Article de méthode

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

DOI :

10.3791/62062

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2 février 2021

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1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

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Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Résumé

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L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.

Introduction

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La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules ....

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Protocole

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Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux du Réseau universitaire de santé et exécutées conformément aux lignes directrices et aux règlements établis par le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Injection stéréotaxique

  1. Couples de rats Sprague-Dawley femelles adultes (250-280 g) dans des cages avec litière en bois et accès ad lib à la nourriture et à l’eau. Maintenir la colonie animale dans un cycle clair/sombre régulier de 12 h (lumières à 06h30) avec une température et une humidité constantes.
  2. Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV directement au SNpc sur le c....

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Résultats

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En appliquant les méthodes ci-dessus au tissu cérébral collecté 6 semaines après les injections d’AAV, nous avons démontré que l’injection stéréotaxique d’AAV exprimant le mutant A53T α-syn (AAV-A53T) dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques par rapport à l’injection d’AAV vectoriel vide (AAV-EV) comme contrôle(Figure 5A,B). Le nombre moyen de neurones/mmTH-positifs 2 dans le SNpc des rats injec.......

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Discussion

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L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou semi-quantitatives seules.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne font état d’aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier tout le personnel de l’Installation avancée de microscopie optique (AOMF) du Réseau universitaire de santé pour leur temps et leur aide dans l’élaboration de ce protocole.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps A-SynThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 Anticorps secondaireThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 Anticorps secondaireThermoFisher ScientificA-28180
Alcalin phosphatase conjuguée anti-lapinigG Jackson Immuno111-055-144
Laboratoire de vecteursIgG anti-souris biotinylésBA-9200
Sérum bovin AlbumineSigmaA2153
DAKO Médium de mouting fluorescent AgilentS3023
HALO&trade ;Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB Substrat de peroxydaseVector LabsSK-4105
LSM880 Microscope confocalZeiss
NeuNAnticorps MilliporeMAB377
Sérum de chèvre normalVector Labs S-1000-20
OCTTissue-Tek
ParaformaldéhydeBioShopPAR070.1
Microtome coulissantLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SucroseBioShopSUC700
TH AnticorpsThermoFisher ScientificP21962
VectaMount support de montageVector LabsH-5000
Substrat de phosphatase alcaline VectorLabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen Blue SoftwareZeiss

Références

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  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fra....

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Mots-clés

Parkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

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