Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde¹ et la cardiomyopathie représente la troisième cause de décès liés au cœur². La cardiomyopathie est un groupe collectif de maladies qui affectent les muscles cardiaques. Les développements récents des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et la différenciation dirigée des cellules iPS vers les cardiomyocytes (PSC-CMs) ont ouvert la porte à l’étude des cardiomyocytes avec le génome du patient comme modèle in vitro de cardiomyopathie. Ces cellules peuvent être utilisées pour comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques, pour élucider leurs mécanismes moléculaires, et pour tester différents candidats thérapeutiques^3. Il y a une énorme quantité d’intérêt, ainsi, des cellules iPS dérivées du patient ont été générées (par exemple, cardiomyopathie hypertrophique [HCM]^4,5,cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène [ARVC]^6,cardiomyopathie dilaté [DCM]^7,et cardiomyopathies liées aux mitochondries^8,9). Puisque l’une des caractéristiques de la cardiomyopathie est le dysfonctionnement et la perturbation des sarcomères, un outil valide qui mesure uniformément la fonction sarcomere est nécessaire.

Le raccourcissement des sarcomères est la technique la plus largement utilisée pour évaluer la fonction des sarcomères et la contractilité des cardiomyocytes adultes dérivés de modèles animaux et d’humains. Pour effectuer le raccourcissement sarcomère, des sarcomères bien développés qui sont visibles sous contraste de phase sont nécessaires. Cependant, psc-CMs cultivé in vitro montrent des sarcomères sous-développés et désorganisés et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés pour mesurer correctement sarcomere raccourcissement¹⁰. Cette difficulté à évaluer correctement la contractilité des PSC-GC entrave leur utilisation comme plate-forme pour évaluer les fonctions cardiaques in vitro. Pour évaluer indirectement la contractilité psc-CMs, la microscopie à force atomique, les réseaux de micro-poteaux, la microscopie de force de traction et les mesures d’impédance ont été utilisés pour mesurer les effets du mouvement exercé par ces cellules sur leur environnement^11,12,13. Des enregistrements de microscopie vidéo plus sophistiqués et moins invasifs du mouvement cellulaire réel (par exemple, SI8000 de SONY) peuvent être utilisés pour évaluer alternativement leur contractilité, cependant, cette méthode ne mesure pas directement le mouvement sarcomère ou la cinétique de génération de force^14.

Pour mesurer directement le mouvement des sarcomères dans les GC-PSC, de nouvelles approches, telles que le marquage fluorescent de la protéine sarcomère, émergent. Par exemple, Lifeact est utilisé pour étiqueter l’actine filamenteuse (F-actine) pour mesurer le mouvement sarcomère^15,16. Les cellules iPS génétiquement modifiées sont une autre option pour marquer les protéines sarcomères (par exemple, α-actinine [ACTN2] et myométsine-2 [MYOM2]) par la protéine fluorescente^17,18,19.

Dans cet article, nous décrivons comment effectuer l’imagerie time-lapse pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à l’aide de Myom2-TagRFP (cellules souches embryonnaires [ES] de souris) et d’ACTN2-mCherry (cellules iPS humaines). Nous montrons également qu’une culture à motifs facilite l’alignement des sarcomères. En outre, nous décrivons une méthode alternative de étiquetage sarcomere, utilisant les virus adeno-associés (AAVs), qui peuvent être largement appliqués aux cellules patient-dérivées d’iPS.

1. Différenciation des cellules souches pluripotentes de souris

1. Entretien des cellules ES de souris
   1. Milieu d’entretien : Mélanger 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 5 mL de L-alanine-L-glutamine, 5 mL d’acide aminé non essentiel (NEAA), 5 mL de pyruvate de sodium 100 mM et 909 μl de 55 mM de 2-mercaptoéthanol avec 450 mL de milieu essentiel minimum de Glasgow (GMEM). Supplément facteur inhibiteur de la leucémie (FRV), CHIR-99021 et PD0325901 à une concentration finale de 1000 U/mL, 1 μM et 3 μM, respectivement. Stériliser le milieu à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
   2. Milieu FBS : Mélanger 55 mL de FBS, 5,5 mL de L-alanine-L-glutamine, 5,5 mL de pyruvate de sodium et 5,5 mL de NEAA à 500 mL de glucose riche en milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco. Filtrer le milieu à travers un filtre de 0,22 μm pour le stériliser.
   3. Culture SMM18 souris ES cellules dans lesquelles TagRFP a été frappé dans le locus Myom2 sur un plat gélatinisé de 6 cm dans un milieu d’entretien comme décrit précédemment^18. Passage tous les 2-3 jours.
2. Préparation du milieu de différenciation sans sérum (DFC)
   1. DFC basale : Mélanger 250 mL de F-12 de Jambon, 750 mL de Milieu modifié de Dulbecco d’Iscove (IMDM), 10 mL de supplément de B27 moins vitamine A, 5 mL de supplément de N2, 10 mL de L-alanine-L-glutamine, 5 mL d’albumine sérique bovine à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 10 mL de pénicilline et de streptomycine (10 000 U/mL). Filtrer à travers la passoire de 0,22 μm pour stériliser.
   2. Dissoudre l’acide ascorbique à 5 mg/mL dans de l’eau distillée et filtrer à travers une passoire de 0,22 μm pour stériliser.
   3. Diluer 13 μL de 1-thioglycérol à 1 mL de GDMI. Ici, se référer à ce 1-Thioglycérol dilué comme MTG.
   4. Ajouter 10 μL d’acide ascorbique (5 mg/mL) et 3 μL de MTG à 1 mL de DFC basale le jour de l’utilisation. Dans ce document, on appelle ce mélange un DFC complet.
3. Jour 0, formation du corps embryoïde (EB) pour la différenciation
   1. Récoltez les cellules ES de souris SMM18 avec une protéase recombinante de type trypsine (rTrypsine) et comptez les cellules.
   2. Centrifuger 5 x 10⁵ cellules à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, remettre en suspension dans 10 mL de DFC complet et ensemencer dans une boîte de Pétri de 10 cm. Culturer les cellules à 37 °C et 5 % de_CO2 pendant 50 h.
4. Jour de différenciation 2
   1. Ajoutez l’activine A, le facteur de croissance endothélial vasculaire humain (hVEGF), et la protéine morphogénétique 4 d’os (BMP4) pour compléter SFD à une concentration finale de 5 ng/mL, de 5 ng/mL, et de 1.9 ng/mL, respectivement.
      REMARQUE: Les concentrations de BMP4 peuvent différer selon le lot de BMP4. Tester plusieurs concentrations dans un essai à petite échelle avant d’utiliser un nouveau lot et déterminer la meilleure concentration pour la différenciation cardiaque.
   2. Transférer les EBs d’une boîte de Petri dans un tube de 15 mL et centrifuger à 50-100 x g pendant 3 min à 4 °C.
   3. Pendant ce temps, ajouter le milieu préparé à l’étape 1.4.1 à la boîte de Pétri pour protéger les EBs restants étant secs.
   4. Aspirer le surnageant du tube de 15 mL, remettre en suspension les BE avec le milieu dans la boîte de Petri et transférer la solution EB dans la boîte. Ensuite, cultivez les EBs à 37 °C et 5% de_CO2 pendant 46 h.
5. Jour de différenciation 4
   1. Gélatiniser un plat de 10 cm traité par culture tissulaire avec 5 à 10 mL de gélatine à 0,1 % pendant au moins 5 minutes. Aspirer la gélatine juste avant d’ensemencer les cellules.
   2. Milieu de préparation : Mélanger le facteur de croissance de base des fibroblastes (bFGF), le FGF10 et le hVEGF pour compléter la DFC à des concentrations finales de 5 ng/mL, 25 ng/mL et 5 ng/mL, respectivement. Pour un plat de 10 cm, préparer 10 ml.
   3. Transférer les cellules de la boîte de Pétri vers un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de PBS à la boîte de Petri, laver plusieurs fois et transférer dans le tube de 15 mL pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger à 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
   4. Aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de rTrypsine et incuber à 37 °C pendant 3 min.
   5. Vortex brièvement pour dissocier les EBs, ajouter 9 mL de milieu de 10% FBS, vortex à nouveau, et compter les cellules.
   6. Centrifuger 1,5 x 10⁷ cellules à 300 x g, 4 °C pendant 3 min, remettre en suspension avec le support préparé à l’étape 1.4.2, et ensemencer dans le plat gélatinisé. Incuber à 37 °C et 5 % de_CO2 pendant 2 jours.
      REMARQUE : Au jour 7 ou 8, on peut observer des passages à tabac importants des GC-PSC.
6. Sélection du médicament aux jours de différenciation 7 et 9 : Réintéressez le milieu avec de la puromycine (2 μg/mL à la concentration finale) pour éliminer les non-cardiomyocytes aux jours 7 et 9 de la différenciation.
   REMARQUE: La lignée parentale de SMM18 est syNP4 souris ES cellules, hébergeant ncx1 promoteur-conduit puromycine-gène^{résistant 20.}
7. Jour 10, replate pour de futures expériences
   1. Enrobez une plaque de culture à fond de verre ou une parabole d’imagerie de 35 mm contenant une lamelle en polymère avec de la gélatine à 0,1 %. Pour améliorer la maturation, enrobez les plats d’un fragment de laminine-511 E8 (LN511-E8) à 1 μg/cm² pendant 30 à 60 min à température ambiante^{de 18}. Pour faire de la culture psc-CMs dans des modèles d’intérêt spécifiques, veuillez vous référer aux étapes 4 et 5 pour la préparation des timbres de polydiméthylsiloxane (PDMS).
   2. Pour récolter SMM18 PSC-CMs, laver la vaisselle deux fois avec du PBS, appliquer 1 mL de rTrypsine et incuber 3 min à 37 °C.
   3. Recueillir des cellules dans 9 mL de 10% fbs milieu, suspendre, et compter les cellules. Plaquer les cellules à 50 000-100 000 cellules dans un puits d’une plaque de 24 puits ou 250 000 à 500 000 cellules dans une boîte d’imagerie de 35 mm.
   4. Centrifuger un nombre suffisant de cellules (300 x g, 3 min) et ressusciter les cellules avec SFD complet complété avec FBS (concentration finale à 10%).
   5. Incuber pendant la nuit et changer le milieu de culture pour compléter sfd avec la puromycine.
   6. À partir du jour 14, changez le milieu de culture deux à trois fois par semaine avec sfd complet jusqu’au jour 21-28, quand Myom2-RFP devient important. Pour la transduction à base d’AAV de protéines sarcomères marquées par fluorescence, veuillez vous référer à l’étape 3.

2. Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines

1. Préparation des milieux de différenciation
   1. RPMI+B27-Ins : mélanger 500 mL de milieu RPMI 1640, 10 mL de B27 moins insuline et 5,25 mL de L-alanine-L-glutamine.
   2. RPMI+B27+Ins : mélanger 500 mL de RPMI, 10 mL de supplément de B27 et 5,25 mL de L-alanine-L-glutamine.
2. Entretien des cellules iPS humaines
   1. Passage des cellules iPS humaines deux fois par semaine avec AK02N sur LN511-E8 suivant la méthode précédemment publiée avec quelques modifications²¹.
   2. Récoltez les cellules avec un traitement de 3 minutes de rTrypsine et collectez-les dans un milieu FBS à 10%. Compter les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Ensemencez 75 000 à 125 000 cellules dans un puits de 6 plaques de puits avec 2 mL d’AK02N complétés par LN511-E8 et Y27632à la concentration finale de 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2) et 10 μM, respectivement.
   3. Incuber à 37 °C et 5 % de_CO2 et remplacer le milieu le lendemain par 2 mL d’AK02N sans aucun supplément. Changez de média tous les deux ou trois jours et passez tous les trois ou quatre jours.
3. Jour -4: replaque avant la différenciation
   1. Enrober une plaque de 6 puits avec 0,5 μg/cm² de LN511-E8 dilué dans du PBS. Ensuite, incuber pendant au moins 30 min à 37 °C et 5 % de_CO2 ou 1 h à température ambiante. Solution de revêtement aspirée juste avant l’ensemencement des cellules.
   2. Récoltez des cellules iPS humaines avec de la rTrypsine et comptez les cellules comme à l’étape 2.2.2.
   3. Centrifuger 1,25 x^{10 5} cellules pour un puits d’une plaque à 6 puits à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et remise en suspension dans 2 mL d’AK02N complété par LN511-E8 (concentration finale 0,5 μg/mL ou 0,1 μg/cm2) et Y27632 (concentration finale 10 μM) par puits.
   4. Aspirer la solution d’enrobage, remettre les graines en suspension dans la plaque enrobée et incuber à 37 °C et 5 % de_CO2.
4. Jours -3 et -1: remplacer le milieu par 2 mL d’AK02N.
5. Jour 0 : Remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27-Ins complétés par CHIR99021 (concentration finale de 6 μM) par puits pour commencer la différenciation.
6. Jour 2 : Remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27-Ins par WntC59 (concentration finale de 2 μM) par puits.
7. Jour 4: Remplacez le milieu par 2 mL de RPMI + B27-Ins par puits.
8. Jour 7 et jour 9 : remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27+Ins par de la puromycine (concentration finale de 10 μg/mL) par puits pour culture sélective de PSC-GC.
   REMARQUE: La lignée ACTN2-mCherry, utilisée dans cette étude, a une cassette de site d’entrée ribosomique interne (IRES), un gène résistant à la puromycine inséré dans la région 3′-non traduite (UTR) du locus TNNT2, et mCherry remplaçant le codon stop d’ACTN2. Pour purifier les cardiomyocytes sans knock-in, veuillez vous référer aux étapes 3 et 4.
9. Jour 10: replate pour de futures expériences
   1. Enrober une parabole d’imagerie de 35 mm d’une lamelle en polymère avec 0,5-1 μg/cm² de LN511-E8 dilué dans de la gélatine à 0,1 %. Incuber 2-4 h à température ambiante pour la viabilité à long terme. Pour culture PSC-CMs dans les modèles souhaités, reportez-vous aux étapes 4 et 5 pour préparer les timbres PDMS.
   2. Pour récolter des PSC-MC humains, laver la vaisselle deux fois avec du PBS, appliquer 1 mL de rTrypsine par puits et incuber 3 min à 37 °C.
   3. Recueillir des cellules dans 4 mL de 10% fbs milieu, suspendre, et compter les cellules. Plaque 250 000-500 000 cellules par parabole d’imagerie de 35 mm.
   4. Centrifuger un nombre suffisant de cellules à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, les ressusciter avec RPMI+B27+Ins avec de la puromycine (10 μg/mL) et plaquer sur la boîte d’imagerie de 35 mm enrobée.
   5. Incuber pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez le milieu de culture par rpmi+B27+Ins par de la puromycine (10 μg/mL).
   6. À partir du jour 14, changez de milieu de culture 2 à 3 fois par semaine avec RPMI+B27+Ins jusqu’au jour 21-28 pour l’imagerie. Pour la transduction à base d’AAV de protéines sarcomères marquées par fluorescence, veuillez vous référer à l’étape 3.

3. Étiquetage fluorescent des sarcomères à l’aide de virus adéno-associés

1. Préparation avant la production d’AAV
   1. Maintenir les cellules HEK293T dans le DMEM complété avec fbs (concentration finale 10%) sur une plaque de culture de tissu de 10 cm. Cellules de passage trois fois par semaine.
   2. Préparer la polyéthylénimine (Î.-P.-É.) à 1 mg/mL. Mélanger 50 mg de polyéthylénimine MAX 40000 et 40 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 7,0 en utilisant 1 N NaOH. Ensuite, faites le volume final à 50 mL avec de l’eau ultrapure et filtrez à travers une passoire de 0,22 μm.
   3. Préparer un vecteur navette avec un gène de coloration sarcomère (p. ex. TCAP ou PDLIM3 fusionné avec une protéine fluorescente verte [GFP]), entraîné par un promoteur spécifique aux cardiomyocytes, tel que la troponine cardiaque T (cTNT)^22.
      REMARQUE: Pour cette instance, nous avons utilisé GFP amélioré monomère avec des mutations de V163A, S202T, L221V²³.
2. Jour 0, passage des cellules HEK
   1. Lorsque les cellules atteignent la confluence, passagez 2,0 x 10⁷ cellules HEK293T vers une plaque de culture tissulaire de 15 cm avec 20 mL de DMEM avec 10% FBS.
3. Jour 1, transfection
   1. Mélanger 13,5 μg du vecteur navette, 26 μg de pHelper (un vecteur codant E2A, E4 et VA de l’adénovirus), 16,5 μg de pRC6 (un vecteur codant les gènes AAV2 Rep et AAV6 Cap) et 1 mL de DMEM sans pyruvate de sodium (DMEM-Pyr).
   2. Mélanger 224 μL d’Î.-P.-É. (1 mg/mL, préparé à l’étape 3.1.2) et 776 μL de DMEM-Pyr.
   3. Mélanger et incuber la solution plasmidique et la solution PEI à température ambiante pendant 30 min.
   4. Ajouter la solution plasmidique/PEI aux cellules HEK293T préparées à l’étape 3.2.
4. Jour 2, changement moyen
   1. À 24 h après la transfection, changer de milieu en DMEM-Pyr. Cellules de culture jusqu’à la récolte de l’AAV le jour 7. L’AAV sera diffusée dans les médias culturels.
5. Jour 7, collecte de l’AAV, concentration et substitution de tampons à l’aide de la méthode de purification minimale²⁴
   1. Incuber une unité d’ultrafiltration centrifuge (seuil de poids moléculaire de 100 k [MWCO]) avec 5 mL de BSA à 1 % dans du PBS à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, centrifuger l’unité d’ultrafiltration à 500 x g pendant 2 min et aspirer à la fois les solutions filtrées et restantes.
   2. Transférer le milieu de la parabole de 15 cm qui a produit l’AAV vers un nouveau tube conique et une nouvelle centrifugeuse de 50 ml (500 x g, 5 min). Filtrer le surnageant à travers une passoire de seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires et appliquer une suspension sur l’unité d’ultrafiltration.
   3. Centrifuger à 2000 x g pendant 90 min ou jusqu’à la concentration du surnageant de culture de 0,5 à 1 mL.
   4. Aspirer le filtrat et appliquer 15 mL de PBS sur l’unité d’ultrafiltration.
   5. Répéter la centrifugation jusqu’à ce que le concentré devienne de 0,5 à 1 mL.
   6. Répéter les 3.5.4 et 3.5.5.
   7. Transférer l’AAV concentré dans un nouveau tube de 1,5 mL et le conserver à 4 °C ou -20 °C.
      REMARQUE: AAV peut être utilisé dans les installations P1, mais suivre les règles et règlements locaux. L’AAV peut également être produit par des méthodes conventionnelles.
6. Calcul du titre AAV
   1. Mélanger 5 μL d’AAV, 195 μL de DMEM-Pyr et 10 U de benzonase et incuber à 37 °C pendant 1 h.
   2. Ajouter 200 μL de tampon protéinase K (0,02 M Tris HCl et 1 % SDS) et 5 μL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber à 37 °C pendant 1 h.
   3. Préparer soigneusement 400 μL d’une solution de phénol/chloroforme/alcool isoamylique à 25:24:1, vortex pendant 1 min et centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min.
   4. Transférer 200 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL, qui produira environ la moitié des génomes originaux de l’AAV.
   5. Ajouter 1 μL de glycogène (20 mg/mL) à 20 μL de 3 M_CH3COONa (pH 5,2) et de vortex. Ajouter à nouveau 250 μL de 2-Propanol à 100 μL d’éthanol à 100 % et de vortex.
   6. Incuber à -80 °C pendant 15 min. Centrifuger ensuite à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
   7. Aspirez le surnageant et ajoutez 70% d’éthanol au tube. Ensuite, centrifuger à 20 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
   8. Aspirez le surnageant et séchez à l’air jusqu’à ce que le culot devienne clair.
   9. Ajouter 200 μL d’acide tris-éthylènediaminetétraacétique (TE; pH 8,0) pour résoudre les génomes de l’AAV. Ensuite, diluez l’échantillon 100 fois avec TE.
   10. Préparer une norme avec pAAV-CMV-Vector à 6,5 ng/μL avec TE pour obtenir 10⁹ génomes vectoriels (vg)/μL. Ensuite, faire une série de dilution 10 fois de 10⁴ à 10⁸ avec TE.
   11. Mélanger 1 μL d’ADN d’échantillon (ou les étalons), 0,4 μL d’amorces (5 μM), 3,6 μL d’eau distillée et 5 μL de mélange maître SYBR Green. Les amorces, situées sur ITR, sont 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ et 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
   12. Effectuer une PCR en temps réel à la condition suivante: Dénaturement initial à 95 °C pendant 60 s, 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, et recuit et extension à 60 °C pendant 30 s, suivis d’une courbe de fusion.
   13. Sur la base des normes et des valeurs Ct, une machine PCR en temps réel fournit le numéro de copie du génome vectoriel dans 1 μL d’un échantillon. Calculer le titre original de l’AAV à l’aide de l’équation suivante : un nombre de copies fourni par PCR en temps réel (vg/μL) x 8 x 10³ x 2, dans lequel 8 x 10³ comme facteur de dilution pendant l’isolement du génome de l’AAV, et 2 comme facteur de différence de l’AAV (simple brin) et du plasmide (double brin).
7. Transduction aux GC-PSC
   1. Comptez psc-CMs dans un puits supplémentaire ou un plat supplémentaire.
   2. Diluer les AAV (1 x 10⁴ à 1 x 10⁶ vg/cellule) pour obtenir 50 μL avec du PBS. Appliquer des VQA à la multiplicité d’infection (MOI) de 1 x 10 4 ๠x 10⁶ vg/cellule aux GC-PSC et aux GC-GC de culture pendant 3 jours avec AAV dans le milieu de différenciation correspondant pour la souris et les GC-GC-PSC humains, puis changer le milieu en milieu de culture sans VAA.
   3. Utilisez PSC-CMs pour l’imagerie à cellules vivantes après 7 jours ou plus après la transduction.

4. Purification [facultative] basée sur l’AAV des GC-PSC

1. Préparation de l’AAV
   1. Préparer l’AAV comme décrit à l’étape 3 à l’aide d’un vecteur navette exprimant un gène résistant à la blasticidine sous le contrôle du promoteur cTNT.
2. Transduction en cellules iPS différenciantes
   1. Différenciez les cellules iPS humaines pendant 4 jours en suivant le protocole décrit à l’étape 2 et comptez le nombre de cellules dans un puits supplémentaire.
   2. Après avoir changé de support au jour 4, appliquez des AAV au MOI de 1 x 10⁵ vg/cellule pour différencier les PSC dans les supports RPMI+B27-Ins.
   3. Au jour 7, rafraîchissez le milieu avec RPMI+B27+Ins et ajoutez 2,5 à 10 μg/mL de blasticidine.
   4. Au jour 10, psc-CMs sont prêts à replate.

5. Préparation des timbres PDMS

1. Concevez le modèle d’appareil de bandes de 200 μm ainsi que des rainures de 10 à 25 μm entre les bandes à l’aide d’un logiciel de dessin de conception assistée par ordinateur (CAO).
2. Dessinez le motif des appareils sur un photomasque au chrome recouvert d’AZP1350 à l’aide de la lumière UV d’un outil de lithographie sans masque.
3. Développer le motif sur le photomasque dans une série de révélateurs de photorésine positifs (p. ex. chrome etchant) et rincer à l’eau DI.
4. Déshydrater une plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 120 °C pendant 15 min.
5. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante et faire tourner une photorésine négative SU-8 3010 pour faire une hauteur de 10-20 μm avec 1500 rpm pendant 30 s à l’aide d’un spin-coater.
6. Cuire doucement la plaquette en deux étapes sur une plaque chauffante selon le protocole du fabricant.
7. Une fois la plaquette refroidie à température ambiante, chargez la plaquette sur l’aligneur de masque.
8. Utilisez un aligneur de masque pour aligner le masque sur la plaquette et exposer la plaquette à la lumière UV.
9. Effectuer la cuisson post-exposition à la plaquette en deux étapes sur une plaque chauffante conformément au protocole du fabricant.
10. Développez la plaquette dans une série de développeur SU-8 et de 2-Propanol, puis séchez la plaquette avec un flux d’azote.
11. Transférer la plaquette dans une boîte de Pétri d’une taille appropriée.
12. Mélanger l’élastomère PDMS et son agent de durcissement dans un rapport de 10:1 p/p et verser le mélange dans la boîte de Pétri.
13. Dégazer le PDMS dans un dessicateur jusqu’à ce que toutes les bulles d’air disparaissent, puis durcir le PDMS sur plaque chauffante à 80 °C pendant 2 h.
14. Décollez le PDMS durci du moule maître à l’aide d’une pince à épiler, puis découpez la partie avec le dessin pour être un tampon PDMS.
    Remarque : la forme peut être carrée, toutefois, une forme octogonale transfère le motif mieux sur le bord.

6. Culture à motifs de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes

1. Enlever la poussière de la surface des timbres PDMS à l’aide de ruban adhésif.
2. Submergez les timbres dans de l’éthanol à 70% pour les stériliser. Ensuite, soufflez l’éthanol de la surface des timbres à l’aide d’un duster à air.
3. Appliquer 5 à 10 μL de polymère/éthanol à 0,5 % en poids de 2-méthacryloyloxyéthyl phosphorylcholine (MPC) sur la surface des estampes PDMS.
   REMARQUE: La distribution inégale du polymère MPC peut provoquer un modèle perturbé.
4. Incuber 10-30 min jusqu’à ce que le polymère MPC soit complètement séché.
5. Placez les timbres en contact avec les lamelles d’une plaque de culture à fond de verre ou d’une parabole d’imagerie de 35 mm avec une lamelle en polymère et mettez un poids (p. ex. une batterie AAA) sur l’estampille pendant 10 min.
6. Retirez le poids et les timbres. Ensuite, confirmez que le motif a été transféré au microscope.
   REMARQUE: Les assiettes / plats estampillés peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine à température ambiante.
7. Lavez les puits/plats estampillés avec du PBS deux fois.
8. Diluer LN511-E8 avec du PBS à 2-4 μg/mL et enduire la parabole avec LN511-E8 à 0,5-1 μg/cm^2. Pour les PSC-CMs humains, diluer LN511-E8 avec une solution de gélatine à 0,1% au lieu de PBS. Ensuite, incuber pendant au moins 1 h (de manière optimale, plus de 4 h).
9. Cellules de plaque comme décrit dans les sections précédentes.

7. Imagerie en accéléré des sarcomères au microscope fluorescent

1. Allumez et connectez le microscope, l’ordinateur associé et tous les périphériques requis.
2. Pour effectuer une imagerie time-lapse, capturez des images time-lapse avec le grossissement le plus élevé (objectif 100X avec émersion d’huile).
3. Sélectionnez les conditions d’imagerie en direct. Pour obtenir de bonnes données représentatives, essayez de vous ajuster à la fréquence d’images la plus élevée (un minimum de 20 ms ou 50 images par seconde est recommandé). Réglez l’obturateur ouvert et appliquez un binning nécessaire (4 X 4) et un recadrage de la zone d’acquisition pour obtenir les intervalles les plus courts entre les images pendant l’imagerie time-lapse.
   REMARQUE: Le réglage peut varier en fonction des configurations des microscopes. La caméra doit être haute sensibilité et est capable de transférer les données vers le PC connecté assez rapidement. À cette fin, nous avons utilisé le flash ORCA avec Camera-link. Nous avons testé une microscopie confocale tournante et avons acquis des images à 400 images par seconde.
   1. [Facultatif] Si le taux de battement des cellules est faible, évoquez les cellules par stimulation du champ électrique.
4. Exécuter l’enregistrement time-lapse
   1. Assurez-vous que les champs images restent au point pendant l’enregistrement de l’image time-lapse.
   2. Enregistrez les images time-lapse dans un dossier approprié.

8. Analyse de l’imagerie time-lapse à l’aide de SarcOptiM, un plugin ImageJ / Fiji

1. Chargez une série d’images time-lapse dans ImageJ. Pour le format Olympus VSI, ouvrez les fichiers via OlympusViewer Plugin.
2. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour observer clairement le motif sarcomere (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste).
3. Pour ouvrir SarcOptiM, cliquez sur le menu Autres outils (>>) et sélectionnez SarcOptiM.
4. Calibrez le programme en appuyant sur Ctrl + Maj + P et le bouton 1 μm dans la barre d’outils et en suivant les instructions des boîtes de dialogue.
5. Tracez une ligne à travers la région du sarcomere qui sera utilisée pour mesurer le raccourcissement du sarcomère.
6. Démarrez l’analyse de raccourcissement sarcomere en appuyant sur SingleCell (AVI) dans la barre d’outils. Les données représentatives sont présentées à la figure 1 et à la figure 2.

Mesure du raccourcissement sarcomère à l’aide de lignes de rapporteur PSC-CMs knock-in. Des PSC-CMs sarcomere-marqués ont été utilisés pour mesurer le rapetissement sarcomere. Les lignes expriment Myom2-RFP et ACTN2-mCherry à partir de loci endogènes. TagRFP a été inséré dans Myom2, codant des protéines M qui se localisent à la ligne M, tandis que mCherry a été frappé à ACTN2, codant α-Actinine, qui se localise à la ligne Z18,25. Des images time-lapse ont été obtenues et utilisées pour déterminer le raccourcissement sarcomere comme présenté dans les figures 1 et 2 et le film 1-3.

Pour surmonter le sarcomere désorganisé des GC-PSC, des timbres PDMS spécifiques ont été utilisés pour la culture des GC-GC dans le motif de répartition. Cette culture à motifs a favorisé une forme de cellule allongée et un motif sarcomère plus organisé par rapport aux cellules cultivées dans la zone non-motif(figures 2B et 2C). Avec cet avantage, la culture à motifs a favorisé une meilleure contraction des cellules et a fourni un profil de longueur sarcomère lisse comme le montrent les films 2 et 3 et la figure 2D.

Marquage fluorescent de la protéine Z-line à l’aide de vecteurs AAV. Pour visualiser la ligne Z de PSC-CMs sans générer de cellules iPS knock-in, des protéines de Z-line fluorescent-marquées ont été exprimées utilisant la transduction d’AAV. Deux des petites protéines de la lignée Z, téléthonine (TCAP) et protéine LIM associée à l’actine (PDLIM3) avec GFP, ont été marquées et emballées à l’aide de la capside AAV6(figure 3A). Une fois que les PSC-MC ont été différenciés et purifiés, les VQA ont été transduites en GC-PSC(figure 3B). Les PSC-GC transductés ont exprimé des signaux GFP sarcomériques le long des GC-PSC dès trois jours après la transduction(figures 3C et 3D). Typiquement, la transduction de l’AAV à un MOI de 105 vg/cellule est suffisante pour visualiser les protéines sarcomères fluorescent-marquées et un titre plus élevé peut causer la localisation non spécifique de GFP au cytoplasme bien qu’il augmente l’intensité globale de GFP.

Purification de PSC-CMs à l’aide de vecteurs AAV. Les méthodes actuelles reposent sur la cassette de sélection des médicaments qui se trouve déjà sur le génome des GC-PSC, qu’elle soit transgénique ou en ligne de knock-in. Cependant, il est laborieux de produire une telle ligne à partir de cellules iPS dérivées du patient. Comme il a été démontré que les vecteurs AAV stimulent l’expression de protéines Z-line marqués par fluorescence sans avoir besoin de knock-in, nous avons cherché à établir la méthode de purification sans knock-in(Figure 4). À cette fin, un nouveau vecteur AAV, qui code pour le gène résistant à la blasticidine sous le contrôle du promoteur cTNT, a été construit(figure 4A). L’AAV (MOI de 105 vg/cellule) a été transduite pour différencier les cellules humaines d’iPS au jour 4. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 2,5 à 10 μg/mL de blasticidine (besoin de titrer pour chaque lignée cellulaire) entre les jours 7 et 9(figure 4B). Au jour 14, la pureté des GC-PSC était supérieure à 90 %(figure 4C).

Figure 1: Raccourcissement de Sarcomere de la souris PSC-CMs dérivé de la lignée cellulaire Myom2-TagRFP. A. Chronologie de la différenciation PSC-CM de la souris. B. Images représentatives pour le raccourcissement des sarcomères dans différents points temporels avec des régions de mesure indiquées par des barres jaunes. Barre d’échelle = 10 μm. C. Profil de longueur de Sarcomere pendant la contraction des cardiomyocytes qui a été stimulée avec de l’électricité à 1 hz. Le framerate était de 50 images par seconde. La taille de pixel était de 0,26 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Données représentatives montrant le raccourcissement sarcomère des PSC-MC humains dérivés de la lignée cellulaire ACTN2-mCherry en culture non modelée et à motifs. A. La chronologie de la différenciation humaine PSC-CM. B. et les cardiomyocytes de C. cultivés dans des cultures non-modelées montrent les modèles désorganisés de sarcomere (B) tandis que les cultures à motifs favorisent un bon alignement du sarcomere (C). Régions de mesure présentées par des barres jaunes. D. Profils de longueur sarcomère correspondants obtenus lors de la contraction cellulaire induite par stimulation électrique à 0,5 Hz et une fréquence d’images de 100 images par seconde. Taille de pixel = 0,26 μm, barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Souris PSC-CMs après transduction AAV pendant 3 jours. A. Carte vectorielle schématique de l’AAV pour l’étiquetage des sarcomères. Une protéine sarcomère (gène d’intérêt, GOI) est liée à la GFP avec un linker Gly-Gly-Gly-Ser (L) et exprimée sous le contrôle du promoteur de la troponine cardiaque T (cTNT). B. Chronologie de la différenciation PSC-CM de la souris et de la transduction AAV. C. et D. Images représentatives montrant la localisation claire de sarcomere et le profil correspondant de longueur de sarcomere de TCAP-GFP (C) et pdlim3-GFP (D) après 3 jours de transduction dans PSC-CMs généré de la variété de cellule de Myom2-TagRFP. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Purification dela blasticidine des PSC-MC humains sans knock-in. 
A. Carte vectorielle schématique de l’AAV, dans laquelle une cassette de gène de résistance à la blasticidine (BSR) est insérée en aval du promoteur cTNT. B. La chronologie de la différenciation humaine de PSC-CMs, de la transduction, et de la sélection de blasticidin. C. Données représentatives montrant le pourcentage de cellules cTNT + dans les PSC-MC humains (transduissé 105 vg/cellule AAV6 le jour 4, puis traité avec 2,5 μg/mL de blasticidine les jours 7 et 9). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1 : Vidéo time-lapse fluorescente de souris PSC-CMs générée à partir de la lignée cellulaire Myom2-TagRFP. Les signaux de RFP ont montré un modèle de sarcomere après culture de PSC-CM pendant 28 jours. Les cellules ont montré battre synchrone une fois stimulées avec de l’électricité à 1 hertz. Les images time-lapse ont été acquises toutes les 20 ms avec un objectif 100X. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 2: Vidéo en accéléré fluorescente des PSC-MC humains avec ACTN2-mCherry cultivé sur un plat de culture non à motifs. Le PSC-CMs exprimant ACTN2-mCherry sur un plat non-patterned de culture a non seulement montré la désorganisation du sarcomere mais a également présenté une contraction ondulante, pour laquelle il est difficile de déterminer le rapetissement de sarcomere. Les cellules ont été stimulées avec de l’électricité à 0.5 hertz et des images acquises toutes les 10 ms avec un objectif 100X. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 3: Vidéo en accéléré fluorescente des PSC-CMs humains avec ACTN2-mCherry cultivé sur un plat de culture à motifs. La culture à motifs a favorisé l’alignement du sarcomère et a forcé les cellules à une forme de tige. Cette méthode a permis de déterminer plus facilement le raccourcissement du sarcomere dans PSC-CMs. La vidéo a été obtenue en stimulant les cellules avec de l’électricité à 0,5 Hz. Le framerate était de 100 images par seconde. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Fichiers CAO supplémentaires. Fichiers CAO pour la création de timbres avec des bandes de 200 μm de largeur et des rainures de 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf) et 50 μm (Stamp_200x50.dxf). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

H.U. a déposé un brevet lié à ce manuscrit.