Profilage à haut débit et en profondeur du protéome par marquage de masse en tandem 16-plex couplé à la chromatographie bidimensionnelle et à la spectrométrie de masse

Zhen Wang; Kanisha Kavdia; Kaushik  Kumar Dey; Vishwajeeth  Reddy Pagala; Kiran Kodali; Danting Liu; Dong  Geun Lee; Huan Sun; Surendhar  Reddy Chepyala; Ji-Hoon Cho; Mingming Niu; Anthony  A. High; Junmin Peng

doi:10.3791/61684

Article de méthode

Profilage à haut débit et en profondeur du protéome par marquage de masse en tandem 16-plex couplé à la chromatographie bidimensionnelle et à la spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/61684

⸱

18 août 2020

Zhen Wang^*¹ , Kanisha Kavdia^*² , Kaushik Kumar Dey¹ , Vishwajeeth Reddy Pagala² , Kiran Kodali² , Danting Liu¹ , Dong Geun Lee¹ , Huan Sun¹ , Surendhar Reddy Chepyala¹ , Ji-Hoon Cho² , Mingming Niu¹ , Anthony A. High² , Junmin Peng¹^,²

¹Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, ²Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole optimisé à haut débit développé avec des réactifs de marquage de masse en tandem 16-plex, permettant le profilage quantitatif du protéome des échantillons biologiques. Le fractionnement de base du pH étendu et la LC-MS/MS haute résolution atténuent la compression du rapport et fournissent une couverture profonde du protéome.

Résumé

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Le marquage isobare en tandem de masse (TMT) est largement utilisé en protéomique en raison de sa grande capacité de multiplexage et de sa couverture profonde du protéome. Récemment, une méthode TMT 16-plex élargie a été introduite, ce qui augmente encore le débit des études protéomiques. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole optimisé pour le profilage profond du protéome basé sur le TMT 16-plex, y compris la préparation d’échantillons de protéines, la digestion enzymatique, la réaction de marquage TMT, le fractionnement par chromatographie liquide en phase inverse (LC/LC) bidimensionnelle, la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) et le traitement des données informatiques. Les étapes cruciales du contrôle de la qualité et les améliorations du processus spécifiques à l’analyse TMT 16-plex sont mises en évidence. Ce processus multiplexé offre un outil puissant pour profiler une variété d’échantillons complexes tels que des cellules, des tissus et des échantillons cliniques. Plus de 10 000 protéines et modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la méthylation, l’acétylation et l’ubiquitination dans des échantillons biologiques très complexes provenant d’un maximum de 16 échantillons différents peuvent être quantifiées en une seule expérience, ce qui constitue un outil puissant pour la recherche fondamentale et clinique.

Introduction

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Les développements rapides de la technologie de spectrométrie de masse ont permis d’obtenir une sensibilité élevée et une couverture protéomique profonde dans les applications de protéomique ^1,2. Malgré ces développements, le multiplexage d’échantillons reste le goulot d’étranglement pour les chercheurs chargés de l’analyse d’une grande cohorte d’échantillons.

Les techniques de marquage isobare multiplexé sont largement utilisées pour la quantification relative à l’échelle du protéome de grands lots d’échantillons ....

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Protocole

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Les tissus humains pour l’étude ont été obtenus avec l’approbation du programme de don de cerveau et de corps de l’Institut de recherche sur la santé Banner Sun.

1. Extraction de protéines à partir de tissus et contrôle de la qualité

REMARQUE : Pour réduire l’impact de la collecte d’échantillons sur le protéome, il est crucial de collecter des échantillons en un minimum de temps à basse température si possible³¹. Ceci est particulièrement important lors de l’analyse des modifications post-traductionnelles car elles sont généralement labiles, par exemple, cer....

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Résultats

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Le protocole du TMT16 nouvellement développé, y compris la réaction de marquage, le dessalage et les conditions LC-MS, a été systématiquement optimisé⁴¹. De plus, nous avons comparé directement les méthodes 11-plex et 16-plex en les utilisant pour analyser les mêmes échantillons humains de MA⁴¹. Après optimisation des paramètres clés du TMT16, les méthodes TMT11 et TMT16 produisent une couverture, une identification et une quantification similaires du protéome > 100 000 .......

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Discussion

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Un protocole optimisé pour le profilage profond du protéome basé sur TMT16 a été mis en œuvre avec succès dans des publications antérieures 12,13,41. Avec ce protocole actuel, plus de 10 000 protéines uniques provenant d’un maximum de 16 échantillons différents peuvent être quantifiées de manière routinière en une seule expérience avec une grande précision.

Pour obten.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 et U54NS110435) et l’ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities). L’analyse de la SEP a été réalisée au Centre de protéomique et de métabolomique du St. Jude Children’s Research Hospital, qui est partiellement soutenu par la subvention de soutien du NIH Cancer Center (P30CA021765). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % Criterion TGX Precast Midi Protein Gel	Biorad	5671035
10X Tampon TGS (Tris/Glycine/SDS)	BioRad	161-0772
4&ndash ; 20 % Criterion TGX Precast Midi Protein Gel	Biorad	5671095
50 % Hydroxylamine	Thermo Scientific	90115
6 x SDS Sample Loading Buffer	Boston Bioproducts Inc	BP-111R
Ammonium Formate (NH4COOH)	Sigma	70221-25G-F
Hydroxyde d’ammonium, 28 %	Sigma	338818-100ml
Bullet Blender	Next Advance	BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater	Phoenix S& T	PST-BPH-20
C18 Ziptips	Harvard Apparatus	74-4607	Utilisé pour le dessalage du
dithiothréitol (DTT)	Sigma	D5545
DMSO	Sigma	41648
Acide formique	Sigma	94318
Collecteur de fractions	Gilson	FC203B
Gel Code Blue Stain Reactive	Thermo	24592
Perles de verre	Next Advance	GB05
HEPES	Sigma	H3375
HPLC Grade Acetonitrile	Burdick & Jackson	AH015-4
Eau de qualité HPLC	Burdick & Jackson	AH365-4
Iodoacétamide (IAA)	Sigma	I6125
Lys-C	Wako	125-05061
Spectromètre de masse	Thermo Scientific	Q Exactive HF
MassPrep BSA Digestion Eaux standard		186002329
Méthanol	Burdick & Jackson	AH230-4
Nanoflow UPLC	Thermo Scientific	Ultimate 3000
Pierce BCA Kit de dosage des protéines	Thermo Scientific	23225
ReproSil-Pur C18 résine, 1.9um	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.0003
Colonnes d’emballage	automatique Nouvel objectif	PF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mg	Waters	WAT054960	Utilisé pour le dessalage du
désoxycholate de sodium	Sigma	30970
Speedvac	Thermo Scientific	SPD11V
TMTpro 16plex Label Reagent Set	Thermo Scientific	A44520
Acide trifluoroacétique (TFA)	Applied Biosystems	400003
Trypsin	Promega	V511C
Colonne de spin ultra-micro, C18	Appareil Harvard	74-7206	Utilisé pour le dessalage de l’urée
	Sigma	U5378
Colonne Xbridge Colonne C18	Eaux	186003943	Utilisé pour le pH basique LC

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
Bekker-Jensen, D. B., et al.

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Mots-clés

Marquage TMT 16 plex pr paration d chantillons prot iques digestion enzymatique fractionnement LC LC spectrom trie de masse en tandem traitement computationnel des donn es

Profilage à haut débit et en profondeur du protéome par marquage de masse en tandem 16-plex couplé à la chromatographie bidimensionnelle et à la spectrométrie de masse

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