Article de méthode

Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

DOI :

10.3791/61506

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17 septembre 2020

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1Department of Biology, William Paterson University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vieillissement est la détérioration dépendante du temps des processus biologiques normaux d’un organisme qui augmente la probabilité de décès. De nombreux facteurs génétiques contribuent à des altérations du processus normal de vieillissement. Ces facteurs se croisent de façon complexe, comme en témoigne la richesse des liens documentés identifiés et conservés chez de nombreux organismes. La plupart de ces études se concentrent sur la perte de fonction, mutants null qui permettent un dépistage rapide de nombreux gènes simultanément. Il ya beaucoup moins de travail qui se concentre sur la caractérisation du rôle que la surexpression d’un gène dans ce processus. Dans le présent travail, nous présentons une méthodologie simple pour identifier et cloner des gènes dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, pour l’étude dans la suppression du phénotype chronologique de durée de vie de courte durée vu dans beaucoup de milieux génétiques. Ce protocole est conçu pour être accessible aux chercheurs d’horizons variés et à divers stades universitaires. Le gène SIR2, qui code pour un daitone deacetylase, a été sélectionné pour le clonage dans le vecteur pRS315, car il ya eu des rapports contradictoires sur son effet sur la durée de vie chronologique. SIR2 joue également un rôle dans l’autophagie, qui résulte lorsqu’il est perturbé par la suppression de plusieurs gènes, y compris le facteur de transcription ATG1. Comme preuve de principe, nous cloneons le gène SIR2 pour effectuer un écran suppresseur sur le phénotype raccourci de durée de vie caractéristique du mutant atg1Δ déficient d’autophagie et le comparons à un fond génétique autrement isogène, de type sauvage.

Introduction

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Le vieillissement est la perte d’intégrité dépendante du temps dans une myriade de processus biologiques qui augmente finalement la probabilité de mort organisationnelle. Le vieillissement est presque inévitable pour toutes les espèces. Au niveau cellulaire, il existe plusieurs caractéristiques bien caractérisées qui sont associées au vieillissement, y compris: instabilité génomique, altérations épigénétiques, perte de protéostase, dysfonctionnement mitochondrial, détection des nutriments dérégulé, sénescence cellulaire, et attrition télomère1,2. Dans les organismes unicellulaires, tels que les levures, cela conduit à une réduction du potentiel réplictif et de la durée de vie chronologique3,4. Ces changements cellulaires se manifestent dans des organismes plus complexes, comme les humains, comme des pathologies qui comprennent les cancers, l’insuffisance cardiaque, la neurodégénérescence, le diabète et l’ostéoporose5,6,7. Malgré les nombreuses complexités qui caractérisent le processus de vieillissement, il existe la conservation de ces caractéristiques moléculaires sous-jacentes à ce processus à travers des organismes très divergents8,9,10. L’identification des altérations de ces voies pendant le vieillissement a conduit à la réalisation qu’ils peuvent être manipulés par des changements de mode de vie - restriction alimentaire est montré pour prolonger considérablement la durée de vie dans de nombreux organismes11. Ces voies convergent et se croisent les unes avec les autres et de nombreuses autres voies, de manière complexe. L’élucidation et la caractérisation de ces interactions offrent un potentiel d’interventions thérapeutiques pour prolonger la durée de vie et la durée de vie12,13,14.

La conservation des fondements moléculaires du vieillissement permet la dissection fonctionnelle des interactions génétiques sous-jacentes au processus par l’utilisation d’organismes modèles plus simples – y compris dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae15,16. Il existe deux types établis de vieillissement modélisés par la levure en herbe: le vieillissement chronologique (la durée de vie chronologique, CLS) et le vieillissement réplictif (la durée de vie réplicative, RLS)17. Le vieillissement chronologique mesure le temps qu’une cellule peut survivre dans un état non divisant. Ceci est analogue au vieillissement qui est vu dans les cellules qui passent la majorité de leur vie dans G0, tels que les neurones4. Alternativement, la durée de vie réplicative est le nombre de fois qu’une cellule peut diviser avant l’épuisement et est un modèle pour les types de cellules mitotically actives (par exemple, le nombre de cellules filles qu’une cellule peut avoir)18.

L’objectif global de cette méthode est de présenter un protocole qui permet la dissection fonctionnelle de la génétique du vieillissement en utilisant S. cerevisiae. Bien qu’il y ait eu beaucoup d’excellentes études réalisées par de nombreux chercheurs qui ont mené à notre compréhension actuelle, il reste de nombreuses occasions disponibles pour les chercheurs en herbe de contribuer au domaine du vieillissement dès le début de leur carrière universitaire. Nous présentons une méthodologie claire qui permettra aux chercheurs de faire progresser davantage le domaine du vieillissement. Ce protocole est conçu pour être accessible à tous les chercheurs, quel que soit le stade de leur carrière universitaire, en fournissant les outils nécessaires pour formuler et tester leurs propres hypothèses nouvelles. L’avantage de notre approche est qu’il s’agit d’une méthode rentable facilement accessible à tous les chercheurs, quel que soit leur établissement – et qu’elle ne nécessite pas d’équipement coûteux et spécialisé nécessaire à certains protocoles19. Il existe plusieurs façons différentes de concevoir ce type d’écran, l’approche décrite dans ce travail est particulièrement susceptible de dépistage mutants null de gènes non essentiels qui présentent une réduction sévère de la durée de vie chronologique par rapport à une souche isogène de type sauvage de levure.

Comme preuve de principe, nous cloner SIR2, une désacétylase de lysine rapportée comme présentant à la fois un CLS prolongé et raccourci lorsqu’il est surexprimé. Sir2 surexpression a été récemment trouvé pour augmenter CLS dans les levures de vinification; cependant, plusieurs groupes n’ont signalé aucun lien entre sir2 et l’extension CLS, laissant son rôle sous la rubrique20,21,22. En raison de ces rapports contradictoires dans la littérature, nous avons choisi ce gène pour ajouter des recherches indépendantes pour aider à clarifier le rôle de SIR2 dans le vieillissement chronologique, le cas échéant. En outre, l’augmentation du nombre de copies d’un homologue SIR2 prolonge la durée de vie dans un système de modèle de ver nématode23.

L’autophagie est un système de dégradation intracellulaire pour fournir des produits cytosoliques, tels que les protéines et les organites, au lysosome24. L’autophagie est intimement liée à la longévité par son rôle dans la dégradation des protéines endommagées et des organites pour maintenir l’homéostasie cellulaire25. L’induction de l’autophagie dépend de l’orchestration de l’expression de nombreux gènes, et la suppression du gène ATG1 entraîne un CLS anormalement court dans la levure en herbe26. Codes ATG1 pour une protéine sérine/thréonine kinase qui est nécessaire pour la formation de vésicule dans l’autophagie et le cytoplasme-à-vacuole (l’équivalent lysosomal fongique) voie27,28. Ici, nous présentons notre méthode pour un écran de numéro de copie accru, testant l’effet de l’augmentation de la copie SIR2 sur le CLS dans un type sauvage et un fond atg1-null. Cette méthode s’adresse particulièrement aux jeunes chercheurs et aux groupes de recherche des établissements principalement de premier cycle, dont bon nombre des collectivités sous-représentées dans les sciences et disposent de ressources limitées.

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Protocole

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1. Identifier les interactions génétiques potentielles pour le dépistage

  1. Identifier le ou les antécédents génétiques pour la caractérisation, qui se traduit par une durée de vie chronologique anormalement court (CLS) dans Saccharomyces cerevisiae à l’aide de la base de données sur le génome de Saccharomyces (sgd, https://www.yeastgenome.org29,30), qui compile des informations phénotypiques connues pour cet organisme.
    1. Sélectionnez l’onglet Fonction dans les options en haut de la page Web.
    2. Sélectionnez Phénotype suivi de la sélection Parcourir tous les phénotypes.
    3. Des options d’ontologie du phénotype de levure défilent jusqu’à la sous-position Développement et sélectionnez Durée de vie chronologique, trouvée sous la sous-position durée de vie.
    4. Sélectionnez le qualificatif pour la diminution, qui permet l’identification des gènes qui présentent un phénotype qui se traduit par une diminution de la durée de vie chronologique phénotype lorsqu’il est supprimé. Pour cette preuve de méthode atg1Δ a été sélectionné, ce qui se traduit par un phénotype CLS de courte durée et est perturbé pour l’autophagie26.
  2. Identifier les gènes cibles pour dépister les interactions génétiques qui peuvent supprimer le phénotype, basé sur les attributs ontologiques rapportés ou prédits, du mutant identifié dans la partie 1.2. Répétez la recherche phénotype telle qu’elle est trouvée aux étapes 1.1.1-1.1.4 ci-dessus, en interrogeant les gènes qui entraînent un CLS plus long lorsqu’il est surexprimé dans un fond de type sauvage. SIR2 a été sélectionné en fonction du phénotype CLS rapporté et des interactions rapportées avec l’autophagie31,32.

2. Préparer les réactifs

REMARQUE : Sauf indication automatique spécifiée de l’autre, chaque solution à 121 °C pendant 20 min doit stériliser avant l’utilisation.

  1. YPAD liquide : Ajouter 1 % d’extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de dextrose (glucose) et 40 mg d’adénine (comme déshydratation du sulfate d’adénine) par litre d’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  2. Support liquide LB : Ajouter la tryptone (10 g), l’extrait de levure (5 g) et le chlorure de sodium (10 g) par litre d’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  3. Préparer un stock d’ampicilline 1000x (100 mg/mL), dans de l’eau double distillée. Bien mélanger et filtrer la stérilisation.
  4. Synthétique complet – Leucine (SC-LEU) milieux liquides : Ajouter 1,7 g d’acides aminés de base d’azote de levure, 2 % glucose, 1,92 g de mélange sc-LEU Dropout, 5 g de sulfate d’ammonium par litre d’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  5. Tampon TE : Mélanger les Tris (concentration finale de 10 mM), l’EDTA (concentration finale de 1 mM) dans la solution avec de l’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  6. Préparer 50% PEG 3350 en solution avec de l’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  7. Préparer une solution d’acétate au lithium de 1 M et 100 mM avec de l’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
    NOTE: Pour faire des plaques d’agar solide ajouter 20 g d’agar (par litre avec de l’eau distillée double) aux médias préparés en 2.1 et 2.2 ci-dessus avant l’autoclaving. Si la préparation des plaques d’ampicilline ajouter 1mL de l’ampicilline au support en 2.2 ci-dessus après qu’il a refroidi à environ 60 °C. Verser dans des assiettes stériles et laisser reposer de 48 à 72 h avant l’utilisation. Conserver les plaques à 4 °C pour un stockage plus long.

3. Concevoir la stratégie de clonage pour cloner SIR2 dans le vecteur pRS315

  1. Concevoir des amorces PCR pour amplifier le gène SIR2 pour le clonage dans le vecteur pRS315.
    1. Concevoir manuellement des amorces pour avoir une complémentarité nucléotide de 21 à 22 pour les régions intergéniques en amont et en aval du SIR2. Assurez-vous que l’ensemble du gène, ainsi que les régions non traduites de l’ARNm est cloné en cartographiant ces fonctionnalités à partir des jeux de données disponibles33,34.
    2. Assurez-vous que la conception de l’amorce PCR donne des amorces avant et inverses dont la température de fusion (Tm) est supérieure à 53 °C et inférieure à 60 °C.
      REMARQUE : Idéalement, les deux amorces devraient avoir un Tm aussi proche l’un de l’autre que la séquence le permettra, avec une teneur approximative en GC comprise entre 40 et 50 %, en veillant à éviter les répétitions de dinucleotide et l’équilibrage de la distribution gc et at tout au long de la séquence.
    3. Après la conception des amorces PCR qui permettront la génération de l’amplicon pour le clonage, ajouter la digestion enzymatique de restriction (R.E.D.) sites cibles à l’extrémité 5' de chaque amorce qui sont compatibles avec le vecteur de clonage plasmide. Dans cette méthode, un site de digestion enzymatique de restriction HindIII (5'-AAGCTT-3') est ajouté à l’amorce en amont, à l’avant et à un site de digestion enzymatique de restriction SacII (5'-CCGCGG-3') est ajouté à l’amorce inverse en aval.
      REMARQUE : L’utilisation des sites SacII et HindIII exige que le site de coupe consensuelle pour chaque endonuclease ne soit pas présent dans le gène cible. Si l’une ou l’autre enzyme cible le gène cible, d’autres enzymes de restriction doivent être choisies. Il y en a beaucoup qui sont compatibles avec la région polylinker sur le vecteur pRS315.
    4. Enfin, ajoutez un surplomb de séquence de quatre nucléotides (5'-NNNN-3') à l’extrémité 5' de chaque amorce pour permettre à l’enzyme de restriction de lier et de digérer l’amiplicon. Une fois les amorces ont été conçues, faites synthétiser commercialement les oligonucléotides pour le clonage du gène SIR2.
    5. Resuspension des amorces PCR : Centrifuge les amorces PCR à l’aide d’un microfuge de table à vitesse maximale pendant 4 min. Ajouter la solution TE pour faire une concentration de stock de 100 μM. Stocker la concentration du stock à -20 °C et diluer 1/10 pour une utilisation dans les applications PCR.
      REMARQUE : Pour faire un stock de 100 μM, dissoudre les amorces dans un volume de tampon TE stérile qui est de 10 fois la quantité de nmoles dans le tube d’amorce, à l’aide de microlitres de TE. Par exemple, si le tube contient 15,6 nmoles d’amorce, ajoutez 156 μL de tampon TE.
  2. Isoler la levure de type sauvage gDNA pour l’amplification PCR de la construction de clonage SIR2.
    REMARQUE : Plusieurs options de haute qualité sont disponibles dans le commerce pour isoler la levure gDNA. L’utilisation d’un kit qui comprend la digestion de la paroi cellulaire fongique avec la zymolyase se traduit par une meilleure qualité gDNA (rendement plus élevé, moins d’impuretés). Le protocole ci-dessous renvoie constamment une forte concentration et pureté. Les détails d’un kit que nous recommandons peuvent être trouvés dans la Table des matériaux.
    1. Cultivez 5 mL de levure de type sauvage pendant 48-72 h à la phase post-log dans des supports enrichis, tels que YPAD. Pelleter les cellules de levure à >800 x g pendant 3 min à température ambiante, enlever le milieu de croissance, et resuspend dans 120 μL de tampon de digestion zymolyase complétée par 5 μL de zymolyase (2 unités enzyme/μL). Mélanger l’échantillon en vortexant et incuber à 37 °C pendant 40 min.
    2. Ajouter 120 μL d’un tampon de lyse chaotrope (p. ex., chlorure de guanidinium), 250 μL de chloroforme et vortex de l’échantillon pendant 60 s.
    3. Centrifugeuse à >8 000 x g pendant 2 min et transférer le supernatant dans une colonne de purification dans un tube de collecte stérile.
    4. Centrifugeuse à >8 000 x g pour 60 s et jeter le débit à travers. L’ADG g sera lié à la matrice de colonne.
    5. Laver la colonne deux fois avec 300 μL d’un tampon de lavage à base d’éthanol, en répétant l’étape de centrifugation d’en haut (3.2.4). Jetez le flux après chaque rotation. Transférer la colonne dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter 60 μL de tampon TE et incuber à température ambiante pendant 60 s. Flash tourner l’échantillon pendant 30 s pour elute l’ADN.
      REMARQUE : Déterminer la concentration de l’ADN dans l’échantillon (Absorption à 260nm) et la qualité (Absorption 260nm/280nm). Un rendement typique sera de 100 à 200 ng/μL d’ADG avec un rapport d’absorption à 260nm/280nm aussi proche que possible de 1,8.
  3. Amplifier et isoler le vecteur de plasmide pRS315 pour le clonage.
    REMARQUE : Plusieurs options de haute qualité sont disponibles dans le commerce pour la purification des vecteurs plasmides. Une chimie de colonne à base de silice est recommandée pour cette étape. Les changements mentionnés ci-dessous ont conduit à la plus grande concentration et la pureté. Les détails se trouvent dans le Tableau des matériaux.
    1. Cultiver un 5 mL de culture d’E. coli contenant le vecteur pRS315 pendant la nuit dans les milieux d’ampicilline LB+ (80 μg/mL). Pelleter la culture par centrifugation à >8.000 x g pendant 2 min à RT (15–25 °C).
    2. Re-suspendre les cellules bactériennes granulées dans 250 μL de tampon TE avec RNase A (100 μg/mL) et transférer à un tube de microcentrifuge. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’amas de cellules.
    3. Ajouter 250 μL de tampon de lyse et mélanger en inversant le tube 6 à 8 fois. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Ne laissez pas la lyse se dérouler pendant plus de 5 min – un peu moins est préférable.
    4. Ajouter 350 μL de tampon de neutralisation et mélanger immédiatement et soigneusement en inversant le tube 10 fois. Centrifugeuse pendant 10 min à >8 000 x g.
    5. Transférer soigneusement le supernatant d’en haut à une colonne de spin de silice par pipetage. Centrifugeuse pour 30 s et jeter le flux à travers.
    6. Ajouter 500 μL d’un tampon de lavage de sel élevé et une centrifugeuse comme à l’étape 3.3.5. Jetez le flux à travers. Laver la colonne de rotation de liaison d’ADN en ajoutant 750 μL d’un tampon de lavage à base d’éthanol, pour enlever les sels résiduels, et la centrifugeuse comme à l’étape 3.3.5.
    7. Jetez le débit à travers et la centrifugeuse pendant 2 minutes supplémentaires à >8,000 x g pour enlever la mémoire tampon de lavage résiduelle. Placez la colonne de rotation dans un tube de microcentrifuge propre et étiqueté de 1,5 m L. Pour éliter l’ADN, ajoutez 20 μL de tampon TE au centre de la colonne de rotation, incuber pendant 1 min à température ambiante et centrifuger pendant 1 min à >8 000 x g.
    8. Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la quantité (Absorption à 260nm) et la qualité (Absorption 260 nm/280 nm) de l’ADN. Un rendement typique sera de 1 à 2 μg/μL.
  4. Amplification pcr du gène candidat, SIR2, à partir d’ADN génomique de type sauvage
    1. Pour produire un amplicon qui convient au clonage, utilisez une polymérase PCR haute fidélité (HF) pour éviter que la génération involontaire de mutations dans la séquence ne soit amplifiée.
      REMARQUE : De nombreuses options PCR à haute fidélité sont disponibles dans le commerce. Pour faciliter l’optimisation des conditions de réaction PCR, utilisez une combinaison à deux tampons : une combinaison standard HF et une optimisée pour les images GC élevées et complexes. Les détails peuvent être trouvés dans la Table des Matériaux.
    2. PcR amplifier la construction SIR2 pour le clonage tel que décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : Pour maximiser le succès dans les étapes de clonage, plusieurs 50 μL identiques peuvent être configurés et concentrés par une étape de nettoyage de colonne PCR. Assurez-vous de configurer une réaction de contrôle de modèle gDNA (contrôle négatif).
    3. Mettre en place les conditions cyclables pcr décrites au tableau 2.
      REMARQUE : Les différentes paires d’amorces varient en fonction de leur température d’antealisation et différentes polymérases fonctionnent à des vitesses différentes. Assurez-vous d’optimiser les conditions d’amplification en fonction de l’enzyme sélectionnée et des spécifications de la combinaison d’amorces telles que conçues.
    4. Vérifiez le succès de la réaction pcr en visualisant la réaction pcr, qui produirait un fragment d’ADN d’environ 2,5 kb, sur un gel TAE-agarose de 1,0 % (avec 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium pour la visualisation).
  5. Digestion et ligature du gène candidat, SIR2, dans le vecteur de plasmide pRS315.
    1. Effectuer la digestion de restriction du vecteur et de l’insert : 625 ng d’ADN (soit le vecteur ou l’insertion), q.s. eau pour porter le volume de réaction finale à 50 μL, 5 μL de tampon, 1 μL SacII, et 1 μL HindIII. Incuber les digestions de restriction à 37 °C pendant 3 h, suivie de 80 °C pendant 20 min pour chauffer les enzymes. Les digests peuvent être stockés à 4 °C avant de passer à l’étape suivante.
    2. Mettre en place une réaction de ligature de 15 μL pour créer le plasmide souhaité : 6 μL d’eau stérile, 2 μL de vecteur digéré (50 ng d’ADN), 4 μL d’insertion digérée (100 ng d’ADN), 2 tampon de réaction T4 de μL et 1 μL de Ligase d’ADN T4. Incuber les réactions de ligature pendant la nuit à 16 °C, suivie de 80 °C pendant 20 min pour chauffer l’enzyme.
      REMARQUE : Mettre en place un contrôle sans insertion, en remplaçant 4 μL supplémentaires d’eau stérile (10 μL au total) au lieu de l’insert.
    3. Transformer les réactions de ligature en E. coli.
      REMARQUE : Il existe de nombreuses options pour les cellules compétentes qui sont disponibles. Ce protocole utilise des cellules chimiquement compétentes qui sont stockées à -80 °C avant l’utilisation.
      1. Décongeler un tube de 50 μL de cellules E. coli congelées et compétentes sur la glace jusqu’à ce qu’il soit juste décongelé et ajouter immédiatement 15 μL de la réaction de ligature. Feuilletez le tube plusieurs fois. Remettre immédiatement les tubes sur la glace et incuber pendant 30 min.
      2. Choquez les cellules pendant 20 s dans un bain d’eau à exactement 42 °C, et remettez immédiatement les tubes à la glace pour une incubation de 2 min. Ajouter 450 μL de milieu de récupération de température ambiante (p. ex., SOC ou LB) à chaque réaction de transformation et incuber pendant 60 min à 37 °C avec tremblement.
      3. Pour chaque réaction de transformation, faire une dilution 1:10 des cellules. En utilisant une technique stérile, plaque 150 μL des cellules non diluées et les dilutions de 1:10 sur les plaques d’ampicilline LB + (80 μg/mL)35. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
  6. Écran transformateurs potentiels pour le vecteur de surexpression.
    1. En utilisant une technique stérile, inoculer les transformateurs potentiels qui se sont développés en 5 mL LB + (80 μg/mL) d’ampicilline et se développer pendant la nuit. Suivant la procédure décrite à la section 3.3.1–3.3.7 ci-dessus, isoler les plasmides de chaque transformateur potentiel et l’écran pour l’intégration réussie de l’insert par la digestion de restriction suivie par l’électrophorèse de gel sur un gel taE-agarose de 1,0% (avec 0,5 μg/mL bromure d’éthidique pour la visualisation).

4. Transformer le vecteur en souches de levure de type atg1Δ et sauvage

REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide d’un protocole de transformation de l’acétate de lithium modifié36.

  1. Granulé 15 mL de type sauvage et atg1-cellules de levure null cultivés pendant la nuit dans les médias YPAD à la phase de début à mi-log (O.D. 600nm = 0.4-0.9) de croissance pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante.
  2. Décanter le supernatant, suspendre à nouveau le granulé cellulaire en 1 ml de ddHstérile 2O et transférer le contenu dans un tube de microfuge de 1,7 m L. Pelleter les cellules pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante.
  3. Retirez le supernatant et re-suspendez les cellules dans 250 μL d’acétate de lithium de 100 mM avec pipetage doux. Divisez les cellules en tubes microfuges séparés pour chacune des transformations que vous effectuerez. Utiliser 50 μL du mélange d’acétate cellulaire-lithium par transformation.
  4. Configurer un mélange de transformation. À chacune des transformations ajouter: 240 μL de 50% PEG3350, 36 μL de 1,0 M d’acétate de lithium, et 5 μL de sperme de saumon (ou autre porteur) d’ADN, bouilli pendant 5 min et sur la glace.
    NOTE: PEG est très visqueux. Pipette et mesurez soigneusement. Mélanger par pipetage après l’ajout de chaque composant avant de passer à autre chose.
  5. Ajouter 5 μL du plasmide approprié pour chaque transformation effectuée. Vortex chaque tube pour bien mélanger. Incuber les échantillons à 30 °C pendant 45 min. Échantillons de choc thermique à 42 °C pendant 10 min.
  6. Les cellules de granulés pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante, retirez soigneusement le mélange de transformation et re-suspendent les échantillons dans 300 μL de cellules stériles ddH2O. Pellet en répétant le spin ci-dessus, retirez soigneusement l’eau et re-suspendez vos échantillons dans 200 μL de ddHstérile 2O.
  7. Mettre en place 1/10 et 1/100 dilutions pour chaque souche transformée de levure.
  8. Utilisation de la plaque technique stérile 150 μL de chaque échantillon sur des plaques de SC-leucine à sélectionner pour les plasmides. Étendre les cellules uniformément et uniformément et laisser sécher la plaque avant l’inversion et l’incubation à 30 °C pour croître pendant 48–72 h.
    REMARQUE : Une fois la souche appropriée générée, elle peut être stockée à long terme dans 25 % de glycérol à -80 °C. La quantification du numéro de copie présent peut être déterminée par plusieurs méthodologies, y compris qPCR, ARN-FISH, ou une autre mesure appropriée37,38.

5. Déterminer la durée de vie chronologique pour tester la suppression du phénotype CLS raccourcie

  1. Tester l’effet de la surexpression du suppresseur putatif sur le CLS dans la levure de courte durée, mutant atg1Δ, en déterminant le nombre d’unités de formation de colonies (CNU) qui restent en fonction du temps39.
    REMARQUE : Il est nécessaire de configurer cette partie de l’expérience avec les contrôles appropriés. Une expérience typique comparera une souche de levure de type sauvage (WT) avec le vecteur vide, WT avec le vecteur suppresseur, le mutant de suppression avec le vecteur vide, et le mutant de suppression avec le vecteur suppresseur.
    1. Prenez une seule colonie de la souche pour l’étudier et l’inoculer dans les médias SC-LEU. Faire pousser la culture à 30 °C pendant 72 h, en secouant.
    2. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminer la concentration des cellules qui sont présentes dans la culture40.
    3. Diluer un aliquot de la culture, de sorte que le résultat est un nombre uniforme de cellules dans un volume de 150 μL d’eau stérile. Plaquez la culture à l’aide d’une technique stérile sur des plaques SC-LEU et poussez à 30 °C pendant 72 h. Ces plaques sont le jour trois temps-point et l’expérience sera normalisée à ce point de temps comme 100% viabilité39.
      REMARQUE : Le nombre de cellules doit être de 200 à 500, suffisamment grand pour l’analyse et un nombre gérable pour le comptage. Dans cette étude, nous avons utilisé 200 cellules pour notre quantité de placage.
    4. Continuer à incuber les cultures de levure à 30 °C, en prenant des aliquots réguliers et le placage comme indiqué dans 5.1.3. Continuez ce processus jusqu’à ce que les souches ne soient plus viables, puis compilez et analysez les résultats.
      REMARQUE : La liste complète des souches utilisées dans cette étude se trouve dans le tableau 3.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme il existe des rapports contradictoires sur le rôle de SIR2 pendant le vieillissement, nous avons choisi ce gène pour l’étude comme un suppresseur potentiel de l’atg1Δ mutant raccourci cls phénotype26. Le rôle de SIR2 est quelque peu controversé, avec des rapports contradictoires sur son rôle dans l’extension de CLS, mais il a été clairement lié à l’augmentation cls dans au moins un fond de levure, avec un rôle à la fois dans l’autophagie et la mitophagie

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Démêler la génétique du vieillissement est un défi difficile, avec de nombreuses possibilités d’étude plus approfondie qui peuvent potentiellement donner des informations significatives sur les interactions complexes qui existent. Il existe de nombreuses méthodes qui permettent la génération rapide de mutants de perte de fonction pour l’étude des souches nulles de levure45,46. Cette méthode présente une approche simple pour identifier et cloner les gènes sur le v...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

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James T. Arnone tient à souligner le soutien des étudiants du cours Recombinant DNA Technologies en 2017 et 2018 à l’Université William Paterson qui ont participé à ce projet dès sa création, mais dont les efforts n’ont pas franchi le seuil de la paternité : Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Preciousgift Ibibor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza’e, Gabriella Rector, Aida Shono, et Matthew So. Vous êtes de grands scientifiques et vous me manquez tous!

Les auteurs tiennent à souligner le soutien inestimable apporté à la technologie de l’instruction et de la recherche à l’Université William Paterson pour leur aide : Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella et Henry Heinitsh. Les auteurs tiennent également à souligner le soutien du Bureau du prévôt pour la multithérapie, le Bureau du doyen et le Centre de recherche du Collège des sciences et de la santé leur appui à ces travaux, ainsi qu’au Département de biologie pour soutenir ce projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit ADN fongique/bactérienZymo ResearchD6005
HindIIIHFenzyme New England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Plasmid miniprep kitQiagen12123
SacII enzymeNew England BiolabsR0157S
Saumon spermatozoïde ADNThermofisherAM9680
T4 ADN ligaseNew England BiolabsM0202S

Références

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