Method Article

Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

DOI:

10.3791/61778

⸱

November 9th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University

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Erratum Notice

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Summary

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Les interactions neurone-gliale dans la neurodégénérescence ne sont pas bien comprises en raison d’outils et de méthodes inadéquats. Ici, nous décrivons des protocoles optimisés pour obtenir des neurones induits, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines et fournissons des exemples des valeurs de ces méthodes dans la compréhension des contributions spécifiques au type cellulaire dans la maladie d’Alzheimer.

Abstract

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Dans la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres troubles neurodégénératifs, l’insuffisance oligodendrogliale est une caractéristique pathologique précoce commune, mais la façon dont elle contribue au développement et à la progression de la maladie, en particulier dans la matière grise du cerveau, reste largement inconnue. Le dysfonctionnement des cellules de la lignée oligodendrocytaire est caractérisé par des déficiences dans la myélinisation et une altération de l’auto-renouvellement des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ces deux défauts sont causés au moins en partie par la perturbation des interactions entre les neurones et les oligodendrocytes tout au long de l’accumulation de la pathologie. Les OPC donnent naissance à des oligodendrocytes myélinisants au cours du développement du SNC. Dans le cortex cérébral mature, les OPC sont les principales cellules prolifératives (comprenant ~ 5% du total des cellules cérébrales) et contrôlent la formation de nouvelles myélines d’une manière dépendante de l’activité neuronale. De telles communications neurone-oligodendrocyte sont significativement sous-étudiées, en particulier dans le contexte de maladies neurodégénératives telles que la MA, en raison du manque d’outils appropriés. Au cours des dernières années, notre groupe et d’autres ont fait des progrès significatifs pour améliorer les protocoles actuellement disponibles pour générer des neurones fonctionnels et des oligodendrocytes individuellement à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Dans ce manuscrit, nous décrivons nos procédures optimisées, y compris la mise en place d’un système de co-culture pour modéliser les connexions neurone-oligodendrocytes. Nos résultats illustratifs suggèrent une contribution inattendue des OPC / oligodendrocytes à l’amylose cérébrale et à l’intégrité des synapses et soulignent l’utilité de cette méthodologie pour la recherche sur la MA. Cette approche réductionniste est un outil puissant pour disséquer les interactions hétérocellulaires spécifiques à partir de la complexité inhérente à l’intérieur du cerveau. Les protocoles que nous décrivons ici devraient faciliter les études futures sur les défauts oligodendrogliales dans la pathogenèse de la neurodégénérescence.

Introduction

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Les cellules de la lignée oligodendrocytes, y compris les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), les oligodendrocytes myélinisants et les types transitoires intermédiaires, constituent un groupe important de cellules cérébrales humaines1 qui participent activement à de nombreuses fonctions essentielles au bon fonctionnement et au maintien de notre système nerveux central tout au long du développement neuronal et du vieillissement 2,3,4 . Alors que les oligodendrocytes sont bien connus pour produire de la myéline pour faciliter la transmission de l’activité neuronale et soutenir la santé axonale dans la substance blanche, les OPC sont abondants (~5%) dans la matière grise où la myélinisation est rare et remplissent des fonctions de signalisation dépendantes de l’activité pour régir le comportement d’apprentissage et la formation de la mémoire 5,6,7,8 . Le fonctionnement et le dysfonctionnement des cellules oligodendrogliales dans la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres affections neurodégénératives associées à l’âge ont été sous-étudiés9. Les insuffisances d’un système modèle approprié et les lacunes dans les connaissances générales pour guider une voie expérimentale sont les principales raisons de cet écart.

À la lumière des dernières percées dans la dérivation de cellules cérébrales humaines à partir de cellules souches pluripotentes, y compris les cellules souches embryonnaires (SE) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS), de tels modèles cellulaires, associés à des outils modernes d’édition de gènes, sont apparus comme des outils robustes pour gérer le lien complexe des interactions cellulaires dans le cerveau et sont capables de démontrer des manifestations de maladies spécifiques à l’homme10, 11. Étant donné que les types individuels de cellules cérébrales peuvent présenter des effets distincts et même contradictoires face aux mêmes conditions favorisant la MA12,13, cette méthodologie de cellules souches offre de manière unique des informations spécifiques au type de cellules qui ont été précédemment manquées à l’aide de modèles établis in vivo ou in vitro qui ne fournissent que des lectures agrégées à partir de collections de types de cellules cérébrales. Au cours de la dernière décennie, un bon nombre de protocoles fiables ont été développés pour générer des neurones humains à partir de la transdifférenciation des cellules ES/iPS ou de la conversion directe à partir d’autres types de cellules différenciées en phase terminale (p. ex. fibroblastes)14,15. En particulier, l’application de facteurs de transcription neurogènes clés (p. ex. neurogénine 2, Ngn2)16 aux cellules souches pluripotentes humaines peut générer une population homogène de types de cellules neuronales bien caractérisées pour des cultures pures sans qu’il soit nécessaire de coculturer avec des cellules gliales12,17,18. Pour les oligodendrocytes humains induits, il existe quelques protocoles publiés qui peuvent générer des cellules fonctionnelles ressemblant fortement à leurs homologues primaires, avec un large éventail d’efficacité et de demande en temps et en ressources 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . À ce jour, aucun de ces protocoles n’a été appliqué pour étudier comment les cellules oligodendrogliales répondent à la pathogenèse de la MA et l’affectent.

Ici, nous décrivons nos protocoles améliorés pour les cultures uniques et mixtes de neurones induits humains (iNs) et d’OPC / oligodendrocytes (iOPC / iOLs). Le protocole iN décrit ici est basé sur l’approche Ngn2largement utilisée 16, et a la particularité supplémentaire d’être exempt de glie. Les iNs résultants sont homogènes et ressemblent fortement aux neurones excitateurs de la couche corticale 2/3, avec une morphologie pyramidale caractéristique, un modèle d’expression génique et des caractéristiques électrophysiologiques17,18 (Figure 1). Pour surmonter certains des obstacles fondamentaux à la différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes, nous avons développé une méthode simple et efficace de prétraitement à faible dose de diméthylsulfoxyde (DMSO)29,30, et rapporté une propension accrue des cellules ES/iPS humaines à se différencier en iOPC et iOLs31, sur la base d’un protocole largement adapté par Douvaras et Fossati 32 . Nous avons encore simplifié le protocole et incorporé un composé robuste favorisant la différenciation, la clémastine 7,33,34, pour accélérer le processus de maturation oligodendrogiale. En conséquence (Figure 2), les OPCi peuvent être générés en 2 semaines (~95% positifs pour le marqueur O4) et les iOLs en quatre semaines (exprimant les marqueurs matures MBP et PLP1). Fait intéressant, nous avons constaté que les CPi seuls sécrètent une quantité remarquable de β amyloïde (Aβ), ce qui correspond aux données transcriptomiques indépendantes montrant l’expression abondante de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et de la protéase de traitement β-sécrétase (BACE1) dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire35,36. De plus, notre système de co-culture iN-iOPC favorise l’engainage des axones par des processus iOL MBP-positifs et fournit un soutien significatif pour la formation de synapses (Figure 3). Ainsi, les protocoles que nous avons détaillés ci-dessous présentent des avantages techniques et biologiques par rapport aux méthodes de co-culture neurone-oligodendroglie précédemment cataloguées, et sont prometteurs pour une meilleure modélisation de la neurodégénérescence dans la MA.

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Protocol

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1. Induction de neurones humains à partir de cellules souches pluripotentes humaines

  1. Préparation du lentivirus (~5 jours, protocole détaillé tel que décrit précédemment16)
    1. Plaque ~1 million de cellules HEK293T chaque flacon T75, pour les avoir ~40% confluent lors de la transfection. Transfectez-les avec des plasmides exprimant le gène Ngn2 inductible par la tétracycline et résistant à la puromycine (PuroR; sous le même contrôle promoteur TetO), rtTA et les trois plasmides auxiliaires pRSV-REV, pMDLg / pRRE et VSV-G (12 μg d’ADN vecteur lentiviral et 6 μg de chacun de l’ADN plasmidique auxiliaire). Préparer au moins trois flacons par préparation de lentivirus. Utilisez l’IPE pour la transfection en suivant les instructions du fabricant. Changez le support après 16 h et jetez-le.
    2. Récolter les particules virales libérées en collectant des milieux de culture tous les jours et les remplacer par des milieux frais pendant 3 jours. Mettez en commun les milieux collectés contenant des particules virales pour la purification. Filtrer le virus à travers un filtre de 0,22 μm et centrifuger à 49 000 x g pendant 90 min. Remettez la pastille en suspension dans le volume approprié de PBS-glucose (~150 μL).
  2. Induction neuronale (~5 jours)
    REMARQUE : Ce protocole d’induction (Figure 1A ; organigramme) est très efficace pour les cellules iPS et ES de pluripotence validée (qui peut être dosée par coloration immunohistochimique de marqueurs de pluripotence bien caractérisés ; Figure 1B).
    1. Utiliser des cellules SE humaines H1 disponibles dans le commerce au passage de 52 (voir le tableau des matériaux). Culture des cellules sur une solution matricielle extracellulaire recouverte de plaques à 6 puits (~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits; voir le tableau des matériaux) en utilisant un milieu de maintenance cellulaire ES (voir le tableau des matériaux) et incuber les plaques à 37 °C avec 5% de CO2.
    2. Le jour -2, détacher les cellules ES (80 % confluentes) avec 1 mL de solution de décollement de cellules (voir le tableau des matériaux) et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Transférer les cellules dans un tube; laver le puits avec 2 mL de média et mélanger dans le même tube. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, remettre en suspension la pastille dans un milieu et plaquer les cellules sur des plaques matricielles à 6 puits à la densité de semis de 1 x 105 cellules par puits.
    3. Au jour -1, ajouter les lentivirus exprimant Ngn2 plus PuroR et rtTA avec du polybrene (8 μg/ml) aux cellules ES dans un milieu d’entretien des cellules ES fraîches (voir le tableau des matériaux). La quantité exacte de virus doit être déterminée par les titres réels ou le titrage. Nous ajoutons généralement 5 μL de chaque virus par puits dans une plaque de 6 puits.
    4. Le jour 0, ajouter de la doxycycline (2 μg/mL, pour activer l’expression de Ngn2) dans un milieu DMEM-F12 avec supplément de N2 sans morphogènes.
    5. Le jour 1, ajouter la puromycine dans un milieu frais de DMEM-F12 plus N2 et de la doxycycline, jusqu’à la concentration finale de 1 μg/mL de milieu. Sélectionnez les cellules transduites dans Puromycin pendant au moins 24 heures. Une concentration plus élevée de puromycine (jusqu’à 5 μg/mL) et une période de sélection plus longue (jusqu’à 48 h) peuvent être nécessaires pour éliminer adéquatement les cellules sous-transduites si le titre du virus est faible.
    6. Le jour 2, détachez les neurones différenciateurs avec une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux), et replaquez-les sur des plaques de 24 puits (entre 80 000 et 200 000 cellules/puits) recouvertes d’une solution matricielle (voir le tableau des matériaux), et maintenez-les dans un milieu NBA/B27 sans doxycycline. La densité de semis est critique.
    7. À ce stade, les neurones détachés peuvent être congelés dans un milieu de congélation commercial spécialisé (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Les neurones purs peuvent être plaqués en tenant compte de la mort cellulaire typique de ~15% à 20% après le dégel, cultivés seuls ou co-cultivés avec d’autres types de cellules cérébrales (voir l’étape 3.2.3. pour la co-culture avec les OPC).
    8. Culture d’iNs purs sur les plaques recouvertes de solutions à base de matrice extracellulaire selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). La morphologie pyramidale caractéristique devrait être apparente au jour 4 (et au jour 6; Figure 1C). La formation de synapses peut être détectée dès le jour 14 au jour 16 et est proéminente au jour 24 par coloration immunohistochimique avec des marqueurs pré- et post-synaptiques standard. (Figure 1D; étiquetée avec le marqueur pré-synaptique Synapsin 1 et le marqueur dendritique Map2).

2. Induction de cellules précurseurs d’oligodendrocytes humains (OPC) à partir de cellules souches pluripotentes et maturation des oligodendrocytes

  1. Génération de cellules progénitrices neurales (NPC) : protocole monocouche (~7 jours). Voir la figure 2A pour l’organigramme.
    1. Cultiver les cellules ES humaines H1 comme décrit précédemment (voir étape 1.2.1.) et les transdifférencier en cellules progénitrices neurales (NPC) par une approche établie appelée SMADi double, avec des inhibiteurs de petites molécules pour plusieurs voies de signalisation. Ici, nous utilisons un kit commercial largement accepté et suivons le protocole monocouche fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux).
    2. Au jour -1, plaquer 0,5–1 x 106 cellules par puits dans une plaque de 6 puits recouverte d’une solution matricielle à facteur de croissance réduit (voir le tableau des matériaux; ~0,5 mg de solution matricielle par plaque de 6 puits) avec un milieu de maintenance des cellules ES (voir le tableau des matériaux). Cette solution matricielle à facteur de croissance réduit est utilisée pour enduire toutes les plaques qui seront utilisées dans les étapes suivantes.
    3. Au jour 0, traiter les cellules pendant 24 heures avec un milieu d’entretien des cellules ES (voir le tableau des matériaux) complété par 2% de DMSO.
    4. Du 1er au 6e jour, remplacer le milieu complet par un milieu d’induction neuronale chaud (37 °C) contenant les inhibiteurs de la SMAD de la trousse commerciale (voir le tableau des matières). Si les cellules se divisent et atteignent la confluence avant le jour 7, les faire passer à la densité d’ensemencement de 0,5–1 x 106, comme décrit précédemment à l’étape 2.1.2.
    5. Le jour 7, passage des PNJ à l’aide d’une solution de détachement de cellule (voir le tableau des matériaux) et d’une plaque à une densité d’ensemencement de 1–2 x 105 cellules/puits d’une plaque de 24 puits.
    6. Tester l’efficacité de la différenciation par coloration immunohistochimique (IHC) pour l’absence de marqueur de pluripotence, OCT4 par exemple, et la présence de marqueurs NPC tels que PAX6, Nestin et Sox1.
    7. À ce stade, les PNJ détachés peuvent être congelés dans les milieux de congélation commerciaux spécialisés (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Après le gel et le dégel pour une fois, les PNJ conservent toujours la multipotence pour donner naissance à des neurones, des astrocytes et des OPC avec des protocoles fiables.
  2. Génération de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) (~7 jours). Veuillez consulter la figure 2A pour l’organigramme.
    1. Le jour 7, faire passer les PNJ à l’aide d’une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux) et les plaquer à une densité d’ensemencement de 1–2 x 105 cellules par puits dans une plaque de 24 puits dans un milieu d’induction neurale chaud (37 °C) plus inhibiteurs de SMAD de la trousse commerciale (voir le tableau des matériaux).
    2. Le jour 8, préparer une solution de DMSO à 1% dans le milieu de différenciation OPC et traiter les NPC plaqués pendant 24 h. Le milieu de différenciation OPC est composé de : milieu DMEM/F12, supplément de N2 à 1 %, supplément de B27 à 1 %, FGFb à 20 ng/mL, SAG à 1 μM, PDGF-AA à 10 ng/mL (voir tableau des matériaux).
    3. Le jour 9, remplacez le support par un nouveau support de différenciation OPC sans DMSO. Nourrissez les cellules tous les deux jours jusqu’au jour 15. Si les cellules atteignent la confluence avant le jour 15, les faire passer à la densité d’ensemencement de 1–2 x 105 cellules par puits, comme décrit à l’étape 2.2.1.
    4. Au jour 14, plaquer les OPC dans le milieu de différenciation OPC à une densité de 1–2 x 105 cellules/puits dans une plaque de 24 puits.
    5. À ce stade (jour 15), les cellules d’essai pour détecter la présence de marqueurs spécifiques de l’OPC par coloration IHC ou qPCR (p. ex. O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Figure 2B) et pour l’absence de marqueurs PNJ (Pax6 ou Nestin; Figure 2D). Nous détectons généralement l’immunoréactivité O4 dans plus de 95% des cellules au jour 15. D’une importance particulière pour la maladie d’Alzheimer, l’expression de l’APP (protéine précurseur de l’amyloïde), de BACE1 (la protéase de traitement β-secréatase 1) et du peptide amyloïde-β (Aβ) est abondante dans les OPC (Figure 2F).
  3. Maturation des oligodendrocytes (OL) (~7–20 jours)
    1. Au jour 15, remplacer le milieu par un milieu de maturation OL : milieu neurobasal-A, supplément de B27 à 2 %, AMPc 1 μM, triiodothyronine T3 à 200 ng/mL et clémastine de 1 μM (voir le tableau des matières). Changez le support tous les deux jours ou tous les jours, si nécessaire.
    2. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, diviser dans un rapport de 1: 3 jusqu’à 2 passages ou jusqu’à ce que la division cellulaire ralentisse considérablement. Si les OPC se divisent trop rapidement et atteignent leur confluence en moins de 3 jours, ajouter de l’Ara-C (voir le tableau des matières) à une concentration de 2 à 5 μM pendant 1 à 3 jours. La prolifération active indique une efficacité de maturation réduite.
    3. Examiner l’efficacité de la maturation oligodendrogliale en évaluant l’expression des marqueurs OL, p. ex. CLDN11, PLP1, MBP par qPCR, coloration IHC ou immunoblotting. La morphologie caractéristique des structures très complexes (figure 2C) et l’expression des marqueurs de LO (figure 2E) devraient être facilement détectées au jour 28.

3. Co-culture de neurones induits par l’homme (iNs) et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPCi)

  1. placage CPPO (~3 jours)
    1. Plaque iOPC au jour 14 à une densité de 1 x 105 cellules par puits dans une plaque de 24 puits (comme décrit ci-dessus à l’étape 2.2.4.) dans un milieu de différenciation OPC (comme décrit à l’étape 2.2.2.).
  2. Mise en place de la co-culture iN-iOPC
    1. Au jour 15, détacher les neurones humains induits à l’étape du jour 2 après la sélection de la puromycine (comme décrit à l’étape 1.2.6.) avec une solution de décollement cellulaire (voir le tableau des matériaux).
    2. Ajouter des neurones sur les OPC en culture, en plaquant à la densité d’ensemencement de 2 x 105 cellules par puits dans la plaque de 24 puits avec des OPC en croissance (à partir de l’étape 3.1.1). Utilisez le milieu de coculture contenant du milieu neurobasal-A, un supplément de B27 à 2 % et 100 ng/mL de triiodothyronine T3. Changez le support le lendemain, puis tous les deux jours par la suite. Si les OPC prolifèrent trop vite et atteignent leur confluence en moins de 3 jours, ajouter de l’Ara-C à une concentration de 2 à 5 μM. Une image représentative des iNs et des iOPC cultivés en co-culture après 7 jours de neurones est montrée à la figure 3A.
    3. Utiliser des neurones congelés préparés comme décrit ci-dessus à l’étape 1.2.7 pour la co-culture avec des OPC. Congeler et décongeler les neurones sur plaque à une densité plus élevée de 3 x 105 cellules par puits.
    4. Après les jours 14 à 16 dans les co-cultures, la formation de synapses dans les iNs peut être observée par coloration IHC des marqueurs pré- et post-synaptiques, et au jour 21, la ponctuation synaptique devrait être abondante (Figure 3C) et les activités neuronales peuvent être enregistrées de manière fiable.
    5. À partir du jour 21, cellules d’essai pour les marqueurs spécifiques aux LO (par exemple, MBP et PLP1). Au jour 28, nous observons normalement le phénomène d’engainage des axones iN par des processus iOL, marqués par coloration IHC pour des marqueurs spécifiques (Figure 3B ; neurofilament NF pour les axones iN et MBP pour les processus iOPC).

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Results

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Génération directe de neurones induits par l’homme à partir de cellules souches pluripotentes humaines
Il est très important que les cellules souches pluripotentes humaines de départ présentent un degré élevé de pluripotence pour une génération réussie d’iNs ou d’iOPCs/iOLs. Par conséquent, les cellules doivent être colorées pour des marqueurs spécifiques, tels que Oct4 et SOX2, avant de commencer l’un ou l’autre des protocoles d’induction décrits dans le présent manuscrit (Figure...

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Discussion

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En plus du soutien physique et métabolique pour stabiliser les structures synaptiques et faciliter la conduction du signal salatoire par myélinisation, les cellules de la lignée oligodendrocytaire peuvent façonner le schéma d’activité neuronale via des diaphonies rapides et dynamiques avec les neurones 5,6,7. Alors que dans la pathologie de la MA, les réponses oligodendrogliales étaient initialement considérées comme simplement ...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (R00 AG054616 à Y.A.H. et T32 GM136566 à K.C.), de la Stanford University School of Medicine et d’une bourse Siebel (attribuée à S.C.). Y.A.H. est professeur translationnel GFL du Center for Translational Neuroscience du Brown Institute for Translational Sciences.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseSTEMCELL Technologies7920
B27 supplémentThermoFisher17504044
bFGFThermoFisherPHG 0266
cAMPMilliporeSigmaA9501
ClemastineMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 mediumSTEMCELL Technologies36254
DMSOThermoFisherD12345
DoxycyclineMilliporeSigmaD3072
Sérum de veau fœtalScienCell10
H1 cellules ES humainesWiCellWA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusSTEMCELL Technologies5825
Supplément N2ThermoFisher17502001
Neurobasal A moyenThermoFisher10888-022
Acides aminés non essentielsThermoFisher11140-050
PDGF-AAR& D Systems221-AA-010
PEIVWR71002-812
pMDLg/pRREAddgene12251
PolybreneMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgene12253
PuromycinThermoFisherA1113803
ROCK Inhibiteur Y-27632STEMCELL Technologies72302
SAGTocris4366
STEMdiff Neural Progenitor FreezingMedia STEMCELL Technologies5838
STEMdiff SMADi NeuralInduction Kit STEMCELL Technologies8581
T3 triiodothyronineMilliporeSigmaT6397
Tempo-iOlogo : OPCs humains dérivés d’iPSCTempo BioScienceSKU102
TetO-NG2-PuroAddgene52047
VSV-GAddgene12259

References

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  33. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
  34. Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
  35. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
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  37. Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

IN-OPC co-culture results; neurofilament staining, synaptic density diagram, marker expression graph.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Microscopy analysis, astrocyte markers, iOPC-neuron interaction, fluorescence labeling.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

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