer l’anticorps primaire BrdU conjugué à Alexa Fluor 488 dans la solution BSA à 3% à un ratio de 1:300 pour la solution de coloration BrdU. Incuber les SC avec une solution de coloration pendant la nuit à température ambiante tandis que la plaque est recouverte de papier d’aluminium.
    12. Pour quantifier la prolifération, les SC d’image utilisant le canal FITC et DAPI d’un microscope fluorescent pour détecter BrdU et noyaux, respectivement. Enregistrez des images sous forme de fichiers « nd.2 ».
    13. Ouvrez les fichiers « nd.2 » pour chaque image prise à des positions spatiales identiques.
    14. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images. Cliquez avec le bouton droit sur l’arrière-plan pour ouvrir la fenêtre «Résultats de mesure automatisés» et «Mesure automatisée» dans la section «Contrôle d’analyse».
    15. Dans le menu «Count & Taxonomie», sélectionnez «Count». Sur l’image FITC, cliquez sur chaque noyau montrant la fluorescence verte (BrdU positive) et cliquez avec le bouton droit sur l’image.
      REMARQUE : Le nombre de cellules positives brdu est indiqué dans la fenêtre de «Automations and Measurements».
    16. Pour les images DAPI, répétez l’étape 2.1.14 pour compter le nombre de noyaux totaux. Calculez le pourcentage de cellules positives BrdU pour cette image.
    17. Répétez l’étape 2.1.13 à 2.1.16 pour d’autres images à des fins statistiques et calculez le pourcentage moyen de cellules positives brdU pour chaque condition de substrat.
  2. Quantification de l’expression c-Jun par l’analyse d’image immunofluorescente
    1. Les cellules préparées à l’intérieur des plaques de 6 puits des étapes 1.1.9 et 1.2.23 sont fixes et perméabilisées avec les procédures décrites précédemment (étape 2.1.5-2.1.7).
      REMARQUE : Pour effectuer des comparaisons précises de l’intensité fluorescente entre les cellules de différentes conditions ecm, appliquez les paramètres de la caméra de façon identique sur tous les échantillons, tous les échantillons ayant les mêmes paramètres.
    2. Enregistrez des images sous forme de fichiers « .nd2 ».
    3. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images. Cliquez avec le bouton droit sur l’arrière-plan pour ouvrir la fenêtre «Résultats de mesure automatisés» et «Mesure automatisée» dans la section «Contrôle d’analyse».
    4. Dans "Automated Measurement Results« , sélectionnez "Object Data« . Activer le bouton «Continuer à mettre à jour la mesure».
    5. Dans le panneau supérieur du logiciel, sélectionnez «Mesure» suivi de «Caractéristiques de l’objet». Ajouter «Intensité moyenne» à la section de « Sélectionné pourla mesure».
    6. Ouvrez et fusionnez deux fichiers image « .nd2 » qui contiennent des images de c-Jun et de noyaux.
    7. Dans le panneau supérieur, sélectionnez «ROI» etsélectionnez« Draw Rectangulaire ROI ». Dessiner une zone rectangulaire contenant la zone nucléaire d’une seule cellule.
      REMARQUE : l’expression c-Jun est concentrée dans les noyaux35.
    8. Dans le panneau supérieur du logiciel, sélectionnez «Binaire» et «Define Threshold», une nouvelle fenêtre apparaîtra pour définir précisément la zone fluorescente c-Jun.
    9. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur «Image complète/Utilisation du roi» pour passer du modèle d’image complète au modèle roi. Utilisez «Intensité» pour ajuster la table de recherche située sur le côté gauche de la fenêtre pour l’ajustement de la taille/forme de la zone en surbrillance dans le roi rectangulaire.
      REMARQUE : Veillez à ce que la taille/la forme de la zone en surbrillance soit identique au noyau.
    10. Cliquez sur le bouton «OK», pour obtenir l’intensité moyenne du FITC dans la fenêtre des «Résultats de mesure automatisés», puis cliquez sur «Stocker les données».
    11. Dans la fenêtre de "Mesure automatisée« , "Supprimer l’objet" pour supprimer la zone en surbrillance rouge. Sur le panneau latéral gauche, utilisez «Pointing Tool» pour sélectionner le roi rectangulaire et supprimer.
    12. Répétez l’étape 2.2.6 à 2.2.11 pour mesurer l’intensité moyenne du FITC pour chaque cellule supplémentaire.
    13. Dans la zone de fenêtre des «résultats de mesure automatisés», sélectionnez «Stocké» et toutes les données stockées seront présentées. Utilisez la fonction «Exporter» et sélectionnez «Données vers Excel» pour enregistrer la feuille de calcul exportée et effectuer des calculs supplémentaires.
  3. Quantification de l’élongation nucléaire
    1. Fixer et permeabiliser les SC préparés à partir de l’étape 1.2.22 suivant les étapes 2.1.5-2.1.7. Effectuer la coloration nucléaire à l’aide d’un support de montage avec DAPI.
    2. À l’aide du canal DAPI et d’un objectif 40x, acquérir des images de l’échantillon et enregistrer comme fichiers « .
    3. Suivez les étapes 2.2.3 et 2.2.4 pour ouvrir la fenêtre «Résultats de mesure automatisée» et « Mesureautomatisée» dans le logiciel d’analyse d’image.
    4. Dans "Automated Measurement Results« , utilisez la fonction "Option" suivie de "Select Object Feature« . Dans la colonne «Feature», sélectionnez «Elongion» et ajoutez à la colonne «Selected for Measurements». Utilisez «Keep Updateing Measurement» pour activer cette fonction.
    5. Ouvrez le fichier image « nd.2 » qui contient les images nucléaires. Danslafenêtre « Mesure automatisée », sélectionnez la fonction «Détection automatique» et sélectionnez un noyau. Le clic droit sur l’image et le rapport d’aspect nucléaire mesuré sera affiché dans «Automated Measurement Results».
    6. Répétez l’étape 2.3.5 pour quantifier les rapports d’aspect nucléaire pour d’autres noyaux de l’image. Sélectionnez "Stocker les données" dans la fenêtre des " Résultats de mesureautomatisés« .
    7. Répétez la répétition de 2.3.5 à 2.3.6 pour des images supplémentaires. Exportez les données vers un fichier de feuille de calcul comme précédemment fait dans le 2.2.13 pour analyse.
  4. Tache occidentale pour quantifier l’expression de protéine
    1. Suivez les protocoles standard s’il s’adresse à l’analyse western des taches détaillées ailleurs32. Les dilutions des anticorps utilisés dans l’étude sont indiquées ci-dessous : Lapin anti c-Jun 1:2,000; Souris anti β-actine 1:1,000; Lapin anti p75NTR 1:1,000; Protéine de base anti myéline de lapin 1:1,000; Anti-souris/lapin IgG, anticorps liés au HRP 1:10,000.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour analyser et quantifier l’interaction entre la rigidité du substrat et la composition des protéines sur le phénotype SC, un substrat tunable de culture cellulaire PDMS a été développé (Figure 1A). Essai de compression du polymère à une base différente : les ratios d’agents de traitement ont été utilisés pour quantifier le module (E) du substrat (figure 1B)du Young . La gamme de valeurs du module qui en résulte représente des conditions physiologiquement pert...

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Discussion

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Les SC peuvent favoriser la régénération nerveuse en raison de leur transformation phénotypique et de leur potentiel régénérateur à la suite d’une lésion nerveuse. Cependant, la façon dont les indices ECM régulent cette capacité régénératrice reste pour la plupart floue, ce qui pourrait entraver non seulement le développement de biomatériaux qui visent à promouvoir la régénération des nerfs, mais aussi la compréhension des mécanismes impliqués dans la régénération nerveuse. Pour commencer à examiner cette interaction, de...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont signalé aucun conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

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Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de l’Université de Cincinnati. Les auteurs remercient également Ron Flenniken du laboratoire de caractérisation des matériaux avancés de l’Université de Cincinnati pour son soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine de sérum bovin (BSA), conjugué Texas RedThermo Fisher ScientificA23017Coloration BSA pour montrer des micromotifs
technologie de signalisation cellulaire d’anticorpsliée à HRP7076SAnticorps utilisé pour l’analyse par transfert western
IgG anti-lapin, technologie de signalisation cellulaire d’anticorps liée à HRP7074Sutilisé pour l’analyse
par transfert westernBrdUThermo Fisher ScientificB23151Réactif utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire
Anticorps primaire BrdU conjugué à Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Utilisé pour visualiser BrdU dans les tests de prolifération cellulaire
Collagène IThermo Fisher ScientificA10483-01Protéine utilisée pour revêtir les lamelles
de recouvrement Machine d’essai de force de compressionTestResourcesInstrument de quantification des propriétés mécaniques des polymères
Milieu Eagle modifié de DulbeccoThermo Fisher Scientific11965092Milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtalThermo Fisher Scientific16000044Milieu de culture cellulaire supplémentaire
FibronectineThermo Fisher Scientific33010-018Protéine utilisée pour enrober les lamelles
Fluorescence microscopeNikonEclipse Ti2Microscope à fluorescence
Halt Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100X)Thermo Fisher Scientific78440Inhibiteur de protéase et de phosphatase
LaminineThermo Fisher Scientific23017015Protéine utilisée pour revêtir les lamelles
Milieu de montage avec DAPIThermo Fisher ScientificP36971Enrobage et coloration des noyaux
Anticorps primaire c-Jun de sourisThermo Fisher Scientific711202Anticorps primaire pour visualiser la protéine c-Jun
Anticorps primaire souris &bêta ;-actineTechnologie de signalisation cellulaire3700SContrôle de charge pour les expériences de transfert western
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Milieu de
culture cellulaire supplémentairePhotoresist SU 2010KAYAKUSU8-2010Photoresist
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443Block liaison non spécifique aux protéines
Anticorps primaire Rabbit c-JunCell Signaling Technology9165SAnticorps primaire pour la visualisation de la protéine c-Jun
Anticorps primaire de la protéine basique de myéline de lapinAbcamab40390Anticorps primaire pour la visualisation de MBP
Rabbit p75NTR Anticorps primairede signalisation cellulaire8238SAnticorps primaire pour la visualisation de la p75NTR
Rhodamine phalloidinThermo Fisher ScientificR415Visualisation du cytosquelette cellulaire
Tampon RIPAAbcamab156034Tampon de lyse cellulaire
RT4-D6P2T Lignée cellulaire SchwannATCCCRL-2768Lignée cellulaire utilisée dans expériences
SYLGARD 184 Base PDMS et agent de durcissementSigma Aldrich761036Polymère accordable utilisé pour revêtir les lamelles
TrypsineThermo Fisher Scientific15090-046Réactif de dissociation cellulaire
Nettoyeur UV-OzoneNovascanAugmenter l’hydrophicilité du PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Dissociation cellulaire Réactif
IgG de souris, Technologie

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

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