Article de méthode

Uvéite auto-immune expérimentale : un modèle murin inflammatoire intraoculaire

DOI :

10.3791/61832

⸱

12 janvier 2022

 ,  ,  , 
1UCL Institute of Ophthalmology, University College London

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce rapport, nous présentons un protocole qui permet à l’investigateur de générer un modèle murin d’uvéite intraoculaire. Plus communément appelé uvéite auto-immune expérimentale (EAU), ce modèle établi englobe de nombreux aspects de la maladie humaine. Ici, nous décrirons comment induire et surveiller la progression de la maladie à l’aide de plusieurs lectures.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’uvéite auto-immune expérimentale (EAU) est provoquée par des cellules immunitaires répondant à des auto-antigènes. De nombreuses caractéristiques de ce modèle de maladie inflammatoire intraoculaire non infectieuse récapitulent le phénotype clinique de l’uvéite postérieure chez l’homme. L’EAU a été utilisée de manière fiable pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements inflammatoires, leur mode d’action et pour étudier plus avant les mécanismes qui sous-tendent la progression de la maladie des troubles intraoculaires. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur l’induction d’EAU chez la souris C57BL / 6J - l’organisme modèle le plus largement utilisé avec une sensibilité à cette maladie. L’évaluation clinique de la gravité et de la progression de la maladie sera démontrée à l’aide de la fundoscopie, de l’examen histologique et de l’angiographie à la fluorescéine. La procédure d’induction implique l’injection sous-cutanée d’une émulsion contenant un peptide (IRBP1-20) de la protéine de liaison au rétinoïde interphotorécepteur oculaire (également connue sous le nom de protéine de liaison au rétinol 3), adjuvant de Freund complet (CFA) et complétée par Mycobacterium tuberculosis. L’injection de cette émulsion visqueuse sur la nuque est suivie d’une seule injection intrapéritonéale de toxine Bordetella pertussis . Au début des symptômes (jours 12-14) et sous anesthésie générale, des images fundoscopiques sont prises pour évaluer la progression de la maladie par l’examen clinique. Ces données peuvent être directement comparées à celles des points temporels ultérieurs et du pic de la maladie (jours 20-22) avec des différences analysées. En même temps, ce protocole permet à l’investigateur d’évaluer les différences potentielles de perméabilité et de dommages des vaisseaux à l’aide de l’angiographie à la fluorescéine. L’EAU peut être induite dans d’autres souches de souris - à la fois de type sauvage ou génétiquement modifié - et combinée à de nouvelles thérapies offrant une flexibilité pour étudier l’efficacité des médicaments et / ou les mécanismes de la maladie.

Introduction

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Ce protocole démontrera comment induire l’uvéite auto-immune expérimentale (EAU) chez la souris C57BL/6J par une injection sous-cutanée unique d’un antigène rétinien dans un adjuvant émulsionné. Les méthodes de surveillance et d’évaluation de la progression de la maladie seront détaillées au moyen de l’imagerie fundoscopique et de l’examen histologique, avec des paramètres de mesure décrits à l’intérieur. En outre, l’angiographie à la fluorescéine, une technique d’examen de la structure et de la perméabilité des vaisseaux sanguins de la rétine, sera discutée.

Ce modèle EAU récapitule les caractéristiques centrales de l’uvéite postérieure non infectieuse chez l’homme en ce qui concerne les caractéristiques clinicopathologiques et les mécanismes cellulaires et moléculaires de base qui conduisent la maladie. L’EAU est médiée par des sous-ensembles Th1 et/ou Th17 de lymphocytes CD4+T autoréactifs, comme le montrent les expériences de transfert adoptif et chez des souris appauvries en IFNγ1. Une grande partie de notre compréhension des rôles potentiels de ces cellules dans l’uvéite provient de l’étude de l’EAU2 où les cellules Th1 et Th17 sont détectées dans les tissus rétiniens3. Souvent, l’EAU est utilisée comme modèle préclinique pour évaluer l’utilité de nouvelles thérapies dans l’atténuation de la maladie. Les approches thérapeutiques qui ont réussi à moduler la maladie EAU ont montré une certaine efficacité en clinique et ont atteint le statut approuvé par la FDA. Des exemples de ceux-ci sont des groupes de médicaments immunorégulateurs tels que les thérapies ciblant les lymphocytes T: cyclosporine, FK-506 et rapamycine 4,5,6. Récemment, des interventions ciblant de nouvelles voies ont également été explorées dans ce modèle pour étudier à la fois le mécanisme et l’effet sur l’issue de la maladie. Il s’agit notamment de cibler la régulation transcriptionnelle par le lecteur de chromatine Bromodomain Extra-Terminal (BET) protéines et inhibiteurs de P-TEFb3. De plus, des approches plus conventionnelles telles qu’un inhibiteur de VLA-4 ont récemment démontré la suppression dans l’EAU via la modulation des lymphocytes T CD4+ effecteurs7. En outre, le ciblage des cellules Th17 avec TMP778, un agoniste inverse RORγt, s’est également avéré supprimer de manière significative l’EAU8. De plus, ce modèle offre la possibilité d’étudier l’inflammation auto-immune chronique dans la rétine et les mécanismes sous-jacents qui l’accompagnent tels que l’amorçage des lymphocytes.

Les résultats primaires des études précliniques sur l’eau sont l’évaluation clinique par imagerie par fundoscopie rétinienne et, moins fréquemment, par l’évaluation de l’intégrité rétinienne par tomographie par cohérence optique (OCT). L’évaluation histopathologique rétinienne et l’immunophénotypage des cellules rétiniennes par cytométrie de flux sont ensuite entrepris à la fin. Fundoscopy est un système d’imagerie en direct facile à utiliser qui permet une évaluation clinique rapide et reproductible de l’ensemble de la rétine. Pour les évaluations immunohistochimiques, les techniques sont basées sur la préparation de coupes rétiniennes qui nous permettent d’étudier l’architecture tissulaire pour le degré d’inflammation et de dommages structurels9. Les critères d’évaluation et les systèmes de notation conventionnels, pour toutes les techniques utilisées, seront décrits dans ce protocole. L’étendue des dommages enregistrés à l’aide de l’imagerie fundoscopique est souvent étroitement corrélée aux changements histologiques. Cette double approche de surveillance et d’évaluation de la gravité de la maladie offre une plus grande sensibilité et des résultats de mesure plus fiables.

L’EAU est un modèle bien établi et couramment utilisé pour les essais précliniques et l’investigation des maladies oculaires à médiation immunitaire. Ce modèle est fiable et reproductible avec >95% d’incidence de la maladie et génère des données complètes qui peuvent être utilisées pour valider ou répudier de nouvelles thérapies pour le traitement de la maladie inflammatoire intraoculaire qui représente une cause majeure de cécité en âge de travailler dans le monde10.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la loi britannique sur les animaux (procédures scientifiques) de 1986 et aux directives institutionnelles de l’Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).

1. Boîtier de souris C57BL/6J

  1. Souris domestiques dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes, sur un cycle lumière-obscurité de 12 heures et nourriture et eau disponibles ad libitum.
  2. Effectuer toutes les expériences sur les femelles adultes C57BL / 6J (les femmes sont choisies de préférence car il y a une incidence de femmes par rapport aux hommes de 1,4 à 1 chez les patients atteints d’uvéite). Randomiser les souris femelles C57BL/6J âgées de 6 à 8 semaines en fonction du poids et de l’âge. Hébergez les souris dans des cages ventilées individuellement (IVC) en groupes de 5 à 6 souris par cage.

2. Immunisation des souris C57BL/6

  1. IRBP1-20 - Préparation de l’émulsion CFA
    NOTE: La préparation de l’émulsion est essentielle à la reproductibilité et à l’incidence de la maladie; En tant que tel, tous les efforts doivent être faits pour maintenir la cohérence tout au long du processus de préparation et entre les expériences. Lors de la préparation de l’émulsion, la perte doit être prise en compte dans les calculs de tous les réactifs au préalable. Cette perte peut être d’environ 1,5 fois (ou 50 % de plus du volume préparé), en fonction du nombre de souris prévues pour la vaccination. Veuillez consulter l’exemple suivant ci-dessous. Pour immuniser 10 souris, préparez 15 souris et utilisez 400 μg (peptide pour 20 g de souris) x 15 souris = 6 mg. Chaque souris devrait recevoir 200 μL pour l’immunisation (3 mL au total). Le volume final comprend un rapport de 1:1 de solution peptidique et de CFA, donc 1,5 mL de solution peptidique et 1,5 mL de CFA.
    1. Préparer toutes les solutions stériles dans une armoire à flux laminaire en utilisant des techniques aseptiques.
    2. Peser la quantité souhaitée (400 μg par 20 g de souris) de peptide lyophilisé IRBP1-20 humain (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). Dissoudre le peptide dans 100% DMSO. Conserver le stock sous forme lyophilisée à -20 °C.
      REMARQUE: Pour s’assurer que la poudre est complètement dissoute, chaque flocon doit d’abord entrer en contact avec le DMSO et ne montrer aucun signe de solide résiduel. Ajouter PBS en petites portions pour atteindre le volume final. Ne mélangez pas avec un vortex, utilisez plutôt une agitation douce avec une pipette. La concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 1% du volume total de préparation peptidique. La préparation de l’émulsion dans un tube en plastique de 20 ml à fond conique devrait permettre une meilleure accessibilité du DMSO à la poudre lyophilisée.
    3. Ajouter une solution peptidique DMSO-PBS à 1:1 v/v au CFA qui a déjà été complété avec 1,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis , pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg/mL. Ajouter goutte à goutte, en pipetant doucement et fréquemment pour former une émulsion visqueuse et uniformément répartie.
    4. Aérer la solution peptidique et le CFA à l’aide d’une pipette de 1000 μL (réglée à 700 μL pour éviter toute perte supplémentaire) et d’une pipette pour obtenir une consistance épaisse et crémeuse. Cette technique consiste à utiliser la pipette pour aspirer de haut en bas à plusieurs reprises jusqu’à atteindre l’épaisseur désirée. Pour des résultats optimaux, assurez-vous que la solution antigénique et l’adjuvant sont bien mélangés avant l’injection.
  2. Injection intrapéritonéale de toxine coqueluche
    1. Suspendre 1,5 μg de toxine Bordetella pertussis dans 100 μL de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 1% de sérumde souris 11.
    2. Effectuez l’injection intraveineuse avec une seringue stérile et une aiguille 23G.
      REMARQUE : Afin d’éviter de perturber le site d’injection, la toxine de la coqueluche doit être administrée avant l’injection de l’antigène.
    3. Transférer temporairement chaque souris dans une cage séparée pour recevoir une seule injection i.p. de 100 μL de toxine Bordetella pertussis .
  3. Injection sous-cutanée d’émulsion IRBP
    1. Ensuite, injectez l’émulsion IRBP par voie sous-cutanée. Ce processus nécessite deux préposés aux animaux convenablement vêtus d’une protection conforme aux règlements en matière de santé et de sécurité.
    2. Demandez à une personne entraînée de retenir légèrement la souris sur le dessus de la cage dans une position semblable à une peau de peau, le ventre tourné vers le bas, tandis que l’autre personne entraînée pince la peau pour former une structure en forme de tente à l’arrière du cou où l’aiguille peut être insérée pour s’insérer entre le doigt et le pouce.
      ATTENTION : Il y a un risque de blessure par piqûre d’aiguille.
    3. Une fois l’aiguille positionnée, injecter 200 μL de l’émulsion IRBP. Lorsque vous retirez l’aiguille, tournez la tête de l’aiguille pour fermer la peau avant de la retirer et appliquez une pression par la suite sur le site d’injection pour empêcher le reflux de l’émulsion.
      ATTENTION : L’émulsion ne doit pas entrer en contact avec la peau ou le pelage de la souris car cela pourrait provoquer une irritation et, dans les cas plus graves, le développement d’une lésion. Si cela se produit, la zone doit être essuyée immédiatement et soigneusement à l’aide d’éthanol à 70%, puis séchée.
      REMARQUE : Si les ganglions lymphatiques drainants doivent être examinés à la fin de l’étude, le site d’injection sera différent. Dans ce cas, injecter 100 μL des deux côtés du flanc par voie sous-cutanée. Cela générera une réponse plus forte au niveau des ganglions lymphatiques inguinales drainants, qui peuvent être excisés au moment de la récolte. Cependant, si le résultat visé est uniquement de développer l’eau, une seule injection de 200 μL à l’arrière du cou est préférable pour éviter l’inconfort de plusieurs sites d’injection.

3. Évaluation clinique - Examen du fond d’œil de la souris

REMARQUE: La maladie clinique doit être notée à l’aide de l’examen du fond d’œil, via l’imagerie en direct en fond clair à l’aide d’un fundoscope et le logiciel Discover utilisé pour la visualisation.

  1. Au début de la maladie (jours 12-14), sédater les souris sous anesthésie générale en utilisant une combinaison de kétamine (50 mg / mL) et de Domitor (Médétomidine; 1 mg / mL). Diluer 1 partie Domitor; 1,5 partie de kétamine et 2,5 parties d’eau injectable stérile, puis injecter 100 μL par 30 g par voie intrapéritonéale. Utilisez des seringues stériles de 1 ml et des aiguilles 23G pour la combinaison d’anesthésie ci-dessus.
  2. Ensuite, surveillez la souris pour vous assurer que tous les réflexes sont perdus et qu’elle ne répond pas aux stimuli.
  3. Immédiatement après avoir reçu l’injection intraveineuse et pendant que la souris est toujours maintenue dans une peau de peau, appliquer 1% de tropicamide et 2,5% de phényléphrine par voie topique sur chaque œil pour la dilatation de la pupille. Essayez de couvrir complètement la cornée avec les deux solutions dilatantes. Cela peut prendre quelques minutes avant que la pupille soit complètement dilatée.
  4. Ensuite, appliquez généreusement sur l’œil une pommade viscotears et maintenez-la tout au long du processus d’imagerie afin de garder l’œil complètement lubrifié et hydraté.
  5. En attendant, ouvrez le logiciel (par exemple, Discover) et configurez le fundoscope (par exemple, Micron) pour capturer des images sous fond clair. Attribuez à chaque souris un dossier et étiquetez les images avec R ou L en fonction de chaque œil photographié.
  6. Montez la souris sur une scène spécialement conçue pour la visualisation en direct et positionnez le microscope pour un accès complet à la rétine.
  7. Pour obtenir une représentation précise de la maladie, prenez des images de toute la zone rétinienne, couvrant tous les coins de la périphérie en plus du disque optique. Pour ce faire, ajustez l’oculaire partout. Il est crucial que l’œil reste complètement lubrifié en tout temps tout au long du processus d’imagerie; Assurez-vous de cela en complétant la pommade oculaire à un rythme constant.
  8. Reportez-vous à la rubrique 4 (ci-dessous) à ce stade pour effectuer une angiographie à la fluorescéine.
  9. Une fois l’imagerie terminée, diluer l’antisédation anti-inversée anesthésique (antisédan 5 mg/mL) dans de l’eau injectable et administrer à 0,1 mg/kg i.p. Remettez la souris dans une cage et placez-la sur un tapis préchauffé avec accès à un régime humide jusqu’à la récupération. La récupération complète est caractérisée par le mouvement de tout le corps et la marche autour de la cage avec une démarche régulière, prenant généralement quelques heures.
  10. Au critère d’évaluation expérimental désigné (p. ex. jours 21-23), répétez les étapes 4.1-4.5 et prenez à nouveau des photos de toute la région rétinienne, couvrant le disque optique et tous les coins de la périphérie pour capturer une représentation précise de la maladie.

4. Angiographie à la fluorescéine

  1. Pour mesurer les fuites vasculaires chez ces animaux, sous anesthésie, administrer à chaque souris une injection de fluorescéine à 2% par voie sous-cutanée à l’arrière du cou et une position telle que la rétine soit centralisée au milieu de l’image en direct.
  2. Réglez le fundoscope sur un filtre d’excitation de la lumière bleue à 465-490 nm. La lumière captée par la fluorescéine excitée est comprise entre 520 et 530 nm.
  3. Après 1,5 min après l’injection de fluorescéine, prenez une photo de chaque rétine et répétez à nouveau à 7 minutes.
    REMARQUE: Le timing est critique pour ces événements, si impossible de capturer les deux, alors juste l’image d’un œil.

5. Évaluation clinique des maladies

  1. Baser l’évaluation clinique sur la gravité des critères suivants : inflammation du disque optique, coiffe des vaisseaux rétiniens, infiltrat de tissu rétinien et lésions structurelles.
  2. Attribuez à chacun de ces paramètres un score sur une échelle de 0 à 5 et le total collectif est représentatif de la maladie clinique pour l’ensemble de l’œil, avec un score maximum de 20 pouvant être obtenu par œil. Le tableau 1 peut servir de guide pour les critères de notation.

6. Histologie et notation histologique

  1. Après avoir euthanasié les souris par luxation cervicale, énucléez les yeux en écartant les paupières pour un accès facile à l’œil entier.
  2. Ensuite, placez des pinces incurvées derrière le globe avec l’intention de saisir le tissu conjonctif orbitaire et le nerf optique. Prenez soin d’éviter de presser le globe.
  3. Pour la fixation, placez l’œil dans du glutaraldéhyde à 4% pendant au moins 15 minutes pour minimiser le décollement de la rétine, puis transférez à 10% de formaldéhyde pendant au moins 24 heures. 1-2 mL de fixateur donneraient suffisamment de volume pour couvrir deux yeux.
  4. Effectuer l’incorporation dans la paraffine, la section sur un microtome et la coloration selon les protocoles standard. Une épaisseur de section de 3-4 μm est recommandée pour tout type de coloration.
  5. Effectuer un examen histologique des yeux en utilisant des protocoles standard pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E).
  6. Attribuer des scores sur une échelle de 0 à 4, selon les critères de notation de l’eau, en fonction de l’étendue de l’infiltration des cellules immunitaires dans la rétine et la choroïde, de la perturbation des couches rétiniennes, du degré de formation de granulomes et de l’étendue du décollement de la rétine, indiquant des lésions rétiniennes, comme décrit précédemment (Agarwal 2013) et résumé dans le tableau 211.

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Résultats

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Dans ce protocole, nous décrivons une méthode étape par étape pour induire un modèle d’uvéite auto-immune expérimentale (EAU) en immunisant des souris avec un peptide rétinien uveitogène dérivé de l’IRBP. L’évaluation de la maladie à l’aide d’approches largement utilisées et facilement accessibles est couverte, bien que celles-ci ne soient pas exclusives et puissent être ajoutées ou partiellement remplacées par d’autres techniques d’imagerie. Les premiers signes d’EAU chez les souris C57BL/6J peuvent être détectés deux s...

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Discussion

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Les modèles animaux expérimentaux sont des outils nécessaires pour étudier la pathogenèse des maladies et les essais précliniques de nouveaux paradigmes thérapeutiques. Dans le protocole actuel, nous avons discuté d’une méthodologie pour induire, surveiller et noter EAU, un modèle expérimental d’uvéite inflammatoire intraoculaire. Ce modèle d’EAU a une incidence de plus de 95% de la maladie lorsque toutes les procédures sont effectuées conformément au protocole décrit dans le présent document, et aboutit au développement...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer avec ce travail.

Remerciements

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JG a reçu une bourse d’études UCL Impact et un financement Rosetrees Trust pour soutenir CB. VC a reçu une subvention de collaboration de recherche d’Akari Therapeutics Inc. Nous tenons à remercier l’Institut d’ophtalmologie de l’UCL, l’unité de service biologique, en particulier Mme Alison O’Hara et son équipe pour leur soutien technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
antisedanZOETIS, USApour avoir réveillé
Complete Freund' s Adjuvant ; CFASigma, UKF5881pour la vaccination  ;
DomitorOrion Pharma, Finlandepour l’anesthésie
FlouresceinSigma, Royaume-UniF2456pour l’angiographie
IRBP1-20Peptide Chamberidge, peptide britannique ; antigène  ;
KétamineOrion Pharma, Finlandepour l’anesthésie
Micron IIIPhoenix Research, États-Unispour le fond d’œil
Sérum de sourisSigma, Royaume-UniM5905pour l’immunisation  ;
Mycobacterium terberculosisSigma, Royaume-Uni344289pour la vaccination  ;
Toxine coquelucheuseSigma, Royaume-UniP2980pour l’immunisation  ;
chlorhydrate de phényléphrine 2,5 %  ;Bausch & Lomb Royaume-Uni  ;PHEN25pour la dilatation  ;
Tropicamide 1 %SANDOZpour la dilatation  ;
ViscotearsWELDRICKS Pharmacy, Royaume-Uni2082642pour la lubrification oculaire

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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