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Article de méthode

Approche systématique pour identifier les nouvelles molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits et de fractions de plantes pour prévenir les caries dentaires

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DOI :

10.3791/61773

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31 mars 2021

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les produits naturels représentent des points de départ prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments et agents thérapeutiques. Cependant, en raison de la grande diversité chimique, trouver de nouveaux composés thérapeutiques à partir des plantes est une tâche difficile et longue. Nous décrivons une approche simplifiée pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits de plantes et de fractions.

Résumé

Les produits naturels fournissent des substances structurellement différentes, avec une myriade d’activités biologiques. Toutefois, l’identification et l’isolement des composés actifs par rapport aux plantes sont difficiles en raison de la matrice complexe des plantes et des procédures d’isolement et d’identification qui prennent beaucoup de temps. Par conséquent, une approche stepwise pour le criblage des composés naturels des usines, y compris l’isolement et l’identification des molécules potentiellement actives, est présentée. Il comprend la collecte du matériel végétal; préparation et fractionnement d’extraits bruts; les approches de chromatographie et de spectrométrie (UHPLC-DAD-HRMS et NMR) pour l’analyse et l’identification des composés; bioassays (activités antimicrobiennes et antibiofilms; « force d’adhérence » bactérienne à la pellicle salivaire et matrice de glucane initiale traitée avec des traitements sélectionnés); et l’analyse des données. Le modèle est simple, reproductible, et permet un criblage à haut débit de plusieurs composés, concentrations et étapes de traitement peuvent être constamment contrôlés. Les données obtenues fournissent les bases d’études futures, y compris des formulations avec les extraits et/ou fractions les plus actifs, l’isolement des molécules, la modélisation des molécules à des cibles spécifiques dans les cellules microbiennes et les biofilms. Par exemple, une cible pour contrôler le biofilm cariogenic est d’inhiber l’activité des glucosyltransferases de Streptococcus mutans qui synthétisent les glucanes de la matrice extracellulaire. L’inhibition de ces enzymes empêche l’accumulation de biofilm, diminuant sa virulence.

Introduction

Les premiers modèles de médecine utilisés dans les sociétés étaient basés sur des produits naturels (PN). Depuis lors, les humains ont été à la recherche de nouveaux produits chimiques dans la nature qui peuvent être transformés enmédicaments 1. Cette recherche a entraîné une amélioration continue des technologies et des méthodes de dépistage ethnobotanique1,2,3. Les PN offrent une riche source de substances structurellement diversifiées, avec un large éventail d’activités biologiques utiles pour développer des thérapies alternatives ou adjuvantes. Toutefois, la matrice végétale complexe inhérente fait de l’isolement et de l’identification des composés actifs une tâche difficile et fastidieuse4.

Les médicaments ou formulations à base de PN peuvent être utilisés pour prévenir et/ou traiter plusieurs affections affectant l’oral, y compris les caries dentaires4. Caries dentaires, l’une des maladies chroniques les plus répandues dans le monde, dérive de l’interaction de l’alimentation riche en sucre et biofilms microbiens (plaque dentaire) formés sur la surface des dents qui conduit à la déminéralisation causée par des acides organiques dérivés du métabolisme microbien, et si elle n’est pas traitée, conduit à la perte dedents 5,6. Bien que d’autres micro-organismes puissentêtre associés 7, Streptococcus mutans est une bactérie cariogenic critique parce qu’elle est acidogène, acidurique, et un constructeur extracellulaire de matrice. Cette espèce code plusieurs exoenzymes (p. ex., glycosyltransferases ou Gtfs) qui utilisent le saccharose comme substrat8 pour construire la matrice extracellulaire riche en exopolysaccharides, qui sont un déterminant de la virulence9. En outre, le champignon Candida albicans peut conduire jusqu’à la production de cette matrice extracellulaire7. Bien que le fluorure, administré dans diverses modalités, reste la base pour prévenir les caries dentaires10, de nouvelles approches sont nécessaires comme adjuvants pour augmenter son efficacité. De plus, les modalités anti plaque disponibles sont fondées sur l’utilisation d’agents microbicides à large spectre (p. ex., chlorhexidine)11. Comme alternative, les PN sont des thérapies potentielles pour contrôler les biofilms et prévenir les cariesdentaires 12,13.

Les progrès supplémentaires réalisés dans la découverte de nouveaux composés bioactifs provenant de plantes comprennent les étapes ou les approches nécessaires telles que : (i) l’utilisation de protocoles fiables et reproductibles pour l’échantillonnage, étant donné que les plantes présentent souvent une variabilité intraspécifique; (ii) la préparation d’extraits complets et de leurs fractions respectives à petite échelle; iii) la caractérisation et/ou la dréplication de leurs profils chimiques pensaient à l’acquisition de données multidimensionnelles telles que GC-MS, LC-DAD-MS ou NMR, par exemple; iv) l’utilisation de modèles viables et à haut rendement pour évaluer la bioactivité; v) la sélection de nouveaux résultats potentiels basés sur une analyse multivariante des données ou d’autres outils statistiques; vi) d’effectuer l’isolement et la purification des composés ciblés ou des candidats prometteurs; et (vii) la validation des activités biologiques correspondantes à l’aide des composés isolés2,14.

La dréplication est le processus d’identification rapide des composés connus dans l’extrait brut et permet de différecier de nouveaux composés de ceux qui ont déjà été étudiés. En outre, ce processus empêche l’isolement lorsque la bioactivité a déjà été décrite pour certains composés, et il est particulièrement utile de détecter les « frappeurs fréquents ». Il a été utilisé dans différents flux de travail non ciblés allant de l’identification des composés majeurs ou l’accélération de la fractionnement guidé par l’activité jusqu’au profilage chimique des collections d’extraits. Il peut être entièrement intégré avec des études métabolomiques pour le profilage chimique non ciblé de ce ou l’identification ciblée des métabolites. Tout cela conduit finalement à hiérarchiser les extraits avant les procéduresd’isolement 1,15,16,17.

Par conséquent, dans le présent manuscrit, nous décrivons une approche systématique pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits végétaux et de fractions. Il comprend quatre étapes multidisciplinaires : (1) la collecte de matériel végétal; (2) la préparation d’extraits bruts (CE) et de fractions (CEF), suivie de leur analyse du profil chimique; (3) bioassays; et (4) les analyses de données biologiques et chimiques (figure 1). Ainsi, nous présentons le protocole développé pour analyser les activités antimicrobiennes et antibiofilms des extraits et fractions de Casearia sylvestris contre streptococcus mutans et candida albicans13, ainsi que les procédures de caractérisation phytochimique et d’analyse des données. Par souci de simplicité, l’objectif ici est de démontrer l’approche de dépistage des composés naturels à l’aide de la bactérie.

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Figure 1 : Diagramme de flux de l’approche systématique pour identifier les molécules actives à partir d’extraits et de fractions de plantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Protocole

1. Collection de matériel végétal

  1. Matériel végétal
    1. Enregistrez l’accès au matériel végétal sur des plateformes électroniques qui régulent l’accès au patrimoine génétique dans le pays où la collecte aura lieu. Par exemple, au Brésil, inscrivez-vous auprès du Système national pour la gestion du patrimoine génétique et des savoirs traditionnels associés – SisGen (site Web https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Recueillir des échantillons du matériel végétal d’intérêt (p. ex., feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits). Inscrivez-vous si le matériel a été recueilli pendant la reproduction ou la phase végétative.
    3. Enregistrez les paramètres de collecte (date, géoréférencement, température annuelle moyenne et pourcentage moyen d’humidité).
    4. Identifier les échantillons avec précision, et un taxonomiste doit confirmer l’authenticité.
  2. Stabilisation et stockage des échantillons végétaux
    1. Séparez les organes végétaux dans des sacs ou des flacons en plastique individuels immédiatement après les collections.
    2. Inactiver les réactions enzymatiques potentielles en gelant immédiatement dans de l’azote liquide, (ii) en déshydratant dans un four à air circulant (40 °C) ou (iii) en gelant les échantillons par lyophilisation.
    3. Conserver le matériau stabilisé dans des sacs hermétiquement scellés à température ambiante ou au congélateur jusqu’à utilisation (-20 ou -80 °C, selon la période d’entreposage ou l’utilisation prévue).
    4. Moudre les échantillons dans un moulin analytique (couteau ou boule, selon le type de tissu ou la disponibilité) et normaliser la taille des particules à l’aide de tamis normalisés.
    5. Pesez les échantillons individuellement pour les étapes d’extraction subséquentes.

2. Préparation d’extraits bruts (CE) et de fractions (CEF) à l’analyse du profil chimique et aux bioassays

  1. Préparation d’extraits bruts (CE)
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 2A.
    1. Préparer un solvant d’extraction avec un mélange hydroalcoolique (p. ex., éthanol (EtOH) 70 % ou mélanges ternaires d’eau, etoh, et d’autres modificateurs, définis par la conception expérimentale de selon les rapports précédents).
    2. Utilisez le rapport poids de l’échantillon (poids sec, mg)/ solvant d’extraction (mL) variant de 50 à 100 mg pour chaque mL de solvant.
    3. Pour des extractions rapides et reproductibles, utilisez des extractions par lots à l’aide de microtubes.
      REMARQUE : Au moins trois répliques doivent être utilisées à ce stade pour permettre l’analyse statistique.
    4. Effectuez des extractions assistées par ultrasons (EAU) pour le rendre rapide, facile et bon marché.
    5. Répétez la procédure trois fois (15 min chacun) pour obtenir la meilleure efficacité.
    6. Après chaque étape d’extraction, décanter les résidus solides par centrifugation et enlever le supernatant.
    7. Combinez les supernatants individuellement, filtrez et économisez des aliquots pour une analyse chimique et des bioassays simultanés. Si nécessaire, retirez le solvant d’extraction sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation, et enregistrez la pesée et le rendement.
    8. Conserver à -20 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pour filtrer le CE et sélectionner ceux qui présentent l’activité désirée.
  2. Fractionnement des extraits bruts (CEF)
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 2B.
    1. Utilisez des cartouches avec au moins 1 g d’adsorbent. Si les alcaloïdes sont potentiellement présents dans le CE, utilisez des solvants contenant 0,1 % de l’acide formique (FA).
    2. Diluer l’échantillon dans le solvant (ou mélange de solvant) le plus approprié pour obtenir une solution d’échantillon de 100 mg/mL. Ensuite, transférez 1 mL de la solution d’échantillon à une cartouche d’extraction de phase solide précon conditionnée - SPE (1 g d’adsorbent, 6 mL de capacité).
    3. Effectuer la fractionnement en utilisant environ trois volumes morts de chaque eluent d’extraction (à une cartouche de 1 g, il correspondra à 2 mL de chaque solvant). Si les alcaloïdes sont potentiellement présents dans le CE, utilisez des solvants contenant 0,1 % de la FA.
    4. Recueillir une fraction par composition élitente et enregistrer des aliquots pour l’analyse chimique simultanée et les bioassays.
    5. Enlevez le solvant sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation et enregistrez la pesée et le rendement.
      REMARQUE : Si le CE est difficile à dissoudre dans le mélange d’élitution initial, dispersez le CE en phase solide (p. ex., C18 ou celite) en proportion de 1:1 (w/w) avant de charger le matériau sur le dessus de la cartouche.
      MISE EN GARDE: Pesez les microtubes à l’avance pour calculer le rendement en masse des extraits et des fractions.
  3. Analyse du profilage chimique
    REMARQUE : Étant donné que chaque espèce végétale a besoin de méthodes optimisées et spécifiques pour son analyse chimique, dans les sections suivantes, nous décrivons les approches analytiques les plus courantes utilisées pour analyser les matériaux végétaux. À titre d’exemple pratique, une chromatographie liquide en phase inverse a été mise au point et validée pour l’analyse simultanée de composés phénoliques et de diterpenes de type clérodane biosynthésiés différemment par deux variétés de Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). L’appareil UPLC-DAD était équipé d’un dégasser, d’une pompe quaternaire, d’un échantillonneur automatique, d’un détecteur de tableau de photodiodes UV-Vis et d’un four (voir les détails dans Bueno et al., 201518). Des approches similaires décrites dans les exemples suivants peuvent être optimisées en fonction d’autres espèces végétales et/ou de matériaux végétaux.
    1. Possibilités d’analyse chromagraphique et d’hyphenation
      1. Pour les séparations utilisant une chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), utilisez une colonne chromatographique C18 (p. ex., 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) protégée par une pré-colonne compatible.
        REMARQUE : D’autres phases de colonne ou modes chromatographiques peuvent être utilisés en fonction de l’espèce végétale ou du matériau. Hplc conventionnel peut également être utilisé; dans ce cas, une colonne chromatographic appropriée doit être choisie. Pour obtenir d’excellentes séparations, ajustez les conditions chromatographiques en tenant compte du débit (μL/min), de la température de la colonne (°C) et du volume d’injection (μL). La phase mobile se compose généralement d’eau (A) et d’acétyltrile ou de méthanol (B) à l’aide de gradients d’élitution linéaires ou multi-étapes ou d’élitution isocratique. Des modificateurs tels que des tampons, des acides, des bases ou d’autres peuvent également être utilisés.
      2. Effectuer l’analyse des matières végétales (CE et/ou CEF) et enregistrer toutes les données connexes, telles que les données spectrales (à l’aide d’un UV-Vis et/ou, de préférence, les détecteurs de SP), le temps de rétention (min), et d’autres, selon l’hyphenation disponible.
        REMARQUE : La chromatographie liquide (LC) est habituellement hyphenated (couplée) avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS), comme LC−HRMS, et est couramment utilisée pour l’annotation rapide du métabolite dans CE ou CEF15.
      3. Si des données qualitatives sont nécessaires et que des données quantitatives sont nécessaires, préparez et injectez soigneusement des courbes d’étalonnage, selon le même protocole.
        REMARQUE : Le développement des meilleures conditions chromatographic peut être exécuté avec l’aide de la conception des expériences, comme décrit par Bueno et autres 201518,ou littérature semblable. Il est important d’envisager l’inclusion de normes internes lors de l’élaboration de la méthode. Ils sont très appréciés car ils permettent des écarts techniques corrects pendant la préparation de l’échantillon et les injections, et une normalisation plus poussée pour l’analyse des données.
  4. Analyse de données univariate et multivarié
    1. Exporter les chromatogrammes enregistrés dans un format approprié (p. ex., ASCII, .txt. ou .csv format). Une matrice de données unique peut être définie en joignant et en alignant les chromatogrammes si plusieurs échantillons sont analysés, et des comparaisons sont nécessaires. Les matrices qui en résultent doivent être normalisées les chromatogrammes selon la norme interne utilisée.
    2. Analyser les données métabolomiques des plantes à l’aide de méthodes multivariées et univariées. Explorez et visualisez les ensembles de données métabolomiques au moyen de l’analyse simultanée de variables multiples à l’aide de méthodes statistiques multivariées, y compris l’analyse des principaux composants non supervisés (PCA) et l’analyse hiérarchique du clustering (HCA), ou l’analyse partielle des moindres carrés supervisée (comme le PLS, l’OPLS, le PLS-DA). Les méthodes univariables, telles que le t-test d’ANOVA, Student’s, Tukey et Welch, sont particulièrement intéressantes pour l’analyse précise des différences quantitatives entreles échantillons 19.
  5. Dréplication et annotation des composés
    REMARQUE : L’objectif de cette étape est consacré à l’identification rapide en ligne des PN connus afin d’éviter l’isolement fastidieux qui peut être effectué simultanément à l’analyse de données uni ou multivariées.
    1. Effectuer les niveaux d’identification des composés détectés ou cibles :
      1. Composé identifié, y compris la structure 3D complète et la stéréochimie (niveau 0);
      2. Identification réalisée par deux paramètres orthogonaux, tels que le temps de rétention et le spectre MS/SP (niveau 1);
      3. Composés et classes composés putativement annotés (niveaux 2 et 3);
      4. Métabolites non identifiés ou non classifiés qui peuvent être différenciés sur la base de données analytiques (niveau 4)19,20.
    2. Caractériser les composés connus à l’aide des bases de données commerciales ou publiques. Parmi les bases de données les plus importantes, il peut être mis en évidence : NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) et Global Natural Products Social Molecular Networking – base de données GNPS (https://gnps.ucsd.edu)19.
      REMARQUE : Il existe différents niveaux d’annotations et ils dépendent de la technique hyphenated employée pendant l’étude et peuvent inclure : l’aide des bases de données spectrales basées sur ms- (ou NMR), et dans les algorithmes spectrals de prédiction silico.
    3. Isolement, purification et identification complète des composés
      REMARQUE : Si un composé donné (dont l’identité a été suspectée par les méthodes statistiques) a besoin d’une identification structurelle complète, la première étape pour accomplir cette tâche est d’isoler et de purifier les composés désirés à une plus grande échelle. Il peut être accompli en haussant les protocoles déjà développés.
      1. Effectuer l’isolement rapide et direct du composé cible (s) par des techniques chromatographiques préparatives bien établies et optimisées. HpLC semi-preparative avec injection de charge sèche peut être utilisé pour éviter les compromis qui doivent généralement être faites entre le chargement élevé et la solubilisation del’échantillon 1.
      2. Réaliser la caractérisation structurelle complète et l’identification des composés isolés. Ceci peut être fait par la combinaison de différentes techniques :
        1. Résonance magnétique nucléaire (RMN);
        2. Spectrométrie de masse (SP);
        3. Les techniques spectrométriques dans les régions ultraviolettes (UV) et infrarouges (IR) sont également très utiles pour la caractérisation des groupes fonctionnels;
        4. L’utilisation de la spectroscopie chiropticale telle que le dichroism circulaire électronique et vibratoire (ECD et VCD, respectivement), l’activité optique de Raman (ROA), et la cristallographie de rayon X sont des techniques importantes pour la caractérisation absolue de configuration.

3. Bioassays

REMARQUE : Dépistage biologique : Pour évaluer rapidement la bioactivité potentielle de ce et de CEF, le dépistage initial des substances naturelles devrait être organisé et simple.

  1. Préparation de ce et cef pour les bioassays
    1. Reconstituer la matière sèche avec les meilleurs solvants possibles (qui peuvent être déterminés expérimentalement). La conception expérimentale21,22 définissent la solution de stock et la concentration de solvants.
    2. Calculer la concentration de solvants de la solution de stock. Pour ce faire, utilisez la formule : C1 x V1 = C2 x V2, où C1 représente la solution de stock (mg) de CE et/ou de CEF; V1 représente le volume de solvant; C2 est le poids du CE et/ou du CEF; V2 est le volume final (mL) de la solution stock.
      REMARQUE : Par exemple, nous avons choisi 84,15 % d’EtOH et 15 % de sulfure de diméthyle (DMSO) comme concentration de solvants de la solution de stock. Nous avons préparé la concentration de stock du CE à 6 mg/mL et du CEF à 1 mg/mL13. Le solvant pour diluer le CE et le CEF dépendra de la méthode d’évaluation de l’activité biologique. Le solvant utilisé comme véhicule ne doit pas interférer avec l’activité biologique et toxicologique. En règle générale, l’eau, DMSO, EtOH, ou un solvant aqueux à base d’EtOH est utilisé pour solubiliser les extraits de plantes ou les dérivésvégétaux 4,13.
  2. Préparation d’organismes d’essai
    1. Réactiver une souche microbienne, par exemple S. mutans UA159 sur l’agar sanguin (48 h, 37 °C, 5 % de CO2) et culture dans le milieu de culture liquide (p. ex., bouillon d’extrait tryptone-levure [TYE : 2,5 % (w/v) tryptone avec 1,5 % (w/v) extrait de levure) contenant 1 % de glucose (w/v) (TYEg) pendant 16 h, 37 ° C, 5 % de CO2.
    2. Effectuer une dilution de 1:20 de la culture initiale du micro-organisme dans le même milieu de culture (le rapport de dilution de la culture initiale peut changer selon la conception expérimentale).
    3. Incuber jusqu’à ce qu’il atteigne la phase de croissance mi-journal.
    4. Préparer l’inoculum à des bioassays avec une population définie (p. ex., 2x106 unités de formation de colonies par millilitre - CFU/mL) dans TYEg pour les essais antimicrobiens et TYE avec 1 % de saccharose (w/v) (TYEs) pour les essais de biofilms.
      REMARQUE : Les conditions de croissance dépendront du micro-organisme testé.
  3. Activité antimicrobienne
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées à la figure 3.
    1. Dans une assiette de 96 puits, ajouter un aliquot (μL) de la solution de stock CE et/ou CEF (traitements). Le volume de l’aliquot est défini par la concentration d’essai, qui doit être sélectionnée sur la base d’études antérieures. Par exemple, pour tester ce à la concentration d’essai de 0,5 mg/mL, utilisez un aliquot de 16,67 μL de la solution de stock à 6 mg/mL. Pour ce calcul, utilisez la formule: C1 x V1 = C2 x V2, où C1 est la concentration de stock, V1 est le volume de la solution stock aliquot, C2 est la concentration d’essai, et V2 est le volume de la plaque de 96 puits (qui correspond à 200 μL). Dans cet état expérimental, la concentration d’essai des solvants (véhicule) sera de 7% EtOH et 1,25% DMSO.
    2. Inclure un ensemble de contrôles pour chaque plaque: une colonne avec des traitements, sans l’inoculum (contrôle vierge par traitement, aider à différencier la turbidité par le traitement utilisé lui-même de la croissance microbienne); une colonne avec véhicule et inoculum (diluant de CE ou CEF ou contrôle de 0 mg/mL); une colonne avec seulement le milieu de culture (contrôle moyen de culture) et une colonne avec seulement l’inoculum (contrôle microbien de croissance).
    3. À l’aide de TYEg, réglez le volume à 100 μL. Ensuite, incuber, par exemple, 24 h, 37 °C, 5 % de CO2 (selon le micro-organisme testé).
    4. Inoculer 100 μL d’inoculum micro-organisme (1x 106 CFU/mL) dans la plaque de 96 puits.
    5. Analyser la croissance bactérienne en fonction de la turbidité par inspection visuelle des puits (clair ou nuageux). Clair : signifie qu’il n’y a pas de croissance visuelle du micro-organisme. Nuageux : signifie qu’il y a une croissance visuelle du micro-organisme.
    6. Mesure de l’absorption (densité optique ou O.D.) de la culture bactérienne dans chaque puits (lecteur ELISA utilisant 540 nm). Ensuite, transférez 100 μL des cultures vers des microtubes contenant 900 μL de solution saline (0,89% NaCl), bien mélanger par vortex. Ensuite, continuez à effectuer une dilution sérielle décuplé jusqu’à la valeur désirée.
    7. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques (en double). Par exemple, 10 μL d’une dilution spécifique sur les plaques d’agar sanguin.
    8. Incuber. Les conditions peuvent changer entre les micro-organismes, par exemple, S. mutans: 48 h, 37 °C, 5 % DE CO2.
    9. Effectuer le nombre de colonies sur les plaques pour une transformation ultérieure en CFU/mL comme (Uncertain nombre de colonies x 10 n)/q. Dans cette formule,n égale la valeur absolue de la dilution (0, 1, 2 ou 3), et q égale la quantité, en mL, pipetted pour chaque dilution plaquée sur la plaque d’agar. En outre, le CFU/mL peut être converti en valeurs de journal.
      REMARQUE : Lorsque des extraits végétaux sont ajoutés au milieu de culture, des précipitations de particules provenant des extraits peuvent se produire. Ce fait peut rendre difficile l’interprétation des résultats. Il en va de même lorsqu’un lecteur de microplaques mesure la turbidité car, dans certains cas, les cellules s’agglutinent au bas de la microplaque. En outre, selon l’extrait utilisé, la couleur des extraits de feuilles végétales peut rendre difficile la quantification de laturbidité 23,24. Une méthode alternative utilise des sous-formes qui révèlent si les cellules microbiennes sont métaboliquement actives ou non24.
  4. Activité antibiofilm
    REMARQUE : Les étapes d’évaluation de l’effet des traitements sur la formation de biofilms sont illustrées à la figure 4.
    1. Formation et traitement de biofilms
      1. Diluer les traitements dans le milieu de la culture (TYEs) dans une plaque de 96 puits tel que décrit dans les étapes du protocole d’activité antimicrobienne.
      2. Incuber la plaque. Dans l’exemple de S. mutans, l’incubation est effectuée pendant 24 h, à 37 °C et 5 % de CO2.
      3. Après l’incubation, placer les plaques sur un shaker orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm) pour desserrer les cellules qui n’adhèrent pas au biofilm. Ensuite, jetez le milieu de culture contenant les cellules non adhérentes, et lavez les biofilms restants trois fois avec 0,89% de NaCl pour enlever les cellules non adhérentes.
    2. Quantification de la biomasse à partir de biofilms traités
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 4A.
      1. Gardez les biofilms lavés sur la plaque et ajoutez 50 μL de solution aqueuse de violette cristalline à chaque puits.
      2. Incuber la plaque à température ambiante pendant 35 min.
      3. Laver les puits tachés avec de l’eau MilliQ (trois fois) puis les sécher à l’air pendant 60-90 min.
      4. Elute la violette cristalline des puits tachés avec 200 μL de 99% EtOH en incubant la plaque dans un shaker orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm).
      5. Transférer un aliquot de 150 μL de chaque puits avec le colorant éluté dans une autre plaque et quantifier la biomasse de l’échantillon (lecteur ELISA 570 nm).
    3. Quantification de la population microbienne viable (CFU/mL) des biofilms traités
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 4B.
      1. Retirez les biofilms lavés de la plaque à l’aide d’une pipette et de 200 μL de NaCl 0,89 % et transférez la suspension qui en résulte individuellement sur des microtubes stériles.
      2. Utilisez 200 μL supplémentaires de NaCl 0,89 % par puits et transférez-le au tube correspondant, contenant déjà 200 μL de la suspension initiale du biofilm. Effectuez ce processus jusqu’à ce qu’il atteigne une suspension totale de 1 mL de biofilm par puits d’origine.
      3. Utilisez un aliquot de chaque tube pour effectuer une dilution en série décuplée.
      4. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques (en double). Par exemple, 10 μL d’une dilution spécifique sur les plaques d’agar sanguin.
      5. Incuber des plaques d’agar (p. ex., 48 h, 37 °C, 5 % de CO2),puis compter les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.
  5. Phase de validation de l’activité biologique
    1. Formation de pellicle salivaire
      1. Utilisez hydroxyapatite (HA) perles (Macro-Prep Céramique Hydroxyapatite Type I 80 μm) comme une surface pour former le film salivaire25. Ces perles de surface imitent l’émail dentaire.
      2. Peser les perles HA (p. ex., 10 mg) dans les microtubes et stériliser. Ensuite, utilisez le tampon d’adsorption (tampon AB : 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, en dd-H2O, pH 6,5]25 contenant 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF) et 0,02 % d’azide de sodium (NaN3) pour laver les perles.
      3. Recueillir et préparer la salivehumaine 26. Il est nécessaire d’obtenir l’approbation du comité d’éthique institutionnelle.
      4. Ajouter 500 μL de salive dans les microtubes et incuber (40 min, 37 °C, 24 rpm).
      5. Ensuite, retirez le surnatant salivaire et lavez les perles (trois fois avec tampon AB contenant PMSF et NaN3). Les perles sHA (perle HA avec pellicle salivaire) sont maintenant prêtes pour les analyses en aval.
        REMARQUE : La salive est recueillie auprès de bénévoles en bonne santé. Après la collecte, diluer la salive (1: 1 v/v) avec tampon AB et centrifugeuse (1699 x g, 20 min, 4 °C). Stériliser par filtration (filtre à membrane polyethersulfone avec une faible liaison à 0,22 μm protéines)26. Le Comité d’éthique institutionnelle doit approuver l’étude. Dans notre cas, le Comité d’éthique de l’institution a approuvé l’étude (CAAE: 68161417.0.000.5416).
    2. Détachement de S. mutans après adhérence au film salivaire et glucanes traités avec des extraits sélectionnés
      1. Cultivez le micro-organisme jusqu’à la phase de croissance mi-bûche, comme décrit ci-dessus.
      2. Lorsque les cultures ont atteint l’O.D. désiré, centrifugeuse (4000 × g pendant 20 min), laver avec 0,89% de solution NaCl et résuser la pastille avec 0,89% NaCl en utilisant le même volume initial du milieu de culture.
      3. Si vous utilisez un streptocoque, comme S. mutans,soniquez les cultures avec une sonde pour déchaîner (30 s, 7 W, trois fois). Si vous utilisez un seul organisme cellulaire, cette étape peut être ignorée.
      4. Vérifiez l’O.D. (540 nm) pour ajuster la concentration à 2 x 106 CFU/mL.
    3. Adhérence de S. mutans au pellicle salivaire (sHA) et détachement des cellules adhérentes
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 5.
      1. Obtenez les échantillons de sHA tels que décrits ci-dessus.
      2. Ajoutez un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) de traitements sélectionnés (à la concentration d’essai; par exemple, 0,5 mg/mL) ou des contrôles dans des microtubes contenant des échantillons de sHA.
      3. Incuber les échantillons de sHA avec des traitements ou des contrôles (30 min, 37 °C, 24 rpm); puis, laver les perles trois fois avec tampon AB (contenant PMSF et NaN3).
      4. Ajouter la culture micro-organisme. Dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL de culture S. mutans (2 x 106 CFU/mL) à chaque microtube.
      5. Incuber (1 h, 37 °C, 24 rpm) puis retirer les cellules non liées en les lavant trois fois avec un tampon AB.
      6. Resuspendez chaque échantillon avec un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 1000 μL) de tampon AB et sonicate avec une sonde (30 s, 7 W).
      7. Utilisez un aliquot de chaque suspension pour une dilution en série décuplée pour déterminer le nombre de colonies viables en placage sur des plaques d’agar spécifiques (48 h, 37 °C, 5 % de CO2). Ensuite, comptez les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.
        REMARQUE : L’étape du sonicate est effectuée pour détacher les cellules adhérés au sHA.
    4. Adhérence de S. mutans à la matrice initiale de glucane(gsHA)et détachement des cellules adhérentes
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 6. L’enzyme GtfB a été purifiée à partir de la culture supernatant Streptococcus milleri KSB8 conçu pour produire GtfB. La purification a été effectuée avec une colonne de chromatographie contenant des perles d’hydroxyapatite utilisant des tampons contenant deux inhibiteurs de protéase (0,1 mM PMSF et 0,02% NaN3)27,28. Ensuite, l’enzyme a été vérifiée sur le gel d’acrylamide (SDS-PAGE) et tachée de nitrate d’argent. Aliquots de l’enzyme ont été stockés à -80 °C jusqu’à utilisation.
      1. Obtenez les échantillons de sHA tels que décrits ci-dessus. Ensuite, ajoutez un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) d’enzyme GtfB à chaque tube et incubons dans un homogénéisant (40 min, 37 °C, 24 rpm). Ensuite, lavez trois fois avec tampon AB (contenant PMSF et NaN3).
      2. Ajouter un aliquot (p. ex., 500 μL) de substrat saccharose (100 mmol de saccharose) contenant les traitements (ou contrôles à la concentration d’essai, p. ex., 0,5 mg/mL) à chaque microtube.
      3. Incuber les échantillons dans un homogénéisateur (4 h, 37 °C, 24 rpm). Ensuite, effectuez trois lavages avec tampon AB (avec PMSF et NaN3) pour enlever les traitements et l’excès de saccharose non incorporés dans les glucanes synthétisés (échantillons de gsHA).
      4. Ajouter un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) de S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) à chaque microtube.
      5. Incuber dans un homogénéiseur (1 h, 37 °C, 24 rpm) et laver trois fois avec un tampon AB (avec PMSF et NaN3) pour enlever les cellules non liées.
      6. Resuspendez chaque échantillon avec un aliquot (p. ex., 1 000 μL) de tampon AB (avec PMSF et NaN3) et soniquez avec une sonde pour détacher les cellules adhérés à la gsHA (30 s, 7 W).
      7. Utilisez un aliquot de chaque suspension pour une dilution en série décuplée pour déterminer le nombre de colonies viables en placage sur des plaques d’agar spécifiques (48 h, 37 °C, 5 % de CO2). Ensuite, comptez les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.

4. Analyse des données biologiques

  1. Données Bioassays
    1. Entrez des données brutes pour les bioassays dans une feuille de calcul. Calculez le journal de l’inhibition de croissance microbienne par chaque traitement comme (ACFU/mL des traitements + 1) x log10. Ensuite, calculer le pourcentage de journal de l’inhibition de la croissance microbienne, par rapport au contrôle du véhicule à l’aide (Unlog10 CFU / mLde traitement / moyenne Alog10 CFU / mL de contrôle du véhicule) x 100%.
    2. O.D. correct des cultures planctoniques et de la biomasse traitées par des traitements (groupes traités ce et CEF) et par contrôle des véhicules (contrôle négatif). Pour la correction, soustrayez l’absorption des puits traités de celui obtenu dans les puits contenant seulement le milieu de culture (Ablank) comme (Agroupes traités moyen /Un milieude contrôle négatif)x 100%.
    3. Après cette correction, calculer le pourcentage de l’inhibition de la biomasse, par rapport au contrôle du véhicule comme (Atraité biomasse/ moyenne Un contrôledu véhicule) x 100%.
    4. Soumettez les données brutes générées pour l’analyse statistique des données à l’aide de logiciels spécifiques.
      REMARQUE : L’interprétation de l’efficacité d’un traitement donné est déterminée à l’aide de points d’arrêt, tels quel’IC 50/IC90. Ces valeurs sont définies comme la concentration minimale d’un traitement capable d’inhiber 50 % et 90 %, respectivement, de croissance bactérienne ou de formation debiofilms 24. Ces paramètres peuvent aider à interpréter les données et fournir une base pour la sélection des composés avec une meilleureactivité 13,29.

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Résultats

Nous fournissons un exemple d’utilisation d’une approche systématique pour examiner l’activité biologique des extraits et des fractions de plantes afin d’identifier des molécules potentiellement actives pour de nouvelles thérapies anti-caries possibles : activités antimicrobiennes et antibiofilms de Casearia sylvestris extraits de biomes brésiliens distincts contre streptocoques mutans et candida albicans13.

Fond
Les intera...

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Discussion

Les principaux défis liés au travail avec des extraits bruts naturels comprennent leur composition complexe et les insuffisances des études classiques d’isolement bioguidé. Bien que ce processus soit lent, il est efficace et a mené à des résultats majeurs dans la recherche sur les PN. Pour rationaliser, des études axées sur la hiérarchisation sont nécessaires pour rationaliser. Ainsi, l’utilisation d’approches modernes de profilage chimique pour l’analyse de l’EC et la redondant avant l’isolement sont importantes pour ca...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Nous exprimons notre gratitude à Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) de l’Institut de chimie de l’UNESP, Araraquara/SP pour avoir fourni les laboratoires pour la préparation du matériel végétal. Nous remercions également le Laboratoire de microbiologie appliquée du Département des matériaux dentaires et de la prosthodontie, l’UNESP, Araraquara/SP. Cette recherche a été appuyée par une subvention de recherche de la São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 à l’AJC) et des bourses d’études ainsi que des fonds généraux (FAPESP #2017/07408-6 et FAPESP #2019/23175-7 au SMR; #2011/21440-3 et #2012/21921-4 au PCPB). Le Conseil national du développement scientifique et technologique, en association avec la FAPESP, a apporté un soutien supplémentaire (INCT CNPq #465637/2014-0 et FAPESP #2014/50926-0 à l’AJC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microplaques à 96 puits  ;KasviFond
Charbon actifLABSYNTHÉtape de nettoyage et/ou de fractionnement
m, 100 ;
DiméthylsulfoxydeSigma-AldrichSolution pour véhicule
Lecteur de plaques ELISABiochrom Ez
EthanolJ. T. BakerPour les étapes d’extraction et de fractionnement, et la composition
ÉthanolSigma-AldrichSolution pour véhicule
Acétate d’éthyleJ. T. BakerÉtape de fractionnement
LogicielGraphPad La JollaGraphPad Prism7
HexaneJ. T. BakerÉtape de fractionnement
IncubateurThermo Scientific
IsopropanolJ. T. BakerPour l’étape
Lyophiliseur (un lyophilisateur)SavantModulyo
Nylon MilliporeLAC0.22 µ ; Agitateur orbital m x 13 mm
QuimisModèle G816&thinsp ; M20
Cartouche d’extraction en phase solidepolyamide Macherey-NagelÉtape de nettoyage et/ou de fractionnement
63&thinsp ; &mu ; m, 60&thinsp ;  ;
Chlorure de sodium (NaCl)Synth0,89 % dans l’eau Cartouches d’extraction
phase solide (SPE)Macherey-NagelÉtape de nettoyage et/ou de fractionnement
Difco
plat Broyeur analytique Ika LabortechniK Modèle A11 Basic Plaques de gélose au sang Laborclin Colonne chromatographique C18 Phenomenex Kinetex 150 × ; 2,1 mm, 2,6 & micro ;de la phase mobiled’extraction Gel de silice Merck 40&ndash ; en Tryptone Difco UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS Bain à ultrasons UNIQUE Modèle USC 2800 Extrait de levure

Références

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