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Article de méthode

Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9

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DOI :

10.3791/61855

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3 novembre 2020

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1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour crispr / Cas9 basée sur l’ingénierie du génome des cellules B humaines primaires pour les gènes KNOCKOUT (KO) et knock-in (KI) pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les cellules B et le développement de la thérapeutique à cellules B.

Résumé

Les cellules B sont des lymphocytes dérivés de cellules souches hématopoïétiques et sont un composant clé du bras humoristique du système immunitaire adaptatif. Ils font des candidats attrayants pour les thérapies cellulaires en raison de leur facilité d’isolement du sang périphérique, leur capacité à se développer in vitro, et leur longévité in vivo. En outre, leur fonction biologique normale , pour produire de grandes quantités d’anticorps - peut être utilisé pour exprimer de très grandes quantités d’une protéine thérapeutique, comme un anticorps recombinant pour lutter contre l’infection, ou une enzyme pour le traitement des enzymopathies. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour isoler les cellules B humaines primaires des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) et activer/étendre les cellules B isolées in vitro. Nous démontrons ensuite les étapes impliquées dans l’utilisation du système CRISPR/Cas9 pour le KO spécifique au site des gènes endogènes dans les cellules B. Cette méthode permet de KO efficace de divers gènes, qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions biologiques des gènes d’intérêt. Nous démontrons ensuite les étapes à prendre pour utiliser le système CRISPR/Cas9 ainsi qu’un vecteur viral recombinant, associé à l’adéno-associé (rAAV) pour une intégration efficace spécifique au site d’une cassette d’expression transgénique dans les cellules B. Ensemble, ce protocole fournit une plate-forme d’ingénierie étape par étape qui peut être utilisée dans les cellules B humaines primaires pour étudier les fonctions biologiques des gènes ainsi que pour le développement de la thérapeutique à cellules B.

Introduction

Les cellules B sont un sous-groupe de la lignée des lymphocytes dérivés des cellules souches hématopoïétiques. Ils jouent un rôle critique dans le système immunitaire adaptatif de l’humour en produisant de grandes quantités d’anticorps en réponse aux défis immunitaires1. Les cellules B sont également des précurseurs des cellules B de mémoire et des cellules plasmatiques en phase terminale différenciées et de longue durée, fournissant ainsi une immunité humoristiquedurable 2. Les cellules plasmatiques, en particulier, sont uniques parmi les cellules immunitaires dans leur capacité à produire de grandes quantités d’un anticorps spécifique tout en survivant pendant des années ou desdécennies 3. En outre, la facilité d’isolement du sang périphérique fait de la lignée des cellules B un excellent candidat pour les nouvelles thérapies cellulaires4.

Auparavant, des méthodes d’intégration aléatoires, telles que celles utilisant des vecteurs lentiviraux ou un transposon de la Belle au bois dormant, ont été utilisées pour concevoir des cellules B pour la livraison et l’expression transgéniques5,6,7,8. Cependant, la nature non spécifique de ces approches rend difficile l’étude des fonctions biologiques d’un gène spécifique dans les cellules B et comporte un risque inhérent de mutagenèse insertionnelle et d’expression transgénique variable et/ou de silencing dans le cadre thérapeutique.

Le système CRISPR/Cas9 est un puissant outil d’ingénierie du génome qui permet aux chercheurs de modifier avec précision le génome de diverses cellules chez de nombreuses espèces. Récemment, deux groupes, dont le nôtre, ont développé avec succès des méthodes d’expansion ex vivo et d’ingénierie génomique ciblée des cellules Bhumaines primaires 9,10. Nous décrira le processus de purification des cellules B humaines primaires à partir d’un échantillon de leucémie. Après cela, nous allons décrire notre protocole mis à jour pour l’expansion des cellules B et l’activation des cellules B isolées. Nous décrira ensuite un processus d’assommage du cluster de différenciation 19 (CD19), un récepteur spécifique des cellules B et une caractéristique des cellules B, par électroporation pour introduire l’ARNm CRISPR/Cas9 ainsi que le SGRNA CD19 dans les cellules B activées.

L’ARNm Cas9 est traduit et se lie au CD19 sgRNA pour former un complexe ribonucléoprotéine CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Par la suite, sgRNA dans le complexe conduit Cas9 à créer une rupture à double brin (DSB) à la séquence cible sur l’exon 2 du gène. Les cellules répareront l’ORD en « joignant l’extrémité non homologue » en introduisant ou en supprimant les nucléotides, ce qui entraîne une mutation du changement de cadre et l’étruisation du gène. Nous mesureons ensuite la perte de CD19 par cytométrie de débit et analyserons la formation d’indélébiles en suivant les indélébiles par analyse de décomposition (TIDE).

Nous décririons ensuite le processus d’utilisation de CRISPR/Cas9 avec un vecteur recombinant AAV6 (rAAV6, un modèle de donneur pour la réparation dirigée par homologie (HDR)) pour médiation de l’insertion spécifique au site de protéines fluorescentes vertes améliorées(EGFP) au site d’intégration du virus associé à l’adéno-associé 1 (AAVS1) gène. Le gène AAVS1 est un locus actif sans fonctions biologiques connues et un site d’intégration virale AAV sur le génome humain; par conséquent, il est considéré comme une « sphère de sécurité » pour l’ingénierie génomique. Ici, nous rapportons que l’expansion et l’activation des cellules B ont permis jusqu’à 44 fois l’expansion en 7 jours de culture (figure 1). L’électroporation des cellules B a montré une légère réduction de la santé globale des cellules (figure 2A) à 24 h post-transfection. L’analyse de l’intrigue scatter du marqueur CD19 (Figure 2B) a montré jusqu’à 83% de réduction dans les cellules éditées (Figure 2C).

L’analyse TIDE des chromatographes (figure 3A) a révélé que les indels en % étaient semblables à la perte de % de protéines par cytométrie de débit (figure 3B). L’analyse de cytométrie de flux de l’expérience KI a montré que les cellules qui ont reçu le vecteur AAV (figure 4), ainsi que le RNP, ont exprimé jusqu’à 64 % de cellules egfp-positives (figure 5A) et plus tard ont montré l’intégration réussie par la réaction en chaîne de polymétrose de jonction (PCR) (figure 5B). Le dénombrement des cellules a montré que tous les échantillons se sont rapidement rétablis dans les 3 jours suivantl’ingénierie ( figure 5C).

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Protocole

Des échantillons de leucémie provenant de donneurs en bonne santé ont été obtenus auprès d’une banque de sang locale. Toutes les expériences décrites ici ont été déclarées exemptes de recherche par l’Institutional Review Board (IRB) et ont été approuvées par le Institutional Biosafety Committee (IBC) de l’Université du Minnesota.

REMARQUE : Toutes les expériences ont été effectuées conformément à la précaution universelle pour les agents pathogènes transmissibles par le sang, avec des techniques stériles/aseptiques et un équipement de niveau 2 de biosécurité approprié.

1. Préparez des suppléments pour le milieu d’expansion de B-cellule

  1. Reconstituer l’oligonucléotide cpg à une concentration de 1 mg/mL.
  2. Reconstituer le CD40 ligand (CD40L) à une concentration de 100 μg/mL.
  3. Reconstituer l’IL-10 humain recombinant (rhIL-10) à une concentration de 50 μg/mL.
  4. Reconstituer l’IL-15 humain recombinant (rhIL-15) à une concentration de 10 μg/mL.
    REMARQUE : Gardez chaque supplément en petits aliquots à -20 °C à -80 °C jusqu’à 6 mois.

2. Préparer le milieu basal

  1. Combinez le milieu basal à cellules B avec un supplément média de 5 % (v/v) pour l’expansion in vitro des cellules immunitaires (p. ex., CTS Immune Cell SR) et de 1 % (v/v) de pénicilline et de streptomycine.
  2. Stériliser le milieu basal à l’aide d’un adaptateur filtre de 0,22 μm dans une bouteille stérilisée.
  3. Garder le milieu basal à 4 °C jusqu’à 1 mois.

3. Préparer le milieu d’expansion des cellules B

  1. Transférer la quantité requise du milieu basal dans un récipient stérile pour culturer les cellules B à 5 × 105 cellules/mL.
  2. Compléter le milieu basal avec 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 et 10 ng/mL rhIL-15.
  3. Filtrer le milieu d’expansion des cellules B à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
  4. Equilibrer le milieu d’expansion des cellules B dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C, 5 % de CO2 avec humidité pendant au moins 30 min avant utilisation.
    REMARQUE : Préparez un milieu d’expansion frais à cellules B à utiliser pendant une journée. Ne préparez pas le milieu d’expansion des cellules B à utiliser pendant plusieurs jours. Cette recette médiatique encourage la prolifération des cellules B de mémoire et des cellules B humaines primaires activées.

4. Purification et expansion des cellules B humaines

REMARQUE : Ajouter de l’alcool isopropylique à 99 à 100 % dans un contenant de congélation à température contrôlée, suivant les instructions du fabricant, et réfrigérer le contenant de congélation à 4 °C avant de commencer l’étape 4.1.

  1. Isoler les PBMCs d’un échantillon de leucémie
    1. Transférer un échantillon de leucémie (environ 8-10 mL) dans un tube conique stérile de 50 mL.
    2. Porter le volume à 35 mL avec une solution saline stérile de 1 x tamponné de phosphate (PBS).
    3. Superposez soigneusement un échantillon de leucémie de 35 mL sur 15 mL de dénivelé moyen.
    4. Centrifugeuse à 500 × g pendant 25 min sans frein, enlever la couche plasmatique sans déranger la couche buffy (couche PBMC), collecter les PBMCs de l’interface, et le transfert vers un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
    5. Faites monter les PBMCs à 50 mL avec 1x PBS.
    6. Centrifugeuse à 500 × g pendant 5 min sans frein. Retirez le supernatant sans déranger la pastille PBMC, qui peut sembler rouge.
    7. Ajouter 7 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium, pipette 3 fois pour bien mélanger et incuber à température ambiante (RT) pendant 3 min.
    8. Porter le volume à 50 mL avec 1x PBS.
    9. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min avec frein à faible résistance. Retirer le surnatant sans déranger la pastille. La pastille doit avoir l’air rosée ou blanche.
      REMARQUE : Pour continuer à culturer les cellules B fraîchement isolées, préparez le milieu d’expansion des cellules B avant de commencer l’isolement des cellules B (étape 4.2).
  2. Isolement des cellules B des PMC à l’aide d’un kit d’isolement négatif primaire à cellules B humaines
    1. Resuspendez les PBMCs dans le tampon d’isolement à une concentration de 5 × 107 cellules/mL.
      REMARQUE : Si le nombre total de PBMCs est inférieur à 5 × 107 cellules, réduire le volume de tampon d’isolement pour maintenir 5 × 107 cellules/mL. Les volumes minimaux et maximaux de suspension cellulaire sont respectivement de 0,25 mL et de 8 mL.
    2. Transférer jusqu’à 8 mL (5 × 107 cellules/mL) dans un tube stérile en polypropylène à fond rond avec capuchon.
    3. Ajouter 50 μL/mL d’exhausteur de cocktails aux PBMCs.
    4. Ajouter 50 μL/mL de cocktail isolation aux PBMCs, capuchon le tube et inverser 2 à 3 fois pour mélanger.
    5. Incuber à RT pendant 5 min; à la4ème minute d’incubation, les microbilles magnétiques vortex pendant au moins 30 s.
    6. Transférer 50 μL de microbilles magnétiques par 1 mL de PBMCs, capuchon le tube, et inverser 2-3 fois pour mélanger.
    7. Rechargez jusqu’à 10 mL avec tampon d’isolement et pipette doucement de haut en bas 2-3 fois.
    8. Placer le tube dans une station magnétique et incuber à RT pendant 3 min.
    9. Maintenez l’aimant et le tube ensemble, et en un seul mouvement, inversez l’aimant et le tube ensemble pour verser la suspension cellulaire dans le nouveau tube. Jeter l’ancien tube.
    10. Répétez l’étape 4.2.8 (réduisez le temps d’incubation à 2 min) et versez la suspension de la cellule B dans un tube conique propre.
    11. Les cellules B enrichies sont prêtes à l’emploi. Si les cellules sont utilisées immédiatement, continuer à la section 4.3 (expansion des cellules B humaines). Vérifiez la pureté des cellules B isolées par cytométrie d’écoulement (facultatif). Si les cellules doivent être congelées avant utilisation, continuer à marcher 4.2.12.
    12. Pour congeler les cellules B, centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min, et jeter le supernatant sans déranger la pastille.
    13. Resuspendez les cellules dans le milieu de congélation à10 7 cellules/mL, et aliquot 1 mL/cryovial.
    14. Placer le cryovial dans le contenant de congélation réfrigéré et conserver à -80 °C toute la nuit; puis, transférer le cryovial congelé dans un réservoir d’azote liquide; garder les cellules congelées jusqu’à 1 an.
      REMARQUE : Le rendement prévu des cellules B isolées est de 2 % à 8 % du total des PMC, avec une viabilité de 95 % à 99 %.
  3. Expansion humaine des cellules B
    REMARQUE : Si vous utilisez des cellules B fraîchement isolées, sautez les étapes 4.3.1-4.3.5. Comptez les cellules et transférez le nombre requis de cellules dans un tube conique stérile et continuez avec l’étape 4.3.6.
    1. Sérum bovin fœtal préchauffé (FBS) dans un bain d’eau avant le dégel des cellules B. Préparer 20 mL de milieu d’expansion des cellules B, transférer dans un flacon T25 et prééquilibrer le milieu dans un incubateur de culture tissulaire (à 37 °C, 5 % de CO2,avec humidité) au moins 15 minutes avant utilisation.
    2. Décongeler les cellules B dans un bain d’eau de 37 °C. En attendant, transférer 2 mL de FBS préchauffé dans un tube conique stérile de 15 mL.
    3. Une fois que les cellules B sont complètement décongelées, ajouter immédiatement 1 mL de FBS préchauffé, drop-wise, dans l’échantillon. Incuber à RT pendant 1 min.
    4. Pipette doucement pour résuspendre l’échantillon et transférer l’ensemble du volume, dans le sens de la goutte, dans un tube conique contenant 2 mL de FBS préchauffé.
    5. Porter le volume à 15 mL avec 1x PBS stérile, capuchon, et inverser le tube doucement 2-3 fois.
    6. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min.
    7. Jetez le supernatant sans déranger la pastille cellulaire, résuspendez la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu d’expansion pré-équilibré de cellules B, et comptez les cellules. Le nombre total de cellules devrait être d’environ 107 cellules.
    8. Transférer les cellules dans un flacon contenant 20 mL du milieu d’expansion pré-équilibré des cellules B. La concentration finale des cellules doit être d’environ 5 x 105 cellules/mL.
    9. Incuber le flacon verticalement dans un incubateur de culture tissulaire.
    10. Rafraîchissez complètement le milieu d’expansion tous les 2 jours en transférant tout le volume des cellules B dans un tube conique stérile et répétez les étapes 4.3.6-4.3.9.
      REMARQUE : Le flacon T25 peut contenir de 10 à 20 mL de milieu; Le flacon T75 peut contenir jusqu’à 20 à 60 mL de milieu.

5. Ingénierie humaine primaire de B-cellule

  1. Cellules B d’ingénieur à 48 ± 2 h après expansion/activation pour des résultats optimaux. Préparer le milieu d’expansion des cellules B, aliquot 1 mL du milieu dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits, et pré-équilibrer dans un incubateur de culture tissulaire au moins 15 minutes avant utilisation.
    REMARQUE : Lors de la conception d’un SGRNA CRISPR/Cas9 pour un gène d’intérêt, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    - Concevoir sgRNAs à l’aide d’un outilen ligne 11.
    - Concevoir des sgARN sur un exon commun à tous les isoformes de la protéine.
    - Commandez du sgRNA chimiquement modifié auprès d’entreprises réputées.
    - sgRNA vient généralement sous forme lyophilisée; reconstituer le sgRNA dans le tampon stérile DNase/RNase-free Tris-EDTA (TE) à une concentration de 1 μg/μL.
  2. Préparer le substrat transfecteur CRISPR/Cas9 en mélangeant 1 μL (1 μg/μL) de sgRNA chimiquement modifié avec 1,5 μL (1 μg/μL) de pyogènes Streptococcus cas 9 (S.p. Cas9) par réaction transfection. Pour le contrôle, utilisez 1 μL de tampon TE au lieu de sgRNA.
    REMARQUE : Lorsque le CD19 sgRNA est utilisé pour une expérience de KO génétique, voir la figure 2 pour obtenir des résultats. Lorsque l’AAVS1 sgRNA est utilisé pour une expérience ki génétique, voir la figure 5 pour obtenir des résultats.
    • Gardez tous les composants sur la glace.
  3. Mélanger délicatement et transférer 2,5 μL de substrat transfecteur CRISPR/Cas9 par réaction dans un tube d’une bande de 0,2 mL à 8 tubes; mis de côté à RT.
  4. Allumez un nucléofector (électroporateur) et préparez des réaccentrages de transfection comme le montre le tableau 1.
    REMARQUE : Il s’agit d’une bonne étape pour une pause, si nécessaire, en mettant tous les reagents sur la glace. Retirez tous les reagents de la glace lorsqu’ils sont prêts à reprendre l’expérience. Lors de l’utilisation de la protéine S.p. Cas9, l’investigateur DOIT pré-complexe CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein en mélangeant 1 μg sgRNA avec 5 μg de protéine S.p. Cas9, en évitant toute bulle, et en incubant le mélange à RT pendant au moins 20 min avant utilisation pour des résultats optimaux.
  5. Comptez et transférez10 cellules B par réaction de transfection dans un tube conique stérile.
  6. Porter le volume à 15 mL avec 1x PBS stérile, et centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min. En attendant, préparez le réaccente de transfection des cellules primaires (tableau 2) et mettez de côté à RT.
  7. Jetez le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  8. Resuspendez la pastille cellulaire avec 10 mL de 1x PBS stérile et centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min.
  9. Jetez complètement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  10. Transférer 0,5 μg d’ARNm GFP chimiquement modifié (en tant que reporter de transfection) par 10cellules B à la pastille cellulaire (facultatif).
  11. Resuspendre la pastille cellulaire avec 20 μL réaménagement de transfection cellulaire primaire par 10cellules B 6; mélanger délicatement en pipetting 5-6 fois. Transférer 20,5 μL par réaction de transfection dans le tube de 0,2 mL de la bande à 8 tubes contenant 2,5 μL du substrat de transfection CRISPR/Cas9.
  12. Pipette de haut en bas une fois pour mélanger et transférer l’ensemble du volume (23 μL) dans une cuvette transfection. Capuchon et appuyez doucement sur la cuvette sur le banc pour vous assurer que le liquide recouvre le fond de la cuvette.
  13. Utilisez le protocole primaire humain de B-cellule sur le nucléofector pour la transfection.
    REMARQUE : Le nucléofector (électroporateur) peut être placé et utilisé à l’extérieur du capot de culture tissulaire. Capuchon de la cuvette pour assurer la stérilité.
  14. Reposer les cellules électroporées dans la cuvette à RT pendant 15 min.
  15. Transférer 80 μL du milieu d’expansion pré-équilibré des cellules B de la plaque de culture tissulaire dans la réaction de transfection dans la cuvette. Placer la cuvette dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 30 min.
  16. Pipette doucement à quelques reprises pour mélanger et transférer tout le volume de l’échantillon de la cuvette à un puits approprié d’une plaque de culture tissulaire de 48 puits contenant 1 mL du milieu d’expansion des cellules B. La concentration finale des cellules doit être de 106 cellules/mL.
  17. Si vous effectuez une expérience de KI génétique, transférez le vecteur rAAV6 à 500 000 multiplicité d’infection dans le puits approprié contenant des cellules électroporées (environ 45 min après électroporation). Voir exemple de construction vectorielle rAAV6 dans la figure 4A.
    REMARQUE : Par exemple : Un échantillon de contrôle sera électroporé sans CRISPR/Cas9 ou le vecteur rAAV6. Un échantillon vectoriel uniquement sera électroporé sans CRISPR/Cas9, puis transduit avec le vecteur rAAV6. Un échantillon KI sera électroporé avec CRISPR/Cas9, puis transduit avec le vecteur rAAV6. rAAV6 doit contenir des bras d’homologie en amont et en aval du site ciblé de l’ORD pour hdr.
  18. Placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et 5 % de CO2 avec humidité.
  19. Comptez les cellules et enregistrez la viabilité au jour 1 après l’ingénierie.
  20. Rafraîchissez le milieu d’expansion des cellules B tous les 2 jours en comptant les cellules, puis en transférant tout le volume des cellules dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 mL. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min, et jeter le supernatant sans déranger la pastille. Resuspendez les cellules avec 100 μL de milieu frais d’expansion de B-cellule, et transférez à un puits d’une plaque de culture de tissu de 24 puits. Faire monter le volume moyen pour atteindre une concentration cellulaire finale à 5 × 105 cellules/mL.
    REMARQUE : Une plaque de 48 puits peut contenir jusqu’à 1 mL moyen/puits; une plaque de 24 puits peut contenir jusqu’à 2 mL moyen/puits; une plaque de 12 puits peut contenir jusqu’à 4 mL moyen/puits, et une plaque de 6 puits peut contenir jusqu’à 8 mL moyen/bien.
  21. Permettre aux cellules modifiées de se développer pendant au moins 5 jours avant d’effectuer des analyses en aval, comme pour l’analyse de la cytométrie du débit, l’analyse TIDE et la jonction PCR.

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Résultats

Le protocole d’expansion et d’activation mis à jour a permis l’expansion rapide des cellules B jusqu’à 44 fois en 7 jours(figure 1; n =3 donneurs). Dans l’expérience KO, le nombre de cellules B utilisant la coloration bleue Trypan a montré plus de 80% de cellules viables avec une légère réduction de la récupération cellulaire dans le contrôle et les échantillons de KO CD19 à 24 h après électroporation (Figure 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donneurs). Ce résultat indique qu...

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Discussion

L’ingénierie précise du génome dans les cellules B humaines primaires a été difficilejusqu’à récemment 9,10. Nous avions précédemment publié des protocoles utilisant CRISPR/Cas9 pour concevoir les cellules B humaines primaires9. Ici, nous décrivons des protocoles améliorés pour l’isolement, l’expansion et l’ingénierie des cellules B pour permettre un KO efficace de CD19 ou pour frapper-in EGFP.

Ici, nou...

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Déclarations de divulgation

Un brevet a été déposé sur les méthodes de fabrication et d’utilisation de cellules B éditées par le génome avec M.J.J, K.L. et B.S.M. comme inventeurs. B.S.M est consultant et détient des actions d’Immusoft Inc. Immusoft Inc. a parrainé des recherches dans le laboratoire de B.S.M.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par le Children’s Cancer Research Fund (CCRF) et les NIH R01 AI146009 à B.S.M.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alt-R S.p. Cas9 Nucléase V3 protéine, 500 ugIDT1081059une taille plus petite est également disponible
Amaxa P3 cellule primaire 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)LonzaV4XP-3032
Tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK)Qualité Biologique118-156-101
CleanCap chimiquement modifié Cas9 ARNmTrilink BiotechnologyL-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mgInvivogenTLRL-2006-5différentes tailles disponibles
Cryostor CS10, 100 mLTechnologie STEMCELL7930
CTS Immune Cell SRThermo Fisher ScientificA2596101
EasySep Kit d’isolement de cellules B humainesSTEMCELL Technology17954
eBioscience colorant de viabilité fixable eFlour 780eBiosciences65-0865-14
Milieux de cellules B d’exceller, R& sans xéno D SystemsCCM031Milieu basal à cellules B
Falcon 14 mL Polypropylène Tube à fond rondCorning352059
Sérum fœtal bovin (FBS)R& D SystemsS11550Pour la décongélation uniquement des lymphocytes B
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
GeneMate SnapStrip® ; 8-Strip 0,2 mL Tubes PCR avec capuchons de dôme individuels attachésBioExpressT-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (sans Ca, sans Mg) ou 1x PBSGE lifesciencesSH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unitLonzaAAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unitLonzaAAF-1002X
Mega CD40 LigandEnzo Life SciencesALX-522-110-C010
Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EAPour la congélation de cellules
Pen/Strep 100XSigma-AldrichTMS-AB2-C
PerCP anti-humain CD19 clone HIB19biolegend302228taille plus petite est également disponible
pour l’emballage SA-GFP rAAV6 (avec notre cassette SA-GFP, voir Figure 4).Vigene BiosciencesN/Aemballage à grande échelle, 1e13 GC/mL, 500 mL
Protéine IL-10 humaine recombinante 250 ugR& D Systems217-IL-250différentes tailles disponibles
Protéine IL-15 humaine recombinante 25 ugR& D Systems247-ILB-025différentes tailles disponibles
L’aimant Big Easy EasySepTechnologie STEMCELL18001différentes tailles disponibles
tampon Tris-EDTA (TE)Fisher ScientificBP2476100

Références

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
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Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9
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