Profilage métabolique pour déterminer les effets bactéricides ou bactériostatiques des nouveaux produits naturels à l’aide de la microcalorimétrie isothermale

Résumé

L’élucidation du mode d’action d’un nouvel antibiotique est une tâche difficile dans le processus de découverte de médicaments. Le but de la méthode décrite ici est l’application de la microcalorimétrie isotherme en utilisant calScreener dans le profilage antibactérien pour fournir un aperçu supplémentaire des interactions médicament-microbe.

Résumé

En raison de la menace mondiale d’une résistance aux antimicrobiens croissante, de nouveaux antibiotiques sont nécessaires de toute urgence. Nous étudions les produits naturels de Myxobacteria comme une source innovante de ces nouveaux composés. Un goulot d’étranglement dans le processus est généralement l’élucidation de leur mode d’action. Nous avons récemment établi la microcalorimétrie isothermale dans le cadre d’un pipeline de profilage de routine. Cette technologie permet d’étudier l’effet de l’exposition aux antibiotiques sur la réponse métabolique bactérienne totale, y compris les processus qui sont découplés de la formation de biomasse. Fait important, les effets bactériostatiques et bactéricides se distinguent facilement sans aucune intervention de l’utilisateur pendant les mesures. Cependant, la microcalorimétrie isotherme est une approche assez nouvelle et l’application de cette méthode à différentes espèces bactériennes nécessite habituellement une pré-évaluation des conditions de mesure appropriées. Il existe quelques thermogrammes de référence disponibles de certaines bactéries, facilitant grandement l’interprétation des résultats. Comme le pool de données de référence ne cesse de croître, nous nous attendons à ce que la méthodologie ait un impact croissant à l’avenir et nous nous attendons à ce qu’elle permette des analyses approfondies des empreintes digitales permettant la différenciation des classes d’antibiotiques.

Introduction

Le but de cette méthode est d’appliquer la microcalorimétrie isothermale (IMC) comme un test de débit moyen dans le profilage du mode d’action (MoA) des nouveaux composés antibactériens. Cette méthode révèle des données concernant l’activité des composés sur les espèces bactériennes et fournit des informations sur la nature bactéricide ou bactériostatique du composé lui-même.

L’augmentation de la résistance aux antimicrobiens émergentes (AMR) est un problème mondial et elle conduit à des traitements moins efficaces des infections courantes avec des antibiotiques connus¹. Cependant, la recherche de nouveaux composés et médicaments qui peuvent remplacer ou travailler en combinaison avec des antibiotiques connus sont en cours et cela est construit sur diverses approches. Les produits naturels sont un acteur clé dans les campagnes actuelles de découverte de médicaments et en particulier dans la découverte de médicaments anti-infectieux². Toutefois, l’identification de nouvelles structures de plomb pour le développement d’antibiotiques est un processus long et exigeant financièrement³. Ainsi, les premières étapes de la découverte sont extrêmement importantes afin de filtrer sur les échafaudages les plus prometteurs déjà à un stade précoce. Les premières étapes de la découverte de médicaments naturels comprennent l’obtention de la structure d’un composé, la détermination de l’activité in vitro ainsi que le protocole d’entente et l’identification des cibles. La plupart des composés qui réussissent et qui sont admissibles à un développement ultérieur devraient présenter un spectre d’activité favorable (c.-à-d. une activité à large spectre dans le cas des antibactériens) et un nouveau protocole d’accord par lequel l’AMR préexistante peut être surmontée. Les échafaudages prometteurs sont alors généralement examinés dans les essais secondaires, qui incluent la biodisponibilité in vivo, la toxicité, et le métabolisme⁴. Outre les préoccupations financières, la découverte de médicaments naturels fait face à d’autres défis concernant les coûts et les difficultés techniques liées à l’isolement et à la purification des composés, ce qui, à son tour, peut rendre difficile l’obtention de quantités de plusieurs milligrammes ou même de grammes dans les premières étapes du processus de découverte^5,6. Par conséquent, il est de la plus haute importance dans la recherche sur les produits naturels d’être en mesure d’effectuer un dépistage primaire de pointe avec des quantités de composés minimes afin de prendre une décision éclairée sur d’autres investissements aient permis de rendre un nouveau produit naturel accessible au développement préclinique. Avec l’utilisation d’IMC pour le profilage antibactérien, la quantité de composé nécessaire est considérablement réduite par rapport aux méthodes standard. La technique fournit également des informations plus approfondies sur l’interaction de nouveaux médicaments avec la communauté microbienne⁷.

L’IMC est une méthode bien établie pour mesurer l’énergie totale à la suite de tous les processus et réactions biologiques, physiques et biochimiques dans un système biologique. La libération d’énergie bactérienne est proportionnelle aux réactions métaboliques totales⁸. Dans un système fermé, tel que le microcalorimètre utilisé, les niveaux de chaleur peuvent être mesurés dans la gamme de microwatts pour étudier la cinétique métabolique des bactéries^9,,10,11,12. La chaleur (énergie) qui est libérée par les bactéries est liée à des fonctions cellulaires qui sous-tendent leur métabolisme et qui ne sont pas nécessairement proportionnelles à la biomasse cellulaire.

Initialement, l’applicabilité de la calorimétrie isotherme pour les tests microbiologiques a été limitée en raison de son faible débit et des volumes élevés d’essai. Cependant, le microcalorimètre utilisé est unique car il combine les avantages de la calorimétrie isotherme avec un débit accru et des besoins composés inférieurs, ce qui en fait un outil précieux pour les applications de découverte de médicaments¹⁰. En outre, l’instrument offre d’autres avantages par rapport aux méthodes alternatives de mesure de la cinétique de croissance bactérienne, telles que la méthode standard de turbidité, qui est basée sur la mesure de la densité optique à 600 nm (OD<₆₀₀). La mesure de l’OD₆₀₀ repose sur l’hypothèse que l’augmentation de la densité optique est égale à la croissance microbienne, négligeant ainsi la présence de cellules non viables. Cette méthode a également été critiquée car elle exclut les petites variantes de colonies et les cellules persistantes¹¹. En revanche, IMC permet l’observation en temps réel de n’importe quel type de cellules viables. Si les cellules sont dormantes, elles présentent encore une activité métabolique et elles peuvent ainsi être détectées par IMC, alors que ces phénomènes ne sont pas détectables par la méthode standard de turbidité¹¹. D’autres avantages de l’IMC incluent un temps de test de susceptibilité antimicrobienne plus court, la mesure des interactions médicamenteuses dans une communauté complexe et des méthodes d’analyse standard sans détruire l’échantillon⁷.

La technologie IMC a été mise en œuvre dans un large éventail d’études, allant de la microbiologie à la thermogenèse et la biologie du cancer^{13,14,15,16,17}. Les applications microbiennes comprennent la détermination de concentrations inhibitrices minimales (MIC) de composés contre diverses souches bactériennes. Plusieurs études ont été faites et il a été conclu que les données mic de la calorimétrie isotherme pour la majorité des espèces bactériennes peuvent être obtenues plus rapidement et les résultats sont similaires à d’autres méthodes (standard) pour la détermination mic^12,18,19. D’autres applications de l’IMC comprennent l’observation de l’interaction des médicaments et la combinaison de traitements médicamenteux avec des communautés bactériennes complexes telles que les biofilms¹¹. Une étude portant sur le profilage du MoA a montré que le microcalorimètre peut détecter une différence dans les céphalosporines de première et deuxième génération, tandis que différents antibiotiques avec le même MoA présentent une courbe de flux de chaleur similaire par rapport à l’autre¹⁸.

Ici, nous décrivons l’utilisation de l’IMC pour le profilage moA de nouveaux produits naturels à l’aide du nouvel instrument isothermal de microcalorimétrie. La méthode est utilisée pour déterminer les concentrations efficaces d’antibiotiques et pour décrire les caractéristiques des antibiotiques en termes de mécanismes bactéricides ou bactériostatiques. La méthode peut être largement mise en œuvre dans le profilage moA des composés et elle pourrait remplacer ou au moins compléter les méthodes microbiologiques standard. Les études futures comprendront des analyses approfondies des empreintes digitales qui permettront de différencier les classes d’antibiotiques en fonction des mécanismes cibles.

Protocole

REMARQUE : La température de l’instrument doit être réglée en fonction de la bactérie utilisée au moins un jour à l’avance pour assurer la stabilité du système. Ici, les échantillons d’Acinetobacter baumannii DSM30008 sont exécutés à 30 °C.

1. Préparation de la culture

1. Streak sur la souche à l’étude (ici: A. baumannii) sur une plaque d’agar CASO et incuber pendant la nuit dans un incubateur statique à 30 °C.
2. Préparer une culture du jour au lendemain en inoculant une seule colonie dans le MHB (bouillon Mueller-Hinton) et incuber sur un incubateur de secousses à 180 tr/min à 30 °C.

2. Préparation de l’échantillon

1. Utilisez des tubes de 1,5 mL pour préparer la plage de concentration de médicaments ou de composés sélectionnés (p. ex., en ajoutant 1,5 μL de solutions de stock de 100 x dans DMSO; voir étape 2.3).
2. Diluer la culture du jour au lendemain dans le milieu MHB.
   1. Mesurer la densité optique de la culture du jour au lendemain à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.
   2. Diluer la culture pour obtenir 5 x 10⁵ unités de formation de colonies (CFU)/mL dans un milieu MHB frais. Un OD₆₀₀ d’un est égal à environ 5 x 10⁸ CFU/mL (par exemple, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      REMARQUE : Il est important de calibrer le facteur de conversion OD₆₀₀ en CFU/mL pour chaque souche bactérienne individuelle dans les conditions de culture appliquées.
3. Ajoutez 150 μL des cellules aux tubes à essai préparés à l’étape 2.1, en assurant une concentration finale correcte du médicament ou du composé testé et en corrigeant la concentration finale des cellules.
4. Mélanger le composé avec les cellules en vortexant.
   REMARQUE : La plaque d’échantillon(voir tableau des matériaux) comporte six rangées, chacune contenant huit puits, soit un total de 48 puits; Les lignes A et F sont la référence thermodynamique. Par conséquent, aucun échantillon ne peut être chargé dans ces puits, les supports correspondants sont chargés dans ces puits. 32 échantillons d’essai peuvent être mesurés par course, à l’aide de puits dans les rangées B-E. L’échantillon individuel doit être exécuté au minimum en double (ici : tous les échantillons ont été exécutés en triple). Les contrôles de croissance devraient être inclus.

3. Insérer la préparation

1. Transférer 120 μL du mélange préparé à l’étape 2.4 vers les inserts en plastique.
   REMARQUE : Utilisez le pipetage inversé à l’étape 3.1 pour empêcher le liquide de pulvériser sur les côtés des inserts en plastique, ce qui peut entraîner une interférence avec les lectures correctes du signal.
2. Placez toutes les flacons de titane dans les supports (voir Tableau des matériaux)à l’aide d’une pince à épiler.
3. Transférer délicatement les inserts dans les flacons de titane de la plaque de support.
4. Placez lâchement les couvercles en titane sur tous les flacons de titane.

4. Insérer le chargement

1. Transférer le support avec des gobelets en titane sur la station d’échantillonnage et placer sur la zone désignée.
2. Utilisez la clé de couple, réglée à 40 cNm force, pour serrer tous les couvercles.

5. Exécution d’échantillons

1. Dans le logiciel calView, démarrez une nouvelle expérience (Figure supplémentaire 1).
2. Retirez le bras d’insertion de l’échantillon de l’instrument.
3. Placez le porte-gobelets sur le « ou », la colonne 8 faisant face à l’ouverture d’insertion de l’échantillon et poussez doucement le porte-gobelets dans l’instrument à la position 1 désignée. Attendez 10 minutes pour que le système se stabilise. Étiqueter les puits expérimentaux.
4. Appuyez sur le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce que le porte-gobelet soit à la position 2 désignée. Attendez 20 minutes pour que le système se stabilise.
5. Poussez le bras d’insertion de l’échantillon dans « Position 3 » et retirez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit en « position de course ». Mettez en évidence tous les puits du logiciel et sélectionnez Début de réaction ( Figure supplémentaire4).
6. Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les lectures d’émission de chaleur soient de nouveau à zéro.
   REMARQUE : Assurez-vous que tous les puits se comportent de la même façon à l’intérieur de ces étapes. La figure supplémentaire 5 illustre ce qui doit être observé si les puits sont chargés correctement. Si vous êtes chargé incorrectement, répétez les étapes 5.2-5.4.

6. Retirez le porte-gobelets

1. Dans le logiciel, sélectionnez Stop (Figure supplémentaire 6). Le logiciel demandera alors si « vous êtes sûr », sélectionnez Oui (Figure supplémentaire 7) et enregistrez l’expérience sur un lecteur ou un bureau pourl’analyse desdonnées ( Figure supplémentaire 8 ).
2. Insérez complètement le bras d’insertion de l’échantillon dans l’instrument et engagez les aimants pour récupérer le porte-gobelets.
3. Desserrez les couvercles, retirez les inserts et placez les flacons et les couvercles dans des supports en verre et placez-les pendant 4 heures à 180 °C, puis placez les flacons et les couvercles dans un desiccateur pour s’assurer que les couvercles et les flacons sont secs.

7. Analyse des données

1. Ouvrez le logiciel (Figure supplémentaire 9), sélectionnez Ouvrir l’expérience dans le coin supérieur gauche (Figure supplémentaire 10). Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez l’expérience d’intérêt et appuyez sur Ouvrir (Figure supplémentaire 11). L’application ouvrira l’expérience en mode puits par défaut (Figure supplémentaire 12).
2. Appuyez sur Sélectionner tout ou Ctrl+A (Figure supplémentaire 13).
3. Appuyez sur Définir la base de référence, ce paramètre normalise les données dans chaque position ( Figure supplémentaire14). Dans la fenêtre contextuelle sélectionnez une période de temps de >30 min située dans la phase de décalage (le débit de chaleur doit être faible, entre zéro et dix μW; Figure supplémentaire 15). Après la sélection de la période de temps de base, la ligne de base choisie apparaîtra en vert dans le thermogramme. Fermez la fenêtre Définir la section de base.
4. Appuyez sur Enregistrer ou Ctrl+S et fermer le logiciel (Figure supplémentaire 16).
5. Application d’analyse symcel calorimétrie (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
6. Pour télécharger le fichier sur l’application d’analyse calorimétrie, appuyez sur Parcourir (Figure supplémentaire 17), sélectionnez l’expérience et appuyez sur Ouvrir ( Figuresupplémentaire 18). Les paramètres métaboliques seront calculés automatiquement pour les 32 échantillons de l’application web (Figure supplémentaire 19).
7. Afin d’adapter les données de flux de chaleur à Gompertz et /ou les modèles de croissance de Richard cliquez sur fonction de croissance. Les modèles de croissance adaptés seront affichés dans la section « Cumulatif », également par rapport aux données brutes de la section « Flow » (Figure supplémentaire 20).
8. Pour télécharger tous les paramètres calculés,appuyez sur Télécharger les mesures . Sélectionnez l’emplacement du fichier et appuyez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 21). Le fichier sera exporté vers une feuille de calcul pour d’autres calculs.

Résultats

Un nombre suffisant de bactéries produisant de la chaleur est nécessaire pour que l’instrument enregistre un signal thermique. S’il y a un délai dans le temps jusqu’à ce qu’un flux de chaleur soit détectable, cela signifie que les bactéries ne produisent pas encore un signal thermique au-dessus de la limite de détection. La détection de la chaleur libérée de l’échantillon bactérien est donc directement liée à l’augmentation de l’activité bactérienne, y compris la croissance bactérienne. La croissance bactérienne et d’autres activités métaboliques sont connues pour être fortement influencées par l’ajout d’un médicament antibactérien. Pour déterminer si un nouveau produit naturel à l’étude exerce des effets bactéricides ou bactériostatiques ou une combinaison des deux moas, nous avons choisi un petit ensemble de médicaments de référence et nous avons enregistré des thermogrammes auxquels nous avons comparé les données d’expériences avec le produit naturel. Sur la base de la puissance de certains antibiotiques, une gamme de concentrations a été sélectionnée étant proche de la concentration inhibitrice minimale (MIC) déterminée par la dilution microbroth.

La ciprofloxacine cible le gyrase bactérien d’ADN et la topoisomerase IV et, par conséquent, elle présente un MoA bactéricide. Cependant, l’abattage bactérien induit par la ciprofloxacine dépend de la concentration et lorsqu’il est dosé à des concentrations insuffisantes, il peut également avoir un effet bactériostatique²¹. La tétracycline et le chloramphénicol ciblent le ribosome à la sous-unité 30S et 50S, respectivement, et ils agissent bactériostatiques en raison de l’inhibition de la synthèse des protéines^22,23. Rifampicine agit en inhibant la polymérase d’ARN dépendante de l’ADN et il peut avoir à la fois, les effets bactéricides et bactériostatiques, selon la dose utilisée²⁴. Le produit naturel que nous étudions ici a été isolé de Myxobactéries et il a montré une activité puissante contre les pathogènes bactériens gram-négatifs et gram-positifs. Tout en étudiant son MoA et sa cible moléculaire, nous voulions déterminer si le nouveau produit naturel exerce des effets bactéricides et/ou bactériostatiques et si les profils thermiques des Acinetobacter baumannii traités sont semblables aux thermogrammes des bactéries qui ont été traitées avec les médicaments de référence mentionnés ci-dessus.

Les thermogrammes obtenus en exposant A. baumannii DSM-30008 à la ciprofloxacine dans la dilution en série sont affichés à la figure 1A. Les concentrations comprises entre 0,005 μM et 0,1 μM ont un effet minimal sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii. Toutefois, le traitement des cellules avec une ciprofloxacine de 0,5 μM entraîne un changement significatif dans la durée de la phase de décalage et une baisse du débit de chaleur maximal. Ces deux changements ont une incidence sur le temps de pointe (figure 1C), qui est augmenté d’environ 6 heures. Dans la figure 1B, la chaleur libérée cumulative est tracée à l’encontre du temps. Ici, nous voyons l’effet des concentrations, qui se reflète par une pente de pente. La quantification de l’inclinaison du thermogramme nous donne le taux métabolique maximal de A. baumannii en présence de ciprofloxacine comme indiqué dans la figure 1D, où nous pouvons observer une diminution concomitante du taux métabolique des cellules traitées avec 0,5 μM de ciprofloxacine. Les changements du taux métabolique des cellules traitées avec des concentrations plus faibles sont minimes. Cette expérience pourrait être encore améliorée par l’ajout de concentrations intermédiaires couvrant la gamme de 0,1 à 1 μM afin d’observer un changement graduel plus prononcé entre les concentrations qui n’ont aucun effet et une concentration entraînant un retard significatif de la phase de décalage et du taux métabolique. Cependant, les tendances du changement soutiennent un MoA bactéricide de ciprofloxacine.

Figure 1A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1B : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1C : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1D : Effet de la ciprofloxacine sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogrammes indiqués sous forme de flux de chaleur (μW) par rapport au temps (h) pour le type sauvage (WT) A. baumannii DSM-30008, non traités et exposés à la ciprofloxacine. (B) Chaleur cumulative (mJ) vs temps (h). (C) Temps de pic (h) avec barres d’erreur (écart type). (D) Taux métabolique (μW) avec barres d’erreur (écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans le cas de la tétracycline, nous n’avons observé pas de changements significatifs dans les thermogrammes pour toutes les concentrations testées avant la phase exponentielle tardive commençant après 8 heures (voir la figure 2A). Néanmoins, des changements majeurs sont observés dans l’émission de chaleur stationnaire, où le deuxième pic de flux de chaleur est sensiblement abaissé pour A. baumannii traité avec 5 μM et 10 μM de tétracycline. Des concentrations plus faibles ont eu un effet aussi, ce qui était toutefois moins prononcé. Cet effet entraîne également une prolongation dans le temps à pic comme indiqué dans la figure 2C. Les courbes de chaleur libérées cumulatives (figure 2B) montrent que les cellules non traitées et traitées n’affichent pas de différences significatives dans la forme globale de la courbe, mais par tendance, la pente des courbes diminue à des concentrations plus élevées de tétracycline. Cela se traduit également par des taux métaboliques quantifiés affichés à la figure 2D, où un effet dépendant de la concentration (c.-à-d. diminution du taux métabolique à l’augmentation des concentrations d’antibiotiques) est observé. Ces résultats soutiennent le fait que la tétracycline a un effet bactériostatique.

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Figure 2D : Effet de la tétracycline sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogrammes indiqués sous forme de flux de chaleur (μW) par rapport au temps (h) pour le type sauvage (WT) A. baumannii DSM-30008, non traité et exposé à la tétracycline. (B) Chaleur cumulative (mJ) vs temps (h). (C) Temps de pic (h) avec barres d’erreur (écart type). (D) Taux métabolique (μW) avec barres d’erreur (écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Des effets encore plus prononcés peuvent être observés lors du traitement de A. baumannii avec l’inhibiteur de synthèse protéique chloramphénicol qui cible la sous-unité ribosomale 50S. L’exposition à des concentrations croissantes de chloramphénicol entraîne une prolongation de la phase de décalage et des changements significatifs de l’activité métabolique dans la phase stationnaire (figure 3A et figure 3B). Aucun changement de taux métabolique n’est observé pour la concentration la plus faible testée et la concentration d’essai la plus élevée choisie (50 μM) empêche la plupart des rejets d’énergie de l’échantillon. Si l’on examine les concentrations intermédiaires d’essais (5 μM et 10 μM), le temps de pointe est considérablement augmenté d’environ 8 à 9 heures (figure 3C). Simultanément, le taux métabolique des cellules traitées est considérablement réduit, avec 50 μM étant mortel (Figure 3D). Dans l’ensemble, les changements observés à des concentrations allant jusqu’à 10 μM de chloramphénicol sont compatibles avec un effet bactériostatique de cette classe d’antibiotiques.

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Figure 3D : Effet du chloramphénicol sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogrammes indiqués sous forme de flux de chaleur (μW) par rapport au temps (h) pour le type sauvage (WT) A. baumannii DSM-30008, non traité et exposé au chloramphénicol. (B) Chaleur cumulative (mJ) vs temps (h). (C) Temps de pic (h) avec barres d’erreur (écart type). (D) Taux métabolique (μW) avec barres d’erreur (écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le traitement de la rifampicine dans la plage de concentration sélectionnée a un effet dramatique sur les thermogrammes de A. baumannii DSM-30008 liés à la durée de la phase de décalage et aux effets sur la croissance jusqu’à la phase stationnaire tardive (Figure 4A). Une réduction significative des émissions de chaleur peut être observée dans la figure 4B qui va de pair avec une diminution de l’activité métabolique. La figure 4C et la figure 4D illustrent l’influence de la prolongation de la phase de décalage et des changements de l’activité métabolique dans la phase stationnaire. La figure 4C montre une augmentation nette du temps au sommet pour toutes les concentrations utilisées. La figure 4D illustre la diminution du taux métabolique causée par la diminution de la pente pour toutes les concentrations habituellement attribuées à un effet bactéricide. En raison de l’abattage induit par les antibiotiques des cellules bactériennes, l’activité métabolique devrait être plus faible en raison d’un plus petit nombre de bactéries actives présentes. Les données recueillies sont d’accord avec le fait que le rifampicine peut agir bactéricide et bactériostatique, et les données présentées ici soutiennent principalement les effets bactéricides des concentrations choisies.

Figure 4A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4B : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4C : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4D : Effet de la rifampicine sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogrammes indiqués sous forme de flux de chaleur (μW) par rapport au temps (h) pour le type sauvage (WT) A. baumannii DSM-30008, non traité et exposé à la rifampicine. (B) Chaleur cumulative (mJ) vs temps (h). (C) Temps de pic (h) avec barres d’erreur (écart type). (D) Taux métabolique (μW) avec barres d’erreur (écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La concentration d’essai sélectionnée la plus faible de l’antibiotique du produit naturel (0,25 μM) n’a pas ou seulement d’effets marginaux sur le thermogramme de A. baumannii DSM-30008. Toutefois, d’autres concentrations testées présentent un certain effet sur la durée de la phase de décalage et affectent la croissance jusqu’à la phase stationnaire tardive (figure 5A). L’effet le plus évident est la réduction significative des émissions de chaleur dans la phase stationnaire. Les données affichées à la figure 5B montrent clairement que l’énergie libérée est significativement diminuée pour toutes les concentrations efficaces et que la pente est également diminuée. Ces effets se traduisent par une diminution du temps à un pic (figure 5C) et, plus important encore, une diminution significative et clairement dépendante de la dose du taux métabolique est observée (figure 5D). L’étude du nouveau produit naturel myxobactérien a indiqué un effet bactériostatique et bactéricide combiné.

Figure 5A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5B : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5C : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5D : Effet d’un nouveau produit naturel antibactérien sur la croissance et le métabolisme de A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogrammes indiqués sous forme de flux de chaleur (μW) par rapport au temps (h) pour le type sauvage (WT) A. baumannii DSM-30008, non traité et exposé au produit naturel. (B) Chaleur cumulative (mJ) vs temps (h). (C) Temps de pic (h) avec barres d’erreur (écart type). (D) Taux métabolique (μW) avec barres d’erreur (écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Sélection d’une nouvelle expérience dans l’interface logicielle. Dans un carré rouge, l’étape pour sélectionner une nouvelle expérience est représentée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Nommer une nouvelle expérience dans l’interface logicielle. Dans un carré rouge, l’étape pour nommer et confirmer la nouvelle expérience est représentée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Démarrage d’une nouvelle expérience dans l’interface logicielle. Dans un carré rouge, l’étape pour commencer une nouvelle expérience est représentée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 4 : La sélection des puits et le début de réaction dans l’interface logicielle. Tous les puits de réaction sont sélectionnés (puits colorés en bleu profond, bouton Sélectionnez tous représentés dans un carré rouge) et le début de réaction est sélectionné (représenté dans un carré rouge). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 5 : Chargement correct du porte-gobelets. Les puits de référence sont sélectionnés (couleur bleu foncé, carré rouge) et les thermogrammes sont affichés dans une fenêtre contextuelle. Lorsque la charge est effectuée correctement, nous observons une forte baisse du signal d’émission de chaleur détecté qui doit atteindre une phase de plateau et rester dans cette phase pendant environ 2-3 min, puis le signal retourne au point de départ. Lorsque cela est observé, le chargement du porte-gobelets est correct. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 6 : Fin de l’expérience. En rouge, le bouton Stop de l’expérience est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 7 : Confirmation de la fin de l’expérience. En rouge, le bouton Oui pour confirmer la fin de l’expérience en cours d’exécution est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 8 : Enregistrement du fichier d’expérience. Une fenêtre contextuelle avec des options de fichier d’enregistrement s’affiche et en rouge le bouton Enregistrer est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 9 : Interface logicielle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 10 : Accès aux expériences enregistrées. En rouge, le bouton Ouvrir l’expérience pour accéder aux expériences enregistrées est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 11 : Ouverture d’un fichier d’expérience sélectionné. En rouge, le bouton Open est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 12 : Vue des puits par défaut. Tous les puits expérimentaux et les thermogrammes correspondants sont visibles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 13 : Sélection des puits pour analyse. En rouge, le bouton Sélectionner tout est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 14 : Définition de la ligne de base. En rouge, le bouton Définir la ligne de base est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 15 : Sélection du signal de base. Un minimum de 30 min de signal dans la phase de décalage est sélectionné (boîte rouge). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 16 : Économie des modifications apportées au fichier expérimental. En rouge, le bouton Enregistrer est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 17 : application d’analyse de calorimétrie basée sur le Web. L’interface logicielle en ligne et la voie de téléchargement de fichiers sont affichées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 18 : Téléchargement d’un fichier expérimental sélectionné. En rouge, le bouton Open est représenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 19 : Analyse des thermogrammes. Les paramètres métaboliques calculés pour chaque puits expérimental sont représentés en rouge. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 20 : Adapter les données expérimentales aux modèles de croissance théoriques. Les données sur le débit de chaleur sont adaptées soit à un Gompertz, soit au modèle de croissance de Richard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 21 : Exportation des mesures. En rouge, les boutons Télécharger mesures et enregistrer sont représentés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Discussion

La microcalorimétrie isotherme mesure l’énergie émise par un spécimen au fil du temps et cette libération d’énergie est le résultat de tous les processus biologiques, physiques et (bio)chimiques. Le flux de chaleur mesuré peut être exploité pour évaluer ou déterminer les effets antibactériens des substances car il permet une surveillance continue en temps réel de l’activité métabolique.

Afin d’obtenir des données fiables pour l’analyse, il faut déterminer individuellement les unités de formation des colonies de départ (CFU) pour chaque espèce ou souche utilisée. Dans le cas où le nombre de CFU est trop faible, cela conduit à une phase de décalage prolongée car il faut plus de temps pour que le système atteigne une quantité critique de biomasse produisant suffisamment de chaleur pour être détecté. Dans le cas où le nombre de CFU est trop élevé, la phase de décalage sera très courte, et la quantité de chaleur produite peut provoquer le transfert de chaleur vers les cellules du capteur voisin (puits de référence et expérimentaux) et provoquer des distorsions des thermogrammes. Un nombre élevé de CFU entraînera également un épuisement plus rapide de l’oxygène et passera à des conditions anaérobies. Il convient également de tenir compte du fait que pendant les 30 premières minutes de l’expérience, lorsque le système est équilibré, que la collecte de données n’est pas possible et que l’enregistrement réel des effets est retardé. En outre, une détermination incorrecte de l’ECC conduit à une fausse détermination du MIC, affectant en fin de compte l’expérience et les changements observés²⁵. Un autre point critique est la détermination correcte de la ligne de base. Habituellement, le signal de base est sélectionné pendant la phase de décalage lorsque le signal de flux de chaleur est nul et idéalement, la plage de temps pour la définition de base est de >30 min. Cependant, ce n’est pas toujours possible car le temps dont la bactérie a besoin pour atteindre la limite de détection du signal thermique diffère entre les souches et les espèces. Certaines espèces ou souches nécessitent plus de 30 minutes pour atteindre la limite de détection du signal thermique, tandis que d’autres souches ou espèces l’atteignent dans les 30 premières minutes. Dans ce cas, il est possible de sélectionner le signal de base à la fin de l’expérience lorsque tous les signaux de chaleur sont retombés à zéro et restent stables. Alternativement, les lignes de base d’autres expériences avec la même souche bactérienne peuvent être utilisées, ce qui n’est toutefois pas recommandé.

Le système permet une certaine flexibilité en termes de conception et d’optimisation des expériences et de dépannage. Les volumes utilisés sont de l’ordre de 100 à 300 μL lors de l’utilisation d’inserts en plastique et de 100 à 600 μL lors de l’utilisation de gobelets en titane sans les inserts en plastique. Le volume de travail recommandé par le fabricant est de 120 μL. L’utilisation de différents volumes dans la mise en place d’une nouvelle série expérimentale, et tout en trouvant des conditions optimales pour les mesures, a un impact principalement sur deux paramètres. En utilisant des volumes plus faibles, la quantité de composé d’essai requis peut être diminuée, ce qui est particulièrement important pour les composés, qui ne sont disponibles qu’en petites quantités. En outre, le volume utilisé a un impact direct sur la disponibilité de l’oxygène pendant la mesure, les volumes plus faibles augmentant la quantité d’oxygène disponible nécessaire à la croissance bactérienne. L’épuisement de l’oxygène est l’un des principaux facteurs contribuant à la durée maximale possible de l’expérience. Fait important, il est possible d’utiliser des supports solides, pas seulement des supports liquides. Ceci est particulièrement important pour les micro-organismes à croissance lente car la croissance sur l’interface entre la phase solide et la phase gazeuse permet un meilleur accès à l’oxygène⁹.

IMC est un outil d’analyse utile pour découvrir des processus inconnus avec des applications en physique, chimie et biologie. La méthode mesure l’échange de chaleur au sein d’un système fermé et l’analyse de l’échange de chaleur enregistré fournit des informations supplémentaires qui ne peuvent pas toujours être obtenues avec des méthodes standard. Dans la recherche en microbiologie et en antibiotiques, l’un des plus grands avantages de l’IMC est sa capacité à distinguer les cellules vivantes, mortes et persistantes ou dormantes, ce qui n’est pas possible en utilisant les méthodes standard de turbidité¹¹. En outre, IMC est très sensible et il peut détecter les émissions de chaleur d’aussi peu que 10^{4-10 5} cellules⁹. Un autre avantage est que la configuration expérimentale est rapide et facile, et il permet un suivi continu, en temps réel avec un minimum à aucune interférence utilisateur. De plus, IMC n’est pas destructif, ce qui permet une analyse plus poussée des échantillons. L’analyse des données permet le découplage de la formation de biomasse jusqu’à la phase exponentielle ou stationnaire tardive et l’activité métabolique en phase stationnaire.

Outre les nouveautés et les fonctionnalités d’application passionnantes mentionnées ci-dessus, il ya aussi des inconvénients à cette méthode. La principale limitation est que les instruments IMC mesurent la chaleur totale produite et libérée dans un système spécifique, qui comprend également des signaux non spécifiques. Cela souligne l’importance de la planification expérimentale avec des contrôles appropriés pour être en mesure d’évaluer les changements de signal de chaleur qui sont mesurés en enregistrant le flux de chaleur^9,20.

Entre nos mains, IMC est un outil important pour étudier les effets antibactériens des nouveaux produits naturels et pour déterminer les gammes de concentration efficaces. Outre la différenciation des effets bactériostatiques et bactéricides, il pourrait être utilisé à l’avenir dans le cadre d’études d’identification des cibles et de détermination du moA. Cela peut être fait en comparant les thermogrammes de différentes classes d’antibiotiques aux thermogrammes de nouveaux composés actifs comme indiqué ici. Toutefois, il reste à examiner si certains paramètres quantifiables qui peuvent être extraits des données mesurées sont suffisants pour de telles comparaisons ou s’il sera nécessaire de travailler sur des algorithmes donnant des empreintes digitales basées sur des thermogrammes complets. Une autre application possible dans le domaine de la recherche antibiotique est la comparaison du type sauvage aux clones résistants, couplé avec le séquençage du génome entier, qui peut aider à élucider le mode de résistance (MoR) de nouveaux antibactériens. En raison de la nature statique de la méthode, l’étude de l’efficacité de nouveaux agents sur la formation de biofilms ou sur les biofilms déjà établis pourrait conduire à une meilleure compréhension du processus biologique et de l’effet des agents sélectionnés sur les microbes à différents stades de dormance. IMC enregistre l’énergie totale libérée sous forme de chaleur, ce qui en fait une méthode appropriée pour étudier également les effets sous-inhibiteurs des substances actives qui pourraient être couplées à la transcriptomique. Cette méthode peut également être utilisée en milieu clinique pour détecter la contamination des échantillons ou pour la détermination d’antibiogrammes aidant à décider rapidement sur le traitement défini des patients¹¹.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acinetobacter baumannii	DSMZ	Souche de référence DSM-30008	utilisée dans cette étude
calPlate	Symcel	1220093	plaque à 48 puits pour coupelles en titane à insérer
calScreener	Instrument de microcalorimétrie isotherme	Symcel
1200001 calView Logiciel	collecte et d’analyse	Symcel
calWell	Symcel	1901004	plaque de 48 puits de qualité micro-biologique (non active) avec inserts en plastique qui sont insérés dans les coupelles en titane
Gélose CASO	Carl Roth	X937.1	isolement et culture de micro-organismes
Chloroamphénicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotique
Ciprofloxacine	Sigma-Aldrich	17850	antibiotique
Cuvettes	Marque	759015	Cuvettes de 1,5 mL
Boucles d’inoculation jetables	Sarsted	86.1562.050	10 µ ; Boucles d’inoculation en L
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	85190
Tubes Eppendorf	Eppendorf	30120086	1,5 mL Tubes Eppendorf Safe-Lock
Éthanol	Thermo Fisher Scientific	10428671
Falcon Tubes	Sarsted	62.554.502	15 mL Tubes
Falcon Chlorhydrate (HCL)	Thermo Fisher Scientific	10316380
Méthanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Mueller Hinton Broth	Sigma-Aldrich	70192	milieu liquide pour les études de sensibilité aux antibiotiques
Mueller Hinton Broth II Milieu ajusté aux cations	Sigma-Aldrich	90922	Mueller Hinton Bouillon ajusté aux cations à 1,25 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2
Boîtes de Pétri	LABSOLUTE	7696404
Pipette 100 - 1000 µ ; L	Marque	705880
Pipette 2 - 20 & micro ;	Pipette	705872
marque L 20 - 200 & micro ; L	Marque	705878
Pointes de pipette 100 - 1000	Marque	732032
Pointes de pipette 2 - 200 µ ; L	Marque	732028
Polymyxine B	Sigma-Aldrich	P0972	antibiotique
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501	antibiotique
Thermo	Fisher Scientific	170356N	10 mL Nunc Pipette sérologique
Spectrophotomètre	Eppendorf AG	6135 000.017
Filtres stériles	Minisart	16534----------K	0.2 & micro ; Filtres stériles de taille des pores
Seringue 50 mL	NORM-JECT	22778
Tétracycline	Sigma-Aldrich	87128
antibiotique Gobelets en titane	Symcel	1220089	insérés dans des couvercles en titane à 48 puits calPlate
Couvercles en titane	Symcel	1220091	vissés et serrés aux cupules en titane
Trimethroprim	Sigma-Aldrich	T7883	antibiotique
Pince à épiler	Symcel	1900602