Visualisation de rencontres répliquantes avec une lésion bloquante marquée avec un antigène

Jing Zhang; Jing Huang; Ishani Majumdar; Ryan C. James; Julia Gichimu; Manikandan Paramasivam; Durga Pokharel; Himabindu Gali; Marina  A. Bellani; Michael  M Seidman

doi:10.3791/61689

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Article de méthode

Visualisation de rencontres répliquantes avec une lésion bloquante marquée avec un antigène

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DOI :

10.3791/61689

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27 juillet 2021

Jing Zhang^*¹ , Jing Huang^*² , Ishani Majumdar¹ , Ryan C. James³ , Julia Gichimu¹ , Manikandan Paramasivam⁴ , Durga Pokharel⁵ , Himabindu Gali⁶ , Marina A. Bellani¹ , Michael M Seidman¹

¹Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, ²Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, ³Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, ⁴Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, ⁵Horizon Discovery, ⁶Boston University School of Medicine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

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Résumé

Alors que les collisions de fourche de réplication avec des adduits à ADN peuvent induire des cassures double brin, on en sait moins sur l’interaction entre les réplisomes et les lésions bloquantes. Nous avons utilisé le test de ligature de proximité pour visualiser ces rencontres et caractériser les conséquences pour la composition réplisomique.

Résumé

Des informations considérables sont présentes sur la réponse cellulaire aux cassures double brin (DSB), induites par les nucléases, les radiations et autres briseurs d’ADN. Cela s’explique en partie par la disponibilité de méthodes d’identification des sites de rupture et de caractérisation des facteurs recrutés dans les ORD à ces séquences. Cependant, les DSB apparaissent également comme intermédiaires lors du traitement des adduits à l’ADN formés par des composés qui ne provoquent pas directement de cassures et ne réagissent pas à des sites de séquence spécifiques. Par conséquent, pour la plupart de ces agents, les technologies qui permettent d’analyser les interactions de liaison avec les facteurs de réponse et les protéines de réparation sont inconnues. Par exemple, les liaisons croisées interbrins d’ADN (ICL) peuvent provoquer des ruptures à la suite de rencontres de fourche de réplication. Bien que formés par des médicaments largement utilisés comme agents chimiothérapeutiques contre le cancer, il n’existe aucune méthodologie pour surveiller leurs interactions avec les protéines de réplication.

Ici, nous décrivons notre stratégie pour suivre la réponse cellulaire aux collisions de fourche avec ces adduits difficiles. Nous avons lié un antigène stéroïdien au psoralène, qui forme des LCI dépendantes de la photoactivation dans les noyaux des cellules vivantes. Les ICL ont été visualisés par immunofluorescence contre l’étiquette de l’antigène. Le marqueur peut également être un partenaire dans le test de ligature de proximité (PLA) qui rapporte l’association étroite de deux antigènes. Le PLA a été exploité pour distinguer les protéines qui étaient étroitement associées aux ICL marquées de celles qui ne l’étaient pas. Il a été possible de définir les protéines réplisomes qui ont été retenues après des rencontres avec les ICL et d’identifier d’autres qui ont été perdues. Cette approche est applicable à toute structure ou adduit à ADN qui peut être détecté immunologiquement.

Introduction

La réponse cellulaire aux cassures double brin est bien documentée grâce à une succession de méthodes de plus en plus puissantes pour diriger les cassures vers des sites génomiques spécifiques ^1,2,3. La certitude de l’emplacement permet une caractérisation sans ambiguïté des protéines et d’autres facteurs qui s’accumulent sur le site et participent à la réponse aux dommages de l’ADN (DDR), conduisant ainsi les voies de jonction terminale non homologue (NHEJ) et de recombinaison homologue (HR) qui réparent les cassures. Bien sûr, de nombreuses cassures sont introduites par des....