Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Résumé

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

Résumé

La capture des processus dynamiques de réplication et d’assemblage des virus a été entravée par l’absence de technologies robustes d’hybridation in situ (ISH) qui permettent un marquage sensible et simultané des acides nucléiques viraux et des protéines. Les méthodes conventionnelles d’hybridation in situ par fluorescence de l’ADN (FISH) ne sont souvent pas compatibles avec l’immunomarquage. Nous avons donc développé une approche d’imagerie, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA et p rotein), qui permet la visualisation simultanée de l’ADN, de l’ARN et de laprotéine à cellule unique. Par rapport aux poissons à ADN conventionnels, le MICDDRP utilise la technologie ISH de l’ADN ramifié (ADNb), qui améliore considérablement la sensibilité et la détection des sondes oligonucléotidiques. De petites modifications du MICDDRP permettent l’imagerie concomitante de protéines virales avec des acides nucléiques (ARN ou ADN) de différents brins. Nous avons appliqué ces protocoles pour étudier les cycles de vie de plusieurs agents pathogènes viraux, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1, le virus T-lymphotrope humain (HTLV)-1, le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC), le virus Zika (ZKV) et le virus de la grippe A (IAV). Nous avons démontré que nous pouvons marquer efficacement les acides nucléiques et les protéines virales dans un large éventail de virus. Ces études peuvent nous fournir une meilleure compréhension mécaniste de plusieurs systèmes viraux et, en outre, servir de modèle pour l’application de l’imagerie par fluorescence multiplexée de l’ADN, de l’ARN et des protéines à travers un large spectre de systèmes cellulaires.

Introduction

Alors que des milliers d’anticorps commerciaux sont disponibles pour marquer spécifiquement les protéines via des approches d’immunomarquage conventionnelles, et bien que les protéines de fusion puissent être conçues avec des marqueurs fluorescents photo-optimisés pour suivre plusieurs protéines dans un échantillon¹, la visualisation microscopique des protéines n’est souvent pas compatible avec l’hybridation in situ par fluorescence d’ADN conventionnelle (FISH)² . Les limites techniques de la visualisation simultanée de l’ADN, de l’ARN et des protéines à l’aide d’approches basées sur la fluorescence ont entravé la compréhension approfondie de la réplication virale. Le suivi des acides nucléiques viraux et des protéines au cours de l’infection permet aux virologues de visualiser les processus fondamentaux qui sous-tendent la réplication et l’assemblage^{du virus} 3,4,5,6.

Nous avons développé une approche d’imagerie, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA et Protein (MICDDRP)³, qui utilise la technologie in situ de l’ADN ramifié (ADNb) pour améliorer la sensibilité de la détection des acides nucléiques ^7,8,9 . De plus, cette méthode utilise des sondes appariées pour une spécificité accrue. Les sondes spécifiques à la séquence d’ADNb utilisent des ADN de préamplificateur et d’amplificateur ramifiés pour produire un signal intense et localisé, améliorant ainsi les méthodes d’hybridation précédentes qui reposaient sur le ciblage de régions répétées dans l’ADN⁹. Les cellules infectées dans un contexte clinique ne contiennent souvent pas de matériel génétique viral abondant, ce qui constitue un produit de base pour une méthode sensible de détection des acides nucléiques fluorescents dans des contextes de diagnostic. La commercialisation de la technologie de l’ADNb par le biais d’approches telles que^{RNAscope 7} et ViewRNA¹⁰ a comblé ce créneau. La sensibilité de l’imagerie par fluorescence de l’ADNb a également une utilité importante en biologie cellulaire, permettant la détection d’espèces d’acides nucléiques rares dans les modèles de culture cellulaire. La grande amélioration de la sensibilité rend les méthodes d’imagerie basées sur l’ADNb appropriées pour étudier les virus. Une lacune potentielle, cependant, est que ces méthodes se concentrent sur la visualisation de l’ARN ou de l’ARN et des protéines. Toutes les cellules réplicatives et de nombreux virus ont des génomes d’ADN ou forment de l’ADN au cours de leur cycle de réplication, ce qui rend les méthodes capables d’imager à la fois l’ARN et l’ADN, ainsi que les protéines, hautement souhaitables.

Dans le protocole MICDDRP, nous effectuons bDNA FISH pour la détection de l’acide nucléique viral à l’aide de la méthode RNAscope, avec des modifications⁷. L’une des modifications majeures apportées à ce protocole est l’optimisation du traitement de la protéase après fixation chimique. Le traitement à la protéase facilite l’élimination des protéines liées à l’acide nucléique pour améliorer l’efficacité de l’hybridation de la sonde. Le traitement à la protéase est suivi d’une incubation avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques ramifiées. Après l’application de sondes d’ADNb, les échantillons sont lavés puis incubés avec des ADN de préamplificateur de signal et d’amplificateur. L’hybridation in situ multiplexée (ISH), le marquage de cibles génétiques multiples, nécessite des sondes cibles avec différents canaux de couleur pour la différenciation spectrale⁷. L’incubation avec des amplificateurs d’ADN est suivie d’une immunofluorescence (IF).

bDNA ISH apporte des améliorations du rapport signal-bruit par amplification de signaux spécifiques à la cible, avec une réduction du bruit de fond provenant d’événements d’hybridation non spécifiques ^7,11. Les sondes cibles sont conçues à l’aide de logiciels accessibles au public qui prédisent la probabilité d’événements d’hybridation non spécifiques, ainsi que la température de fusion (T_m) de l’hybride sonde-cible ^7,11. Les sondes cibles contiennent une région de 18 à 25 bases complémentaire à la séquence ADN/ARN cible, une séquence d’espacement et une séquence de queue de 14 bases. Une paire de sondes cibles, chacune avec une séquence de queue distincte, s’hybrident à une région cible (couvrant ~50 bases). Les deux séquences de queue forment un site d’hybridation pour les sondes préamplificateurs, qui contiennent 20 sites de liaison pour les sondes amplificateurs, qui contiennent en plus 20 sites de liaison pour la sonde d’étiquette. Par exemple, une région d’une kilobase (kb) sur la molécule d’acide nucléique est ciblée par 20 paires de sondes, créant un échafaudage moléculaire pour l’hybridation séquentielle avec le préamplificateur, l’amplificateur et la sonde de marque. Cela peut donc conduire à un rendement théorique de 8000 marqueurs fluorescents par molécule d’acide nucléique, permettant la détection de molécules uniques et de vastes améliorations par rapport aux approches FISH^{conventionnelles 7} (voir Figure 1A pour le schéma de l’amplification du signal de l’ADNb). Pour configurer des sondes pour des ISH multiplexés, chaque sonde cible doit se trouver dans un canal de couleur différent (C1, C2 ou C3). Ces sondes cibles avec des canaux de couleur différents possèdent des séquences de queue distinctes à 14 bases. Ces séquences de queue lieront des amplificateurs de signaux distincts avec différentes sondes fluorescentes, permettant ainsi une différenciation spectrale facile sur plusieurs cibles. Dans le Protocole présenté, le tableau 4 de l’étape 9 fournit des informations supplémentaires sur le marquage fluorescent des sondes cibles. De plus, la figure 2 et la figure 3 fournissent des exemples de la façon dont nous avons choisi l’amplificateur 4-FL (A, B ou C) approprié (sonde fluorescente et étape finale d’hybridation) pour obtenir un marquage fluorescent spécifique de plusieurs cibles d’acides nucléiques viraux après des infections par le VIH-1 et le HTLV-1.

Nous avons démontré plusieurs applications de visualisation simultanée par fluorescence de l’ARN, de l’ADN et des protéines, en observant les étapes critiques de la réplication du virus avec une résolution spatio-temporelle élevée ^3,4,5. Par exemple, la visualisation simultanée à cellule unique de l’ARN viral, de l’ADN cytoplasmique et nucléaire et des protéines nous a permis de visualiser les événements clés de l’infection par le VIH-1, y compris le suivi des noyaux contenant de l’ARN dans le cytoplasme avant l’entrée nucléaire et l’intégration de l’ADN proviral³. De plus, nous avons appliqué le MICDDRP pour caractériser les effets des facteurs de l’hôte et du traitement médicamenteux sur l’infection virale et la réplication ^4,5. Dans Ukah et al., nous avons suivi la réactivation de la transcription du VIH-1 dans des modèles de cellules de latence traités avec différents agents d’inversion de latence pour visualiser la transcription du VIH et l’inversion de la latence⁴. De plus, le MICDDRP peut nous permettre de visualiser les changements phénotypiques associés à l’inhibition antivirale attribuée au traitement à petites molécules ou à la restriction du facteur hôte. Comme preuve de concept de la robustesse et de la large applicabilité de notre approche, nous avons démontré que nous pouvons utiliser des modifications de notre protocole pour marquer efficacement l’acide nucléique viral afin de suivre l’infection non seulement dans le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1, mais aussi dans le virus T-lymphotrope humain (HTLV)-1, le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC), virus Zika (ZIKV) et virus de la grippe A (IAV). Comme le cycle de vie du VIH-1 se compose à la fois d’ADN viral et d’espèces d’ARN, nous avons effectué la majorité de notre optimisation du MICDDRP après la cinétique de réplication du VIH-1. Cependant, en outre, nous avons démontré que nous pouvons suivre la synthèse de différents transcrits d’ARN viral de l’un ou l’autre ou des deux sens (+) et antisens (-) chez des virus tels que ZIKV, IAV, HBV et HCV pour surveiller la transcription virale et la réplication 3,4,5,6. Les études visent à améliorer la compréhension mécaniste de plusieurs processus viraux et servent de lignes directrices pour mettre en œuvre cette technologie d’imagerie par fluorescence dans un large éventail de modèles cellulaires.

Protocole

1. Cellules de semence (suspension vs cellules adhérentes) sur des lamelles de couverture ou des lames de chambre (le protocole présenté utilise des lamelles de couverture).

1. Ensemencement des cellules en suspension
   1. Préparer les lamelles de couverture revêtues de poly-D-lysine (PDL) (facilite l’adhérence des cellules en suspension à la lamelle de couverture) en incubant d’abord les lamelles de couverture dans de l’éthanol (EtOH) pendant 5 minutes (stérilise les lamelles de couverture et élimine tout résidu). Ensuite, laver 2x dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant d’incuber les lames de couverture dans la LDP (20 μg/mL) pendant 30 minutes (min) à température ambiante (RT).
   2. Retirez PDL et lavez 2x dans PBS. Cellules de pastilles (préalablement infectées/traitées en fonction des conditions d’imagerie souhaitées) et remettre en suspension 10⁶cellules dans 50 μL de PBS. Repérez 50 μL de cellules sur verre (enduit de PDL) et incuber à TA pendant 30 min.
2. Ensemencement des cellules adhérentes
   1. Cultiver des cellules sur une lamelle de couverture stérile placée dans un plat à 6 puits et infecter les cellules avec des particules virales ou traiter avec un composé d’intérêt. Permettre aux cellules d’atteindre une confluence de 50 à 70 % avant la préparation de l’échantillon pour les expériences d’imagerie.

2. Fixation cellulaire : préserver la morphologie cellulaire pour les études d’imagerie par fluorescence

REMARQUE: Conservez 4% PFA et PBS à RT pendant au moins 30 minutes avant la fixation cellulaire.

1. Aspirer le milieu cellulaire, laver les cellules sur des lamelles de couverture 3x dans PBS et fixer les cellules dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 30 min. Aspirer le PFA et laver les cellules dans PBS 2x.
   REMARQUE: Les cellules peuvent maintenant être déshydratées et stockées, si l’expérimentateur souhaite reprendre l’expérience à une autre date. Les cellules fixes peuvent être déshydratées dans l’EtOH avant le stockage.
   1. Retirer le PBS après le lavage après fixation cellulaire et le remplacer par 500 μL d’EtOH à 50 % (v/v dans l’eau). Incuber à TA pendant 5 min.
   2. Retirer 50 % d’EtOH et remplacer par 500 μL d’EtOH à 70 %. Incuber à TA pendant 5 min.
   3. Retirer 70 % d’EtOH et remplacer par 500 μL d’EtOH à 100 %. Incuber à TA pendant 5 min.
   4. Retirez 100% EtOH et remplacez-le par 100% EtOH frais.
      REMARQUE: Les cellules déshydratées peuvent être conservées à -20 ° C pendant 6 mois. Sceller les plaques avec du ruban adhésif ou du parafilm avant l’entreposage pour empêcher l’évaporation de l’EtOH.
   5. Réhydrater les cellules pour passer au marquage par fluorescence multiplexée des cellules/virus.
   6. Retirer 100 % d’EtOH et remplacer par 500 μL d’EtOH à 70 %. Incuber à TA pendant 2 min.
      REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sécher à tout moment. Utilisez toujours suffisamment de solution pour submerger toutes les cellules.
   7. Retirer 70 % d’EtOH et remplacer par 500 μL d’EtOH à 50 %. Incuber à TA pendant 2 min.
   8. Retirez 50% d’EtOH et remplacez-le par 1x PBS.
      REMARQUE : Préparer la dilution de la protéase, les sondes d’hybridation et le tampon de lavage avant le traitement à la protéase (étape 4) et l’application de la sonde cible (étape 5). Des instructions spécifiques sur la préparation des réactifs sont présentées au début de chaque étape respective.

Réactifs	Autres notes
Solution de protéase	Préparez-vous en 1X PBS
Sonde(s) oligonuclétodie cible(s)	Dilué dans un tampon d’hybridation
Tampon de lavage	Lavages suivant les étapes d’hybridation de la cible
Tampon d’hybridation	Recette présentée dans le tableau 3

Tableau 1 : Réactifs clés dans le protocole MICDDRP.

3. Perméabilisation cellulaire: Augmente l’accès dans les organites cellulaires et cellulaires pour l’entrée de grosses molécules (anticorps, sondes d’hybridation d’acides nucléiques)

1. Retirer 1x PBS après fixation cellulaire ou réhydratation et remplacer par 500 μL de 0,1% (v/v) Tween-20 dans 1x PBS. Incuber à TA pendant 10 min. Remplacez un par un. Laver une fois avec 500 μL de 1x PBS et ajouter 1x PBS frais.

4. Immobilisation du capseau sur lame de verre et traitement à la protéase pour éliminer les protéines de liaison aux acides nucléiques de l’acide nucléique viral/cellulaire fixe afin d’améliorer l’efficacité de l’hybridation

NOTE: Préparer la solution diluée de Protéase III (voir les spécificités du réactif dans le tableau des matériaux) pendant la perméabilisation cellulaire. Laisser la protéase atteindre la TR pendant 10 minutes avant la perméabilisation.

1. Placez une petite goutte de vernis à ongles sur une lame de verre stérilisée. Sécher le dos (côté sans couche cellulaire) et placer le bord de la couche de couverture sur la goutte de vernis à ongles, avec le côté avec les cellules collées vers le haut. Ajouter quelques gouttes de PBS sur la lamelle de couverture immobilisée pour éviter le séchage.
   1. Tracez un cercle (à environ 3 mm de la lamelle de couverture) autour du périmètre de la lamelle de couverture maintenant collée à la lame à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe (stylo hydrofuge qui maintient les réactifs localisés sur les cellules).
2. Diluer la protéase III dans 1x PBS (100 μL/lamelle de couverture).
   REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration de protéase en fonction des différences dans les types de cellules, les sondes ou les acides nucléiques cibles grâce à une optimisation empirique (voir la discussion). Pour le marquage ARN/ADN le plus efficace dans différents systèmes viraux, nous avons eu du succès avec les dilutions suivantes présentées dans le tableau 2 ci-dessous avec des dilutions allant de (1 à 2 )-(1 à 15) (protéase à 1x PBS).

Cibles de sonde	Dilution de la protéase dans 1X PBS (Protéase III à 1X PBS)
ADN/ARN du VIH-1	1 à 5
HTLV-1 ADN/ARN	1 à 5
ARNg du VHB et ARN total du VHB	1 à 15
ARN IAV	1 à 15
ARN ZIKV	1 à 2

Tableau 2 : Dilutions de la protéase III dans le PBS pour l’hybridation des acides nucléiques viraux.

3. Décanter le 1x PBS sur la lamelle de couverture après l’immobilisation et appliquer la Protéase III diluée.
4. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 15 min.
5. Décanter la solution de protéase et submerger les lames dans 1x PBS. Agiter avec un plat à bascule pendant 2 min à TA. Répéter le lavage avec le nouveau 1x PBS.
   1. Pour la détection de l’ADN seulement, laver les échantillons trois fois avec de l’eau exempte de nucléases pendant 2 minutes chacun, puis les incuber avec 5 mg/mL de RNase A diluée dans du PBS pendant 30 minutes à 37 °C.
   2. Décanter la solution de RNase A et laver 3x pendant 2 min à l’eau ultrapure. Continuer avec l’ISH de la ou des sondes cibles.
      REMARQUE: Le tampon d’hybridation améliore la détection de l’ADNv sans affecter l’efficacité de la coloration de l’ARNv pour les résultats présentés (Résultats représentatifs). Sondes diluées du canal d’ADN 1 (C1) 1:1 avec sonde d’hybridation. Sondes d’ARN dilué C2 et C3 dans un tampon d’hybridation. Les sondes C2 et C3 utilisées dans nos études d’imagerie sont en solutions 50X (1:50 ; sonde cible vers tampon d’hybridation ).
6. Préparer le tampon d’hybridation dans de l’eau exempte de nucléases en suivant la procédure étape par étape ci-dessous:
   1. Dans un tube de 15 mL, ajouter 700 μL d’eau libre de nucléase, 300 μL de sulfate de dextrane à 50 % (poids/volume (p/v)) ), 300 μL de NaCl 5 M, 125 μL de citrate de sodium 200 mM (pH 6,2) et 375 mg (poudre) de carbonate d’éthylène.
   2. Bien mélanger à l’aide d’un vortex pour dissoudre le carbonate d’éthylène (s’assurer que toute la poudre est dissoute et que la solution est claire).
   3. Ajouter 25 μL de Tween-20 à 10 % (volume/volume (v)) et suffisamment d’eau sans nucléase pour compléter 2,5 mL (solution 2x).
      REMARQUE : La recette du tampon d’hybridation présentée se trouve dans le tableau 3 ci-dessous. La solution est stable pendant une semaine. Assurer un mélange suffisant du détergent Tween-20, tout en veillant à éviter les bulles de solution.

Réactif	Concentration des stocks	Notes complémentaires
Eau sans nucléase	NA
Sulfate de dextran	50 % (p/v)	Très visqueux
Chlorure de sodium	5 M
Citrate de sodium (pH 6,2)	200 mM	Conserver à 4 °C
Carbonate d’éthylène	NA	Poudre
Préadolescent-20	10 % (v/v)

Tableau 3 : Liste des tampons d’hybridation des réactifs.

5. Incubation avec des sondes d’hybridation cible ADN/ARN : Les sondes oligonucléotidiques cibles se lient à la ou aux régions d’intérêt, créant un échafaudage moléculaire pour les préamplificateurs, les amplificateurs et les sondes fluorescentes à se lier.

REMARQUE: Réchauffer les sondes d’ADN/ARN à 40 °C pendant 10 minutes (pendant la perméabilisation cellulaire) et refroidir à TA pendant au moins 10 minutes, si aucun traitement par RNase n’est inclus. Si un traitement à la RNase ou un traitement supplémentaire par échantillon est nécessaire avant l’hybridation de la sonde cible, réchauffer les sondes en conséquence. Faites tourner les sondes C2 et C3 après le réchauffement et diluez-les dans un tampon d’hybridation. Après dilution, les sondes C2 et C3 peuvent être brièvement chauffées. Chauffer le tampon de lavage 50x (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) à 40 °C pendant 10-20 min et diluer à 1x dans de l’eau de qualité biologie moléculaire.

1. Incuber 200 μL du tampon d’hybridation à 67 °C pendant 10 min avant l’ajout de la ou des sondes d’hybridation. Sonde diluée dans un tampon d’hybridation (recette indiquée dans le tableau 2). Ajouter 50 μL/couvercle.
2. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 2 heures (h). Décanter les sondes et les lames immergées dans 1x tampon de lavage. Agiter en balançant le plat pendant 2 min à TA. Répéter le lavage avec un nouveau tampon de lavage 1x.

6. Hybridation de l’amplificateur (ampère) 1-FL : Ajout d’un préamplificateur complémentaire à la séquence de queue des sondes ADN/ARN cibles (étape 5)

REMARQUE: Les amplificateurs doivent être à RT avant utilisation. Sortez chaque amplificateur individuel du réfrigérateur 30 minutes avant utilisation et laissez-le sur la banc à la RT.

1. Retirez les lames du tampon de lavage 1x et tapotez/absorbez pour éliminer l’excès de liquide.
2. Ajouter 1 goutte d’Amp 1-FL sur la lame. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 30 min.
3. Decant Amp 1-FL et immergez-vous dans 1x tampon de lavage. Agiter en balançant le plat 2 min à TA. Répéter le lavage avec un nouveau tampon de lavage 1x.

7. Hybridation Amp 2-FL : Incubation avec amplificateur de signal avec séquence de reconnaissance apparentée aux préamplificateurs (Amp 1-FL)

1. Retirez les lames du tampon de lavage 1x et tapotez/absorbez pour éliminer l’excès de liquide.
2. Ajouter 1 goutte d’Amp 2-FL sur la lame. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 15 min.
3. Decant Amp 2-FL et immergez-vous dans 1x tampon de lavage. Agiter en balançant le plat 2 min à TA. Répéter le lavage avec un nouveau tampon de lavage 1x.

8. Hybridation Amp 3-FL: Incubation avec deuxième amplificateur de signal

1. Retirez les lames du tampon de lavage 1x et tapotez/absorbez pour éliminer l’excès de liquide.
2. Ajouter 1 goutte d’Amp 3-FL sur le bordereau. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 30 min.
3. Decant Amp 3-FL et immergez-vous dans 1x tampon de lavage. Agiter en balançant le plat 2 min à TA. Répéter le lavage avec un nouveau tampon de lavage 1x.

9. Hybridation de l’amp 4-FL : étiquette fluorescente et étape finale d’hybridation

REMARQUE: Tout d’abord, reportez-vous au tableau 4 pour choisir l’amplificateur 4 (A, B ou C)-FL approprié en fonction des canaux de la ou des sondes cibles. Évaluer quelle amp 4-FL est nécessaire pour marquer l’ADN / ARN d’intérêt. Un exemple est fourni par le tableau ci-dessous:

	Un	B	C
Canal ADN 1 (C1)	488	550	550
ADN/ARN Canal 2 (C2)	550	488	647
ARN canal 3 (C3)	647	647	488

Tableau 4 : Sélection de sondes fluorescentes Amp 4 (A, B ou C)-FL pour les ISH multiplexés.

REMARQUE: Pour les FISH multiplexés (cibles multiples), le choix de l’amp 4 (A, B ou C)-FL approprié est essentiel pour étiqueter correctement votre cible d’intérêt. Les sondes cibles (étape 5) ont différents canaux de couleur (C1, C2 ou C3), qui dictent leur étiquette fluorescente respective (Alexa 488, Atto 550 ou Alexa 647), en fonction de l’Amp 4-FL choisi. Des exemples de choix de combinaisons de fluorophores pour l’imagerie multiplexée sont fournis dans les légendes de la figure 2 et de la figure 3. À titre d’exemple supplémentaire, la sélection de l’ampli 4B-FL marquera sélectivement les sondes ADN C1 avec Atto 550 et les sondes ARN C3 avec Alexa 647.

1. Retirez les lames du tampon de lavage 1x et tapotez/absorbez pour éliminer l’excès de liquide.
2. Ajouter 1 goutte d’Amp 4-FL sur la lame. Incuber dans un four humidifié à 40 °C pendant 15 min.
   REMARQUE : Après l’étape 9.2, gardez les échantillons couverts, à l’abri de la lumière.
3. Decant Amp 4-FL et immergez-vous dans 1x tampon de lavage. Agiter en balançant le plat pendant 2 min à TA. Répéter le lavage avec un nouveau tampon de lavage 1x. Laver avec 1x PBS (2 min) et conserver dans PBS.

10. Immunomarquage des protéines : Pour marquer la ou les protéines d’intérêt

1. Décanter PBS et ajouter 200 μL de tampon de blocage (1 % p/v BSA, 10 % v/v FBS dans PBS avec 0,1 % v/v Tween-20 (PBST)) à la lamelle de couverture. Incuber 1 h à TA.
2. Décanter le tampon bloquant et appliquer 200 μL d’anticorps primaire dilué dans du PBST + 1% p/v BSA. Incuber 1 h à TA.
3. Lavez la lame deux fois avec PBST pendant 10 min à TA en secouant.
4. Appliquer l’anticorps secondaire de votre choix pendant 1 h à la RT dans le PBST + 1 % p/v de BSA.
5. Laver la lame avec PBST pendant 10 min à TA en secouant.

11. Coloration nucléaire : Noyaux anti-taches après immunomarquage

1. Décanter PBST et appliquer le DAPI ou la coloration nucléaire de votre choix pendant 1 min à TA.
2. Lavez la lame deux fois avec PBS pendant 10 minutes à TA en secouant.

12. Montage

1. Placer 1 goutte de solution antidécoloration (p. ex., Prolong Gold) sur une nouvelle lame de verre stérile (d’abord, nettoyer la lame avec de l’EtOH et laisser sécher pour s’assurer qu’il n’y a pas de résidus sur le verre). Avec le même embout, étaler la goutte de solution antidécoloration pour couvrir une zone approximativement de la taille de la lamelle de couverture.
   REMARQUE: La solution antidécoloration est très visqueuse et peut être difficile à pipetter. Couper la pointe d’une pointe de 200 μL avant le pipetage peut atténuer ces problèmes.
2. Retirez la lamelle de couverture avec l’échantillon de cellule de la lame et immergez-la dans le PBS pour enlever le vernis à ongles résiduel à l’arrière à l’aide de la pince et du PBS. Pinces sèches et dos de la lamelle de couverture à l’aide d’un Kimwipe.
3. Insérer délicatement la lamelle de couverture dans la goutte de solution anti-décoloration, en plaçant le côté échantillon (côté avec la couche cellulaire) de la lamelle de couverture sur la goutte).
4. Laissez les échantillons sécher pendant la nuit.

13. Imagerie

1. Image avec un microscope épifluorescent.

Résultats

Un schéma du MICDDRP est illustré à la figure 1. Le marquage de l’ADN et de l’ARN est suivi d’une immunomarquation. L’utilisation d’amplificateurs ramifiés augmente le signal, permettant la détection de molécules d’acide nucléique uniques.

Figure 1 : Schéma du MICDDRP et du flux de travail étape par étape. (A) Le signal...

Discussion

La visualisation simultanée de l’ARN, de l’ADN et des protéines nécessite souvent une optimisation approfondie. Deux méthodes couramment utilisées sont le marquage de la 5-éthynyl-2-désoxyuridine (EdU) et l’ADN FISH. Le marquage EdU a été appliqué pour visualiser simultanément l’ADN viral et les protéines, car EdU est incorporé dans l’ADN naissant et ensuite marqué avec des colorants fluorescents contenant de l’azoture via la chimie du clic. Le marquage EdU peut ainsi être utilisé pour surveiller la cinétique na...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4 % PFA
50 % sulfate de dextran	Amreso	198	Pour tampon d’hybridation d’ADN Tampon
lavage 50X	ACD Bio	320058
Plaques
Amplificateur 1-FL	ACD Bio
Amplificateur 2-FL	ACD Bio
Amplificateur 3-FL	ACD
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Tableau Amp-4 dans le protocole
Anticorps anti-VHC NS5a	Abcam	ab13833	Souris monoclonale ; fonctionne avec les génotypes 1a, 1b, 3 et 4 du VHC
Anticorps monoclonal anti-VIH-1 p24	Programme de réactifs NIH AIDS	3537
Anticorps anti-Mov10	Abcam	ab80613	Polyclonal
de lapinAnticorps anti-PB1	GeneTex	GTX125923	Anticorps contre la protéine de la grippe
Albumine			Réactif bloquant pour l’immunocoloration
Milieux cellulaires avec suppléments			Milieux adaptés au modèle cellulaire
Lamelles
DAPI	ACD Bio		Coloration nucléaire (kit RNAscope d’ACD Bio)
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (1X PBS)	Gibco	14190250	Sans calcium ni magnésium
	Sigma	E26258
Sérum fœtal bovin (FBS)			Utiliser un FBS spécifique basé sur l’anticorps secondaire sérique élevé (par exemple FBS de chèvre)
Lames de microscope Fisherbrand colorfrost plus	Scientific	12-550-17/18/19	Pré-nettoyé
HCV-GT2a-sense-C2 Sonde	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA sonde
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 sonde ADNc
VIH-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	Sonde d’ARN VIH-1
HybEZ four d’hybridation ACD	Bio	321710/321720
ImmEdge stylo barrière hydrophobe	Vector Laboratories	H-4000
Vernis			Pour immoboliser la lamelle à glisser avant le traitement à la protéase
Eau sans nucléase	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Couche de lamelles en 20 & micro ; g/mL de PDL pendant 30 minutes
Diluant de sonde	ACD Bio	300041	Pour diluer les sondes d’ARN C2 ou C3
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protéase III	ACD Bio	322337
RNAscope® ;   ; Sonde- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD	Bio 436221
RNase A	Qiagen
Lames Lames
Chlorure
			Pour tampon d’hybridation de l’ADN
Citrate de sodium, pH 6,2			Pour tampon d’hybridation de l’ADN
Tween-20			Pour tampon d’hybridation d’ADN et PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV ARNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV sonde d’ARNg
V-HCV-GT2a Sonde	ACD Bio	441361	HCV(-) détection Sonde d’ARN V-HTLV-HBZ-sense-C3
	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sonde d’ARN de détection HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	Sonde d’ADN HTLV-1
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sonde d’ARN de détection
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	sonde d’ARN IAV
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sonde d’ARN
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	ARN de détection Zika(-) sonde