Préparation de conjugués protéiques cytotoxiques spécifiques au site par chimie maléimide-thiol et ligature médiée par la sortase A

Mateusz Adam Krzyscik; Aleksandra Sokolowska-Wedzina; Karolina Jendryczko; Marta Pozniak; Daria Nawrocka; Natalia Porebska; Malgorzata Zakrzewska; Jacek Otlewski; Anna Szlachcic; Lukasz Opalinski

doi:10.3791/61918

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Article de méthode

Préparation de conjugués protéiques cytotoxiques spécifiques au site par chimie maléimide-thiol et ligature médiée par la sortase A

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DOI :

10.3791/61918

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5 janvier 2021

Mateusz Adam Krzyscik¹^,² , Aleksandra Sokolowska-Wedzina¹ , Karolina Jendryczko¹ , Marta Pozniak¹ , Daria Nawrocka¹ , Natalia Porebska¹ , Malgorzata Zakrzewska¹ , Jacek Otlewski¹ , Anna Szlachcic¹ , Lukasz Opalinski¹

¹Department of Protein Engineering, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, ²Department of Protein Biotechnology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Dans cet article

Résumé

Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour un marquage spécifique au site des protéines avec des médicaments cytotoxiques en utilisant la réaction maléimide-thiol et la ligature médiée par la sorte A.

Résumé

Le cancer est actuellement la deuxième cause de décès dans le monde. La caractéristique des cellules cancéreuses est la présence de protéines marqueurs spécifiques telles que les récepteurs du facteur de croissance à leur surface. Cette caractéristique permet de développer des thérapies hautement sélectives, les bioconjugués protéiques, composés de protéines ciblées (anticorps ou ligands récepteurs) connectées à des médicaments hautement cytotoxiques par un linker spécifique. En raison de la très grande affinité et de la sélectivité des protéines de ciblage, les bioconjugués reconnaissent les protéines marqueurs à la surface des cellules cancéreuses et utilisent l’endocytose médiée par le récepteur pour atteindre l’intérieur de la cellule. Le système de transport vésiculaire intracellulaire délivre finalement les bioconjugués aux lysosomes, où la protéolyse sépare les médicaments cytotoxiques libres du noyau protéique des bioconjugués, déclenchant la mort des cellules cancéreuses dépendantes des médicaments. À l’heure actuelle, plusieurs bioconjugués protéiques sont approuvés pour le traitement du cancer et un grand nombre d’entre eux sont en cours de développement ou d’essais cliniques.

L’un des principaux défis dans la génération des bioconjugués est une fixation spécifique du médicament cytotoxique à la protéine cible. Ces dernières années ont apporté d’énormes progrès dans le développement de stratégies chimiques et enzymatiques pour la modification des protéines avec des médicaments cytotoxiques. Nous présentons ici les protocoles détaillés pour l’incorporation spécifique au site d’ogives cytotoxiques dans des protéines de ciblage à l’aide d’une méthode chimique utilisant la chimie maléimide-thiol et d’une approche enzymatique qui repose sur la ligature médiée par la sorte A. Nous utilisons une variante modifiée du facteur de croissance des fibroblastes 2 et une région cristallisable fragmentaire de l’immunoglobuline G humaine comme protéines de ciblage exemplaires, ainsi que la monométhylauristatine E et le méthotrexate comme médicaments cytotoxiques modèles. Toutes les stratégies décrites permettent de générer très efficacement des conjugués cytotoxiques biologiquement actifs d’architecture moléculaire définie avec un potentiel de traitement sélectif de divers cancers.

Introduction

Des décennies d’efforts scientifiques ont permis de faire progresser considérablement nos connaissances sur les mécanismes moléculaires qui régissent le développement et la progression du cancer. Dans le même temps, les possibilités thérapeutiques sont encore largement limitées en raison des effets indésirables des médicaments causés par leur manque de sélectivité, la grande variabilité des tumeurs et la résistance aux médicaments développée après un traitement prolongé. Ces dernières années, les thérapies anticancéreuses ciblées ont attiré l’attention en tant qu’approches nouvelles et très prometteuses pour le traitement de diverses ....