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Article de méthode

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

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DOI :

10.3791/62129

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3 mars 2021

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1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette méthode peut être utilisée pour examiner le raccourcissement des sarcomères à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes avec des protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Résumé

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC-MC) peuvent être produits à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites (ES/iPS). Ces cellules fournissent des sources prometteuses pour la modélisation des maladies cardiaques. Pour les cardiomyopathies, le raccourcissement des sarcomères est l’une des évaluations physiologiques standard qui sont utilisées avec les cardiomyocytes adultes pour examiner leurs phénotypes de la maladie. Cependant, les méthodes disponibles ne sont pas appropriées pour évaluer la contractilité de PSC-CMs, car ces cellules ont des sarcomères sous-développés qui sont invisibles sous la microscopie à contraste de phase. Pour résoudre ce problème et pour effectuer le raccourcissement des sarcomères avec psc-CMs, des protéines sarcomères marquées par fluorescence et une imagerie vivante fluorescente ont été utilisées. Les lignes Z minces et une ligne M résident aux deux extrémités et au centre d’un sarcomere, respectivement. Les protéines de la lignée Z — α-actinine (ACTN2), téléthonine (TCAP) et protéine LIM associée à l’actine (PDLIM3) — et une protéine de la lignée M — myomésine-2 (Myom2) — ont été marquées avec des protéines fluorescentes. Ces protéines marquées peuvent être exprimées à partir d’allèles endogènes sous forme de knock-ins ou de virus adéno-associés (AAV). Ici, nous présentons les méthodes permettant de différencier les cellules souches pluripotentes de souris et d’humains en cardiomyocytes, de produire des AAV et d’effectuer et d’analyser l’imagerie en direct. Nous décrivons également les méthodes pour produire des timbres de polydimethylsiloxane (PDMS) pour une culture modelée de PSC-CMs, qui facilite l’analyse du rapetissement de sarcomere avec des protéines fluorescent-marquées. Pour évaluer le raccourcissement sarcomere, des images de time-lapse des cellules battantes ont été enregistrées à un framerate élevé (50-100 images par seconde) sous la stimulation électrique (0.5-1 hertz). Pour analyser la longueur des sarcomères au cours de la contraction cellulaire, les images time-lapse enregistrées ont été soumises à SarcOptiM, un plug-in pour ImageJ/Fiji. Notre stratégie fournit une plate-forme simple pour étudier les phénotypes des maladies cardiaques dans psc-CMs.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde1 et la cardiomyopathie représente la troisième cause de décès liés au cœur2. La cardiomyopathie est un groupe collectif de maladies qui affectent les muscles cardiaques. Les développements récents des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et la différenciation dirigée des cellules iPS vers les cardiomyocytes (PSC-CMs) ont ouvert la porte à l’étude des cardiomyocytes avec le génome du patient comme modèle in vitro de cardiomyopathie. Ces cellules peuvent être utilisées pour comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques, pour élucider leurs mécanismes moléculaires, et pour tester différents candidats thérapeutiques3. Il y a une énorme quantité d’intérêt, ainsi, des cellules iPS dérivées du patient ont été générées (par exemple, cardiomyopathie hypertrophique [HCM]4,5,cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène [ARVC]6,cardiomyopathie dilaté [DCM]7,et cardiomyopathies liées aux mitochondries8,9). Puisque l’une des caractéristiques de la cardiomyopathie est le dysfonctionnement et la perturbation des sarcomères, un outil valide qui mesure uniformément la fonction sarcomere est nécessaire.

Le raccourcissement des sarcomères est la technique la plus largement utilisée pour évaluer la fonction des sarcomères et la contractilité des cardiomyocytes adultes dérivés de modèles animaux et d’humains. Pour effectuer le raccourcissement sarcomère, des sarcomères bien développés qui sont visibles sous contraste de phase sont nécessaires. Cependant, psc-CMs cultivé in vitro montrent des sarcomères sous-développés et désorganisés et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés pour mesurer correctement sarcomere raccourcissement10. Cette difficulté à évaluer correctement la contractilité des PSC-GC entrave leur utilisation comme plate-forme pour évaluer les fonctions cardiaques in vitro. Pour évaluer indirectement la contractilité psc-CMs, la microscopie à force atomique, les réseaux de micro-poteaux, la microscopie de force de traction et les mesures d’impédance ont été utilisés pour mesurer les effets du mouvement exercé par ces cellules sur leur environnement11,12,13. Des enregistrements de microscopie vidéo plus sophistiqués et moins invasifs du mouvement cellulaire réel (par exemple, SI8000 de SONY) peuvent être utilisés pour évaluer alternativement leur contractilité, cependant, cette méthode ne mesure pas directement le mouvement sarcomère ou la cinétique de génération de force14.

Pour mesurer directement le mouvement des sarcomères dans les GC-PSC, de nouvelles approches, telles que le marquage fluorescent de la protéine sarcomère, émergent. Par exemple, Lifeact est utilisé pour étiqueter l’actine filamenteuse (F-actine) pour mesurer le mouvement sarcomère15,16. Les cellules iPS génétiquement modifiées sont une autre option pour marquer les protéines sarcomères (par exemple, α-actinine [ACTN2] et myométsine-2 [MYOM2]) par la protéine fluorescente17,18,19.

Dans cet article, nous décrivons comment effectuer l’imagerie time-lapse pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à l’aide de Myom2-TagRFP (cellules souches embryonnaires [ES] de souris) et d’ACTN2-mCherry (cellules iPS humaines). Nous montrons également qu’une culture à motifs facilite l’alignement des sarcomères. En outre, nous décrivons une méthode alternative de étiquetage sarcomere, utilisant les virus adeno-associés (AAVs), qui peuvent être largement appliqués aux cellules patient-dérivées d’iPS.

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Protocole

1. Différenciation des cellules souches pluripotentes de souris

  1. Entretien des cellules ES de souris
    1. Milieu d’entretien : Mélanger 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 5 mL de L-alanine-L-glutamine, 5 mL d’acide aminé non essentiel (NEAA), 5 mL de pyruvate de sodium 100 mM et 909 μl de 55 mM de 2-mercaptoéthanol avec 450 mL de milieu essentiel minimum de Glasgow (GMEM). Supplément facteur inhibiteur de la leucémie (FRV), CHIR-99021 et PD0325901 à une concentration finale de 1000 U/mL, 1 μM et 3 μM, respectivement. Stériliser le milieu à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    2. Milieu FBS : Mélanger 55 mL de FBS, 5,5 mL de L-alanine-L-glutamine, 5,5 mL de pyruvate de sodium et 5,5 mL de NEAA à 500 mL de glucose riche en milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco. Filtrer le milieu à travers un filtre de 0,22 μm pour le stériliser.
    3. Culture SMM18 souris ES cellules dans lesquelles TagRFP a été frappé dans le locus Myom2 sur un plat gélatinisé de 6 cm dans un milieu d’entretien comme décrit précédemment18. Passage tous les 2-3 jours.
  2. Préparation du milieu de différenciation sans sérum (DFC)
    1. DFC basale : Mélanger 250 mL de F-12 de Jambon, 750 mL de Milieu modifié de Dulbecco d’Iscove (IMDM), 10 mL de supplément de B27 moins vitamine A, 5 mL de supplément de N2, 10 mL de L-alanine-L-glutamine, 5 mL d’albumine sérique bovine à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 10 mL de pénicilline et de streptomycine (10 000 U/mL). Filtrer à travers la passoire de 0,22 μm pour stériliser.
    2. Dissoudre l’acide ascorbique à 5 mg/mL dans de l’eau distillée et filtrer à travers une passoire de 0,22 μm pour stériliser.
    3. Diluer 13 μL de 1-thioglycérol à 1 mL de GDMI. Ici, se référer à ce 1-Thioglycérol dilué comme MTG.
    4. Ajouter 10 μL d’acide ascorbique (5 mg/mL) et 3 μL de MTG à 1 mL de DFC basale le jour de l’utilisation. Dans ce document, on appelle ce mélange un DFC complet.
  3. Jour 0, formation du corps embryoïde (EB) pour la différenciation
    1. Récoltez les cellules ES de souris SMM18 avec une protéase recombinante de type trypsine (rTrypsine) et comptez les cellules.
    2. Centrifuger 5 x 105 cellules à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, remettre en suspension dans 10 mL de DFC complet et ensemencer dans une boîte de Pétri de 10 cm. Culturer les cellules à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 50 h.
  4. Jour de différenciation 2
    1. Ajoutez l’activine A, le facteur de croissance endothélial vasculaire humain (hVEGF), et la protéine morphogénétique 4 d’os (BMP4) pour compléter SFD à une concentration finale de 5 ng/mL, de 5 ng/mL, et de 1.9 ng/mL, respectivement.
      REMARQUE: Les concentrations de BMP4 peuvent différer selon le lot de BMP4. Tester plusieurs concentrations dans un essai à petite échelle avant d’utiliser un nouveau lot et déterminer la meilleure concentration pour la différenciation cardiaque.
    2. Transférer les EBs d’une boîte de Petri dans un tube de 15 mL et centrifuger à 50-100 x g pendant 3 min à 4 °C.
    3. Pendant ce temps, ajouter le milieu préparé à l’étape 1.4.1 à la boîte de Pétri pour protéger les EBs restants étant secs.
    4. Aspirer le surnageant du tube de 15 mL, remettre en suspension les BE avec le milieu dans la boîte de Petri et transférer la solution EB dans la boîte. Ensuite, cultivez les EBs à 37 °C et 5% deCO2 pendant 46 h.
  5. Jour de différenciation 4
    1. Gélatiniser un plat de 10 cm traité par culture tissulaire avec 5 à 10 mL de gélatine à 0,1 % pendant au moins 5 minutes. Aspirer la gélatine juste avant d’ensemencer les cellules.
    2. Milieu de préparation : Mélanger le facteur de croissance de base des fibroblastes (bFGF), le FGF10 et le hVEGF pour compléter la DFC à des concentrations finales de 5 ng/mL, 25 ng/mL et 5 ng/mL, respectivement. Pour un plat de 10 cm, préparer 10 ml.
    3. Transférer les cellules de la boîte de Pétri vers un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de PBS à la boîte de Petri, laver plusieurs fois et transférer dans le tube de 15 mL pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger à 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de rTrypsine et incuber à 37 °C pendant 3 min.
    5. Vortex brièvement pour dissocier les EBs, ajouter 9 mL de milieu de 10% FBS, vortex à nouveau, et compter les cellules.
    6. Centrifuger 1,5 x 107 cellules à 300 x g, 4 °C pendant 3 min, remettre en suspension avec le support préparé à l’étape 1.4.2, et ensemencer dans le plat gélatinisé. Incuber à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 2 jours.
      REMARQUE : Au jour 7 ou 8, on peut observer des passages à tabac importants des GC-PSC.
  6. Sélection du médicament aux jours de différenciation 7 et 9 : Réintéressez le milieu avec de la puromycine (2 μg/mL à la concentration finale) pour éliminer les non-cardiomyocytes aux jours 7 et 9 de la différenciation.
    REMARQUE: La lignée parentale de SMM18 est syNP4 souris ES cellules, hébergeant ncx1 promoteur-conduit puromycine-gènerésistant 20.
  7. Jour 10, replate pour de futures expériences
    1. Enrobez une plaque de culture à fond de verre ou une parabole d’imagerie de 35 mm contenant une lamelle en polymère avec de la gélatine à 0,1 %. Pour améliorer la maturation, enrobez les plats d’un fragment de laminine-511 E8 (LN511-E8) à 1 μg/cm2 pendant 30 à 60 min à température ambiantede 18. Pour faire de la culture psc-CMs dans des modèles d’intérêt spécifiques, veuillez vous référer aux étapes 4 et 5 pour la préparation des timbres de polydiméthylsiloxane (PDMS).
    2. Pour récolter SMM18 PSC-CMs, laver la vaisselle deux fois avec du PBS, appliquer 1 mL de rTrypsine et incuber 3 min à 37 °C.
    3. Recueillir des cellules dans 9 mL de 10% fbs milieu, suspendre, et compter les cellules. Plaquer les cellules à 50 000-100 000 cellules dans un puits d’une plaque de 24 puits ou 250 000 à 500 000 cellules dans une boîte d’imagerie de 35 mm.
    4. Centrifuger un nombre suffisant de cellules (300 x g, 3 min) et ressusciter les cellules avec SFD complet complété avec FBS (concentration finale à 10%).
    5. Incuber pendant la nuit et changer le milieu de culture pour compléter sfd avec la puromycine.
    6. À partir du jour 14, changez le milieu de culture deux à trois fois par semaine avec sfd complet jusqu’au jour 21-28, quand Myom2-RFP devient important. Pour la transduction à base d’AAV de protéines sarcomères marquées par fluorescence, veuillez vous référer à l’étape 3.

2. Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines

  1. Préparation des milieux de différenciation
    1. RPMI+B27-Ins : mélanger 500 mL de milieu RPMI 1640, 10 mL de B27 moins insuline et 5,25 mL de L-alanine-L-glutamine.
    2. RPMI+B27+Ins : mélanger 500 mL de RPMI, 10 mL de supplément de B27 et 5,25 mL de L-alanine-L-glutamine.
  2. Entretien des cellules iPS humaines
    1. Passage des cellules iPS humaines deux fois par semaine avec AK02N sur LN511-E8 suivant la méthode précédemment publiée avec quelques modifications21.
    2. Récoltez les cellules avec un traitement de 3 minutes de rTrypsine et collectez-les dans un milieu FBS à 10%. Compter les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Ensemencez 75 000 à 125 000 cellules dans un puits de 6 plaques de puits avec 2 mL d’AK02N complétés par LN511-E8 et Y27632à la concentration finale de 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2) et 10 μM, respectivement.
    3. Incuber à 37 °C et 5 % deCO2 et remplacer le milieu le lendemain par 2 mL d’AK02N sans aucun supplément. Changez de média tous les deux ou trois jours et passez tous les trois ou quatre jours.
  3. Jour -4: replaque avant la différenciation
    1. Enrober une plaque de 6 puits avec 0,5 μg/cm2 de LN511-E8 dilué dans du PBS. Ensuite, incuber pendant au moins 30 min à 37 °C et 5 % deCO2 ou 1 h à température ambiante. Solution de revêtement aspirée juste avant l’ensemencement des cellules.
    2. Récoltez des cellules iPS humaines avec de la rTrypsine et comptez les cellules comme à l’étape 2.2.2.
    3. Centrifuger 1,25 x10 5 cellules pour un puits d’une plaque à 6 puits à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et remise en suspension dans 2 mL d’AK02N complété par LN511-E8 (concentration finale 0,5 μg/mL ou 0,1 μg/cm2) et Y27632 (concentration finale 10 μM) par puits.
    4. Aspirer la solution d’enrobage, remettre les graines en suspension dans la plaque enrobée et incuber à 37 °C et 5 % deCO2.
  4. Jours -3 et -1: remplacer le milieu par 2 mL d’AK02N.
  5. Jour 0 : Remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27-Ins complétés par CHIR99021 (concentration finale de 6 μM) par puits pour commencer la différenciation.
  6. Jour 2 : Remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27-Ins par WntC59 (concentration finale de 2 μM) par puits.
  7. Jour 4: Remplacez le milieu par 2 mL de RPMI + B27-Ins par puits.
  8. Jour 7 et jour 9 : remplacer le milieu par 2 mL de RPMI+B27+Ins par de la puromycine (concentration finale de 10 μg/mL) par puits pour culture sélective de PSC-GC.
    REMARQUE: La lignée ACTN2-mCherry, utilisée dans cette étude, a une cassette de site d’entrée ribosomique interne (IRES), un gène résistant à la puromycine inséré dans la région 3′-non traduite (UTR) du locus TNNT2, et mCherry remplaçant le codon stop d’ACTN2. Pour purifier les cardiomyocytes sans knock-in, veuillez vous référer aux étapes 3 et 4.
  9. Jour 10: replate pour de futures expériences
    1. Enrober une parabole d’imagerie de 35 mm d’une lamelle en polymère avec 0,5-1 μg/cm2 de LN511-E8 dilué dans de la gélatine à 0,1 %. Incuber 2-4 h à température ambiante pour la viabilité à long terme. Pour culture PSC-CMs dans les modèles souhaités, reportez-vous aux étapes 4 et 5 pour préparer les timbres PDMS.
    2. Pour récolter des PSC-MC humains, laver la vaisselle deux fois avec du PBS, appliquer 1 mL de rTrypsine par puits et incuber 3 min à 37 °C.
    3. Recueillir des cellules dans 4 mL de 10% fbs milieu, suspendre, et compter les cellules. Plaque 250 000-500 000 cellules par parabole d’imagerie de 35 mm.
    4. Centrifuger un nombre suffisant de cellules à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, les ressusciter avec RPMI+B27+Ins avec de la puromycine (10 μg/mL) et plaquer sur la boîte d’imagerie de 35 mm enrobée.
    5. Incuber pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez le milieu de culture par rpmi+B27+Ins par de la puromycine (10 μg/mL).
    6. À partir du jour 14, changez de milieu de culture 2 à 3 fois par semaine avec RPMI+B27+Ins jusqu’au jour 21-28 pour l’imagerie. Pour la transduction à base d’AAV de protéines sarcomères marquées par fluorescence, veuillez vous référer à l’étape 3.

3. Étiquetage fluorescent des sarcomères à l’aide de virus adéno-associés

  1. Préparation avant la production d’AAV
    1. Maintenir les cellules HEK293T dans le DMEM complété avec fbs (concentration finale 10%) sur une plaque de culture de tissu de 10 cm. Cellules de passage trois fois par semaine.
    2. Préparer la polyéthylénimine (Î.-P.-É.) à 1 mg/mL. Mélanger 50 mg de polyéthylénimine MAX 40000 et 40 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 7,0 en utilisant 1 N NaOH. Ensuite, faites le volume final à 50 mL avec de l’eau ultrapure et filtrez à travers une passoire de 0,22 μm.
    3. Préparer un vecteur navette avec un gène de coloration sarcomère (p. ex. TCAP ou PDLIM3 fusionné avec une protéine fluorescente verte [GFP]), entraîné par un promoteur spécifique aux cardiomyocytes, tel que la troponine cardiaque T (cTNT)22.
      REMARQUE: Pour cette instance, nous avons utilisé GFP amélioré monomère avec des mutations de V163A, S202T, L221V23.
  2. Jour 0, passage des cellules HEK
    1. Lorsque les cellules atteignent la confluence, passagez 2,0 x 107 cellules HEK293T vers une plaque de culture tissulaire de 15 cm avec 20 mL de DMEM avec 10% FBS.
  3. Jour 1, transfection
    1. Mélanger 13,5 μg du vecteur navette, 26 μg de pHelper (un vecteur codant E2A, E4 et VA de l’adénovirus), 16,5 μg de pRC6 (un vecteur codant les gènes AAV2 Rep et AAV6 Cap) et 1 mL de DMEM sans pyruvate de sodium (DMEM-Pyr).
    2. Mélanger 224 μL d’Î.-P.-É. (1 mg/mL, préparé à l’étape 3.1.2) et 776 μL de DMEM-Pyr.
    3. Mélanger et incuber la solution plasmidique et la solution PEI à température ambiante pendant 30 min.
    4. Ajouter la solution plasmidique/PEI aux cellules HEK293T préparées à l’étape 3.2.
  4. Jour 2, changement moyen
    1. À 24 h après la transfection, changer de milieu en DMEM-Pyr. Cellules de culture jusqu’à la récolte de l’AAV le jour 7. L’AAV sera diffusée dans les médias culturels.
  5. Jour 7, collecte de l’AAV, concentration et substitution de tampons à l’aide de la méthode de purification minimale24
    1. Incuber une unité d’ultrafiltration centrifuge (seuil de poids moléculaire de 100 k [MWCO]) avec 5 mL de BSA à 1 % dans du PBS à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, centrifuger l’unité d’ultrafiltration à 500 x g pendant 2 min et aspirer à la fois les solutions filtrées et restantes.
    2. Transférer le milieu de la parabole de 15 cm qui a produit l’AAV vers un nouveau tube conique et une nouvelle centrifugeuse de 50 ml (500 x g, 5 min). Filtrer le surnageant à travers une passoire de seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires et appliquer une suspension sur l’unité d’ultrafiltration.
    3. Centrifuger à 2000 x g pendant 90 min ou jusqu’à la concentration du surnageant de culture de 0,5 à 1 mL.
    4. Aspirer le filtrat et appliquer 15 mL de PBS sur l’unité d’ultrafiltration.
    5. Répéter la centrifugation jusqu’à ce que le concentré devienne de 0,5 à 1 mL.
    6. Répéter les 3.5.4 et 3.5.5.
    7. Transférer l’AAV concentré dans un nouveau tube de 1,5 mL et le conserver à 4 °C ou -20 °C.
      REMARQUE: AAV peut être utilisé dans les installations P1, mais suivre les règles et règlements locaux. L’AAV peut également être produit par des méthodes conventionnelles.
  6. Calcul du titre AAV
    1. Mélanger 5 μL d’AAV, 195 μL de DMEM-Pyr et 10 U de benzonase et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    2. Ajouter 200 μL de tampon protéinase K (0,02 M Tris HCl et 1 % SDS) et 5 μL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    3. Préparer soigneusement 400 μL d’une solution de phénol/chloroforme/alcool isoamylique à 25:24:1, vortex pendant 1 min et centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min.
    4. Transférer 200 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL, qui produira environ la moitié des génomes originaux de l’AAV.
    5. Ajouter 1 μL de glycogène (20 mg/mL) à 20 μL de 3 MCH3COONa (pH 5,2) et de vortex. Ajouter à nouveau 250 μL de 2-Propanol à 100 μL d’éthanol à 100 % et de vortex.
    6. Incuber à -80 °C pendant 15 min. Centrifuger ensuite à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
    7. Aspirez le surnageant et ajoutez 70% d’éthanol au tube. Ensuite, centrifuger à 20 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
    8. Aspirez le surnageant et séchez à l’air jusqu’à ce que le culot devienne clair.
    9. Ajouter 200 μL d’acide tris-éthylènediaminetétraacétique (TE; pH 8,0) pour résoudre les génomes de l’AAV. Ensuite, diluez l’échantillon 100 fois avec TE.
    10. Préparer une norme avec pAAV-CMV-Vector à 6,5 ng/μL avec TE pour obtenir 109 génomes vectoriels (vg)/μL. Ensuite, faire une série de dilution 10 fois de 104 à 108 avec TE.
    11. Mélanger 1 μL d’ADN d’échantillon (ou les étalons), 0,4 μL d’amorces (5 μM), 3,6 μL d’eau distillée et 5 μL de mélange maître SYBR Green. Les amorces, situées sur ITR, sont 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ et 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Effectuer une PCR en temps réel à la condition suivante: Dénaturement initial à 95 °C pendant 60 s, 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, et recuit et extension à 60 °C pendant 30 s, suivis d’une courbe de fusion.
    13. Sur la base des normes et des valeurs Ct, une machine PCR en temps réel fournit le numéro de copie du génome vectoriel dans 1 μL d’un échantillon. Calculer le titre original de l’AAV à l’aide de l’équation suivante : un nombre de copies fourni par PCR en temps réel (vg/μL) x 8 x 103 x 2, dans lequel 8 x 103 comme facteur de dilution pendant l’isolement du génome de l’AAV, et 2 comme facteur de différence de l’AAV (simple brin) et du plasmide (double brin).
  7. Transduction aux GC-PSC
    1. Comptez psc-CMs dans un puits supplémentaire ou un plat supplémentaire.
    2. Diluer les AAV (1 x 104 à 1 x 106 vg/cellule) pour obtenir 50 μL avec du PBS. Appliquer des VQA à la multiplicité d’infection (MOI) de 1 x 10 4 à1 x 106 vg/cellule aux GC-PSC et aux GC-GC de culture pendant 3 jours avec AAV dans le milieu de différenciation correspondant pour la souris et les GC-GC-PSC humains, puis changer le milieu en milieu de culture sans VAA.
    3. Utilisez PSC-CMs pour l’imagerie à cellules vivantes après 7 jours ou plus après la transduction.

4. Purification [facultative] basée sur l’AAV des GC-PSC

  1. Préparation de l’AAV
    1. Préparer l’AAV comme décrit à l’étape 3 à l’aide d’un vecteur navette exprimant un gène résistant à la blasticidine sous le contrôle du promoteur cTNT.
  2. Transduction en cellules iPS différenciantes
    1. Différenciez les cellules iPS humaines pendant 4 jours en suivant le protocole décrit à l’étape 2 et comptez le nombre de cellules dans un puits supplémentaire.
    2. Après avoir changé de support au jour 4, appliquez des AAV au MOI de 1 x 105 vg/cellule pour différencier les PSC dans les supports RPMI+B27-Ins.
    3. Au jour 7, rafraîchissez le milieu avec RPMI+B27+Ins et ajoutez 2,5 à 10 μg/mL de blasticidine.
    4. Au jour 10, psc-CMs sont prêts à replate.

5. Préparation des timbres PDMS

  1. Concevez le modèle d’appareil de bandes de 200 μm ainsi que des rainures de 10 à 25 μm entre les bandes à l’aide d’un logiciel de dessin de conception assistée par ordinateur (CAO).
  2. Dessinez le motif des appareils sur un photomasque au chrome recouvert d’AZP1350 à l’aide de la lumière UV d’un outil de lithographie sans masque.
  3. Développer le motif sur le photomasque dans une série de révélateurs de photorésine positifs (p. ex. chrome etchant) et rincer à l’eau DI.
  4. Déshydrater une plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 120 °C pendant 15 min.
  5. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante et faire tourner une photorésine négative SU-8 3010 pour faire une hauteur de 10-20 μm avec 1500 rpm pendant 30 s à l’aide d’un spin-coater.
  6. Cuire doucement la plaquette en deux étapes sur une plaque chauffante selon le protocole du fabricant.
  7. Une fois la plaquette refroidie à température ambiante, chargez la plaquette sur l’aligneur de masque.
  8. Utilisez un aligneur de masque pour aligner le masque sur la plaquette et exposer la plaquette à la lumière UV.
  9. Effectuer la cuisson post-exposition à la plaquette en deux étapes sur une plaque chauffante conformément au protocole du fabricant.
  10. Développez la plaquette dans une série de développeur SU-8 et de 2-Propanol, puis séchez la plaquette avec un flux d’azote.
  11. Transférer la plaquette dans une boîte de Pétri d’une taille appropriée.
  12. Mélanger l’élastomère PDMS et son agent de durcissement dans un rapport de 10:1 p/p et verser le mélange dans la boîte de Pétri.
  13. Dégazer le PDMS dans un dessicateur jusqu’à ce que toutes les bulles d’air disparaissent, puis durcir le PDMS sur plaque chauffante à 80 °C pendant 2 h.
  14. Décollez le PDMS durci du moule maître à l’aide d’une pince à épiler, puis découpez la partie avec le dessin pour être un tampon PDMS.
    Remarque : la forme peut être carrée, toutefois, une forme octogonale transfère le motif mieux sur le bord.

6. Culture à motifs de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes

  1. Enlever la poussière de la surface des timbres PDMS à l’aide de ruban adhésif.
  2. Submergez les timbres dans de l’éthanol à 70% pour les stériliser. Ensuite, soufflez l’éthanol de la surface des timbres à l’aide d’un duster à air.
  3. Appliquer 5 à 10 μL de polymère/éthanol à 0,5 % en poids de 2-méthacryloyloxyéthyl phosphorylcholine (MPC) sur la surface des estampes PDMS.
    REMARQUE: La distribution inégale du polymère MPC peut provoquer un modèle perturbé.
  4. Incuber 10-30 min jusqu’à ce que le polymère MPC soit complètement séché.
  5. Placez les timbres en contact avec les lamelles d’une plaque de culture à fond de verre ou d’une parabole d’imagerie de 35 mm avec une lamelle en polymère et mettez un poids (p. ex. une batterie AAA) sur l’estampille pendant 10 min.
  6. Retirez le poids et les timbres. Ensuite, confirmez que le motif a été transféré au microscope.
    REMARQUE: Les assiettes / plats estampillés peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine à température ambiante.
  7. Lavez les puits/plats estampillés avec du PBS deux fois.
  8. Diluer LN511-E8 avec du PBS à 2-4 μg/mL et enduire la parabole avec LN511-E8 à 0,5-1 μg/cm2. Pour les PSC-CMs humains, diluer LN511-E8 avec une solution de gélatine à 0,1% au lieu de PBS. Ensuite, incuber pendant au moins 1 h (de manière optimale, plus de 4 h).
  9. Cellules de plaque comme décrit dans les sections précédentes.

7. Imagerie en accéléré des sarcomères au microscope fluorescent

  1. Allumez et connectez le microscope, l’ordinateur associé et tous les périphériques requis.
  2. Pour effectuer une imagerie time-lapse, capturez des images time-lapse avec le grossissement le plus élevé (objectif 100X avec émersion d’huile).
  3. Sélectionnez les conditions d’imagerie en direct. Pour obtenir de bonnes données représentatives, essayez de vous ajuster à la fréquence d’images la plus élevée (un minimum de 20 ms ou 50 images par seconde est recommandé). Réglez l’obturateur ouvert et appliquez un binning nécessaire (4 X 4) et un recadrage de la zone d’acquisition pour obtenir les intervalles les plus courts entre les images pendant l’imagerie time-lapse.
    REMARQUE: Le réglage peut varier en fonction des configurations des microscopes. La caméra doit être haute sensibilité et est capable de transférer les données vers le PC connecté assez rapidement. À cette fin, nous avons utilisé le flash ORCA avec Camera-link. Nous avons testé une microscopie confocale tournante et avons acquis des images à 400 images par seconde.
    1. [Facultatif] Si le taux de battement des cellules est faible, évoquez les cellules par stimulation du champ électrique.
  4. Exécuter l’enregistrement time-lapse
    1. Assurez-vous que les champs images restent au point pendant l’enregistrement de l’image time-lapse.
    2. Enregistrez les images time-lapse dans un dossier approprié.

8. Analyse de l’imagerie time-lapse à l’aide de SarcOptiM, un plugin ImageJ / Fiji

  1. Chargez une série d’images time-lapse dans ImageJ. Pour le format Olympus VSI, ouvrez les fichiers via OlympusViewer Plugin.
  2. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour observer clairement le motif sarcomere (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste).
  3. Pour ouvrir SarcOptiM, cliquez sur le menu Autres outils (>>) et sélectionnez SarcOptiM.
  4. Calibrez le programme en appuyant sur Ctrl + Maj + P et le bouton 1 μm dans la barre d’outils et en suivant les instructions des boîtes de dialogue.
  5. Tracez une ligne à travers la région du sarcomere qui sera utilisée pour mesurer le raccourcissement du sarcomère.
  6. Démarrez l’analyse de raccourcissement sarcomere en appuyant sur SingleCell (AVI) dans la barre d’outils. Les données représentatives sont présentées à la figure 1 et à la figure 2.

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Résultats

Mesure du raccourcissement sarcomère à l’aide de lignes de rapporteur PSC-CMs knock-in. Des PSC-CMs sarcomere-marqués ont été utilisés pour mesurer le rapetissement sarcomere. Les lignes expriment Myom2-RFP et ACTN2-mCherry à partir de loci endogènes. TagRFP a été inséré dans Myom2, codant des protéines M qui se localisent à la ligne M, tandis que mCherry a été frappé à ACTN2, codant α-Actinine, qui se localise à la ligne Z18...

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Discussion

Psc-CMs ont un grand potentiel pour être utilisé comme une plate-forme in vitro pour modéliser les maladies cardiaques et pour tester les effets des médicaments. Néanmoins, il faut d’abord établir une méthode précise et unifiée d’évaluation des fonctions des GC-CFP. La plupart des tests fonctionnels fonctionnent avec PSC-CMs, par exemple, électrophysiologie, calcium transitoire, et métabolisme26, et l’une des premières études psc-cm patient-dérivées était au sujet du syndrome long-QT

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Déclarations de divulgation

H.U. a déposé un brevet lié à ce manuscrit.

Remerciements

Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire de la Division de médecine régénérative de l’Université médicale de Jichi pour la discussion utile et l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par les subventions de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED; JP18bm0704012 et JP20bm0804018), la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS; JP19KK0219), et la Japanese Circulation Society (la subvention pour la recherche fondamentale) à H.U.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-ThioglycérolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoéthanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
Polymère de 2-méthacryloyloxyéthylphosphorylcholine (MPC),NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
Antenne parabolique d’imagerie 35 mm avec lamelle en polymère (µ ;-Dish 35 mm, high)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vecteurs ; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.Nous avons inséré une casette résistante à IRES-puromycine à 3' UTR du locus TNNT2 et mCherry autour du codon stop d’ACTN2 dans la ligne hiPSC 610B1, en suivant une méthode décrite ailleurs (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), sans sérumThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, moins insulineThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), moins Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µ ; L)Merck Millipore70746
Chlorhydrate de blasticidine SFujifilm wako029-18701
BMP-4, Humain, Recombinant,R & D Systems, Inc.314-BP-010
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
Logiciel de dessin CAO,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
(100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etcantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JaponMasque au chrome N14B
recouvert de AZP1350Clean Surface Technology Co., JaponCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL de glycogène, 3 M d’acétate de sodium (pH 5,2))Takara9094
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) - glycémie élevéeSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) - glycémie élevée, sans pyruvate de sodiumSigma-AldrichD5796
Éthanol (99.5)Fujifilm wako057-00456
Sérum fœtal bovinMoregate59301104
FGF-10, Humain, Recombinant,R& D Systems, Inc.345-FG-025
Facteur de croissance des fibroblastes (basique), humain, recombinantFujifilm wako060-04543
Gélatine de peau de porcen poudre Sigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
PLAQUES DE CULTURE À FOND DE VERREMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham& rsquo ; s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Milieu Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (supplément GlutaMAX, 200 mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
Sel de sodium de l’acide L(+)-ascorbiqueFujifilmwako 196-01252
Fragment de laminine-511 E8 ( LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Aligneur de masqueUnion Optical Co., Ltd., JaponPEM-800
Outil de lithographie sans masqueNanoSystem Solutions, Inc., JaponD-Light DL-1000
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0,45 & micro ; m, PVDF (0,45-µ ; m filtre)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Développé dans notre article précédent (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 Caméra numérique CMOSHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Boîte de PétriSansei medical co. Ltd01-004
Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS)Dow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polyéthylénimine MAX (MW. 40 000)Polyscience24765-1
Développeur photosensible positifTokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., JaponNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Protéinase KTakara9034
Chlorhydrate de puromycineFujifilm wako166-23153
Recombinant Humain/Souris/Rat Activine A Protéine R& D Systems, Inc.338-AC-050
Protéase recombinante de type trypsine (rTrypsine ; ThermoFisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Plaquette de siliciumMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JaponN.A.
Pyruvate de sodium (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
Spin-coaterMikasa Co., Ltd., JaponMS-A100
Microscopie confocale spininngOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, souris, recombinant, solution (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 développeurKayaku Advanced Materials, Inc., MA, États-UnisSU-8 développeur
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-A165 (VEGF), humain, recombinantFujifilm wako226-01781
Unité d’ultrafiltration centrifuge

Références

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