Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Résumé

Le vieillissement est la détérioration dépendante du temps des processus biologiques normaux d’un organisme qui augmente la probabilité de décès. De nombreux facteurs génétiques contribuent à des altérations du processus normal de vieillissement. Ces facteurs se croisent de façon complexe, comme en témoigne la richesse des liens documentés identifiés et conservés chez de nombreux organismes. La plupart de ces études se concentrent sur la perte de fonction, mutants null qui permettent un dépistage rapide de nombreux gènes simultanément. Il ya beaucoup moins de travail qui se concentre sur la caractérisation du rôle que la surexpression d’un gène dans ce processus. Dans le présent travail, nous présentons une méthodologie simple pour identifier et cloner des gènes dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, pour l’étude dans la suppression du phénotype chronologique de durée de vie de courte durée vu dans beaucoup de milieux génétiques. Ce protocole est conçu pour être accessible aux chercheurs d’horizons variés et à divers stades universitaires. Le gène SIR2, qui code pour un daitone deacetylase, a été sélectionné pour le clonage dans le vecteur pRS315, car il ya eu des rapports contradictoires sur son effet sur la durée de vie chronologique. SIR2 joue également un rôle dans l’autophagie, qui résulte lorsqu’il est perturbé par la suppression de plusieurs gènes, y compris le facteur de transcription ATG1. Comme preuve de principe, nous cloneons le gène SIR2 pour effectuer un écran suppresseur sur le phénotype raccourci de durée de vie caractéristique du mutant atg1Δ déficient d’autophagie et le comparons à un fond génétique autrement isogène, de type sauvage.

Introduction

Le vieillissement est la perte d’intégrité dépendante du temps dans une myriade de processus biologiques qui augmente finalement la probabilité de mort organisationnelle. Le vieillissement est presque inévitable pour toutes les espèces. Au niveau cellulaire, il existe plusieurs caractéristiques bien caractérisées qui sont associées au vieillissement, y compris: instabilité génomique, altérations épigénétiques, perte de protéostase, dysfonctionnement mitochondrial, détection des nutriments dérégulé, sénescence cellulaire, et attrition télomère^1,2. Dans les organismes unicellulaires, tels que les levures, cela c....

Protocole

1. Identifier les interactions génétiques potentielles pour le dépistage

1. Identifier le ou les antécédents génétiques pour la caractérisation, qui se traduit par une durée de vie chronologique anormalement court (CLS) dans Saccharomyces cerevisiae à l’aide de la base de données sur le génome de Saccharomyces (sgd, https://www.yeastgenome.org^29,30), qui compile des informations phénotypiques connues pour cet organisme.
   1. Sélectionnez l’onglet Fonction dans les options en haut de la page Web.
   2. Sélectionnez Phénotype suivi de la sélectio....

Résultats

Comme il existe des rapports contradictoires sur le rôle de SIR2 pendant le vieillissement, nous avons choisi ce gène pour l’étude comme un suppresseur potentiel de l’atg1Δ mutant raccourci cls phénotype²⁶. Le rôle de SIR2 est quelque peu controversé, avec des rapports contradictoires sur son rôle dans l’extension de CLS, mais il a été clairement lié à l’augmentation cls dans au moins un fond de levure, avec un rôle à la fois dans l’autophagie et la mitophagie

Discussion

Démêler la génétique du vieillissement est un défi difficile, avec de nombreuses possibilités d’étude plus approfondie qui peuvent potentiellement donner des informations significatives sur les interactions complexes qui existent. Il existe de nombreuses méthodes qui permettent la génération rapide de mutants de perte de fonction pour l’étude des souches nulles de levure^45,46. Cette méthode présente une approche simple pour identifier et cloner les gènes sur le v.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit ADN fongique/bactérien	Zymo Research	D6005
HindIIIHF	enzyme New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Saumon spermatozoïde ADN	Thermofisher	AM9680
T4 ADN ligase	New England Biolabs	M0202S