Préparation des microenvironnements de matrice extracellulaire tunable pour évaluer les spécifications du phénotype de cellules de Schwann

Résumé

Cette méthodologie vise à illustrer les mécanismes par lesquels les signaux de matrice extracellulaire tels que la rigidité du substrat, la composition des protéines et la morphologie cellulaire régulent le phénotype des cellules Schwann (SC).

Résumé

Les blessures du système nerveux périphérique traumatique (PNS) manquent actuellement de traitements appropriés pour retrouver le rétablissement fonctionnel complet. Les cellules schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, jouent un rôle vital dans la promotion de la régénération du PNS en dédifférantiant en un phénotype de cellules régénératrices à la suite d’une blessure. Cependant, l’état dédifférencié des SC est difficile à maintenir pendant la période de temps nécessaire à la régénération et est affecté par les changements dans la matrice extracellulaire environnante (ECM). Par conséquent, il est essentiel de déterminer l’interaction complexe entre les CSC et les DIFFÉRENTS CPE pour fournir des indices de potentiel régénérateur des SC. Pour remédier à cette situation, une stratégie a été créée où différentes protéines ECM ont été adsorées sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) tunable qui a fourni une plate-forme où la rigidité et la composition des protéines peuvent être modulées. Les SC ont été ensemencés sur les substrats tunables et des fonctions cellulaires critiques représentant la dynamique du phénotype sc ont été mesurées. Pour illustrer l’interaction entre l’expression des protéines SC et la morphologie cellulaire, les différentes densités d’ensemencement des SC en plus des modèles cellulaires imprimés individuels de microcontact ont été utilisées et caractérisées par la coloration d’immunofluorescence et la tache occidentale. Les résultats ont montré que les cellules avec une plus petite zone de propagation et une plus grande étendue de l’élongation cellulaire ont favorisé des niveaux plus élevés de marqueurs phénotypiques régénératifs de SC. Cette méthodologie commence non seulement à démêler la relation significative entre l’ECM et la fonction cellulaire des SC, mais fournit également des lignes directrices pour l’optimisation future des biomatériaux dans la réparation des nerfs périphériques.

Introduction

Les blessures du système nerveux périphérique (PNS) demeurent un défi clinique majeur dans les soins de santé en compromettant la qualité de vie des patients et en créant un impact significatif à travers une multitude de facteurs socio-économiques^1,2. Les cellules de Schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, fournissent les indices moléculaires et physiques nécessaires pour induire la régénération de PNS et aident aux rétablissements fonctionnels dans les blessures à court écart. Cela est dû à la capacité remarquable des SC de dédifférentier dans un phénotype cellulaire de « éparatio » à p....

Protocole

1. Préparation et caractérisation du substrat de culture cellulaire tunable

1. Préparation du substrat
   1. Mélanger vigoureusement l’élastomère de base PDMS et les agents de durcissement à l’aide d’une pointe de pipette à un rapport compris entre 10:1 et 60:1 jusqu’à ce que les bulles soient dispersées de façon homogène dans le mélange. Enlever les bulles à l’aide de la dessiccation sous vide jusqu’à ce que les bulles soient dissipées.
      REMARQUE : Pendant la polymérisation de PDMS, l’agent de durcissement croise avec l’élastomère de base pour fournir les propriétés mécaniques désirées par le polymère final. Les rapports crosslink peuven....

Résultats

Pour analyser et quantifier l’interaction entre la rigidité du substrat et la composition des protéines sur le phénotype SC, un substrat tunable de culture cellulaire PDMS a été développé (Figure 1A). Essai de compression du polymère à une base différente : les ratios d’agents de traitement ont été utilisés pour quantifier le module (E) du substrat (figure 1B)du Young . La gamme de valeurs du module qui en résulte représente des conditions physiologiquement pert.......

Discussion

Les SC peuvent favoriser la régénération nerveuse en raison de leur transformation phénotypique et de leur potentiel régénérateur à la suite d’une lésion nerveuse. Cependant, la façon dont les indices ECM régulent cette capacité régénératrice reste pour la plupart floue, ce qui pourrait entraver non seulement le développement de biomatériaux qui visent à promouvoir la régénération des nerfs, mais aussi la compréhension des mécanismes impliqués dans la régénération nerveuse. Pour commencer à examiner cette interaction, de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine de sérum bovin (BSA), conjugué Texas Red	Thermo Fisher Scientific	A23017	Coloration BSA pour montrer des micromotifs
technologie de signalisation cellulaire d’anticorps	liée à HRP	7076S	Anticorps utilisé pour l’analyse par transfert western
IgG anti-lapin, technologie de signalisation cellulaire d’anticorps liée à HRP	7074S	utilisé pour l’analyse
par transfert westernBrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Réactif utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire
Anticorps primaire BrdU conjugué à Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Utilisé pour visualiser BrdU dans les tests de prolifération cellulaire
Collagène I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protéine utilisée pour revêtir les lamelles
de recouvrement Machine d’essai de force de compression	TestResources		Instrument de quantification des propriétés mécaniques des polymères
Milieu Eagle modifié de Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	11965092	Milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal	Thermo Fisher Scientific	16000044	Milieu de culture cellulaire supplémentaire
Fibronectine	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protéine utilisée pour enrober les lamelles
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Microscope à fluorescence
Halt Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Inhibiteur de protéase et de phosphatase
Laminine	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protéine utilisée pour revêtir les lamelles
Milieu de montage avec DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Enrobage et coloration des noyaux
Anticorps primaire c-Jun de souris	Thermo Fisher Scientific	711202	Anticorps primaire pour visualiser la protéine c-Jun
Anticorps primaire souris &bêta ;-actine	Technologie de signalisation cellulaire	3700S	Contrôle de charge pour les expériences de transfert western
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	Milieu de
culture cellulaire supplémentairePhotoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block liaison non spécifique aux protéines
Anticorps primaire Rabbit c-Jun	Cell Signaling Technology	9165S	Anticorps primaire pour la visualisation de la protéine c-Jun
Anticorps primaire de la protéine basique de myéline de lapin	Abcam	ab40390	Anticorps primaire pour la visualisation de MBP
Rabbit p75NTR Anticorps primaire	de signalisation cellulaire	8238S	Anticorps primaire pour la visualisation de la p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualisation du cytosquelette cellulaire
Tampon RIPA	Abcam	ab156034	Tampon de lyse cellulaire
RT4-D6P2T Lignée cellulaire Schwann	ATCC	CRL-2768	Lignée cellulaire utilisée dans expériences
SYLGARD 184 Base PDMS et agent de durcissement	Sigma Aldrich	761036	Polymère accordable utilisé pour revêtir les lamelles
Trypsine	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Réactif de dissociation cellulaire
Nettoyeur UV-Ozone	Novascan		Augmenter l’hydrophicilité du PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Dissociation cellulaire Réactif

IgG de souris, Technologie